2022, Vol. 62
表1(Table 1)
鳖源铜绿假单胞菌的分离鉴定及多位点序列与全基因组分析
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20210694
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 何宏港, 吴悠, 刘乃瑜, 王至诚, 刘静霞, 罗毅. 2022
- HE Honggang, WU You, LIU Naiyu, WANG Zhicheng, LIU Jingxia, LUO Yi.
- 鳖源铜绿假单胞菌的分离鉴定及多位点序列与全基因组分析
- Identification, multilocus sequence typing and whole-genome analysis of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from diseased Trionyx sinensis
- 微生物学报, 62(7): 2751-2767
- Acta Microbiologica Sinica, 62(7): 2751-2767
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文章历史
- 收稿日期：2021-11-12
- 修回日期：2022-02-10
- 网络出版日期：2022-02-25
引用本文 |
何宏港, 吴悠, 刘乃瑜, 王至诚, 刘静霞, 罗毅. 鳖源铜绿假单胞菌的分离鉴定及多位点序列与全基因组分析[J]. 微生物学报, 2022, 62(7): 2751-2767.
He Honggang, Wu You, Liu Naiyu, Wang Zhicheng, Liu Jingxia, Luo Yi. Identification, multilocus sequence typing and whole-genome analysis of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from diseased Trionyx sinensis[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(7): 2751-2767.
鳖源铜绿假单胞菌的分离鉴定及多位点序列与全基因组分析
1. 华中农业大学水产学院, 农业农村部淡水生物繁育重点实验室/农业动物遗传育种与繁育教育部重点实验室, 湖北 武汉 430070;
2. 农业微生物学国家重点实验室, 华中农业大学, 湖北 武汉 430070
2. 农业微生物学国家重点实验室, 华中农业大学, 湖北 武汉 430070
摘要：[目的] 查明引起湖北仙桃某中华鳖养殖场中华鳖发病死亡的病原及其特征。[方法] 本研究分离患病中华鳖的病原，并结合形态特征、生理生化试验、16S rRNA基因鉴定，鉴定分离菌株；通过人工回归感染试验、药敏试验、全基因组测序与分析对分离菌株的致病性和耐药性进行研究；通过多位点序列分型(multilocus sequence type，MLST)分析，对分离菌株的流行情况进行探究。[结果] 从患病中华鳖肝脏等部分分离到3株优势菌株HX8、FG10和GC20，16S rRNA基因同源性和生化特征分析鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。回归感染试验证实该菌株是引起本次中华鳖患病的病原菌。3株分离株的药敏实验结果基本一致，均对诺氟沙星、恩诺沙星等8种抗生素敏感，对氟苯尼考、多西环素、磺胺异恶唑等6种抗生素耐药。MLST鉴定表明，3株分离株均属于序列型(sequence type，ST)252型，eBURST分析进一步显示ST252型与一些ST共同构成了克隆复合体(clonal complexes，CC) CC252，且ST252是CC252的原始序列型(founder ST)。全基因组测序结果显示，FG10的全基因组大小为5.65 Mb，GC含量为65.3%，共预测到5 956个编码序列(CDS)，GenBank登录号为JAJGXC000000000。通过与毒力因子数据库(the virulence factor database，VFDB)比对，预测到873个毒力相关因子，主要与黏附、分泌系统以及毒素等相关。通过与耐药基因数据库(the comprehensive antibiotic resistance database，CARD)比对，结果显示FG10中含有喹诺酮类、碳青霉烯类、肽类等抗生素的耐药相关基因。[结论] 本研究分离获得了中华鳖的病原细菌铜绿假单胞菌，MLST分析推测了其流行情况，基因组数据揭示了其毒力及耐药基因，为防控水产养殖中铜绿假单胞菌感染提供了一定的参考依据。
关键词：中华鳖 铜绿假单胞菌 分离鉴定 多位点序列分型 全基因组 毒力及耐药
Identification, multilocus sequence typing and whole-genome analysis of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from diseased Trionyx sinensis
1. Key Laboratory of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Ministry of Education, College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China;
2. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China
2. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China
Abstract: [Objective] This study aims to determine and characterize the pathogen of the diseased Trionyx sinensis in a farm in Xiantao, Hubei Province. [Methods] The suspicious pathogenic bacteria were isolated from the diseased T.sinensis and identified based on the morphological, physiological, and biochemical characteristics and the phylogenetic tree constructed with the 16S rRNA gene sequence. The artificial infection tests, drug sensitivity tests, multilocus sequence typing (MLST), eBURST analysis, and whole-genome sequencing were then carried out for the isolates. [Results] Three predominant strains, HX8, FG10, and GC20, were isolated from the diseased T.sinensis and all identified as Pseudomonas aeruginosa. Artificial infection tests confirmed that the isolates were the pathogen causing the disease of T.sinensis. Drug sensitivity tests demonstrated that the three isolates were sensitive to eight antibiotics (such as enrofloxacin and norfloxacin) and resistant to six antibiotics (such as florfenicol, doxycycline, and sulfagan). According to the results of MLST, the three isolates all belonged to sequence type 252 (ST252). The further eBURST analysis showed that ST252 formed a clonal complex CC252, of which ST252 was the founder ST. The whole genome of strain FG10 had a size of 5.65 Mb, the average G+C content of 65.3%, and 5 956 coding sequences. The whole genome has been deposited at GenBank under the accession number JAJGXC000000000. In comparison with the virulence factor database (VFDB), 873 virulence-related genes were predicted, which were mainly associated with adhesion, secretion systems, and toxin. In comparison with the comprehensive antibiotic resistance database (CARD), some drug (such as fluoroquinolone, carbapenem, and peptide) resistance related-genes were predicted. [Conclusion] We isolated and identified the pathogens of the diseased T.sinensis and preliminarily analyzed the prevalence and predicted the genes related to the virulence and drug resistance of P.aeruginosa, which provided a basis for the prevention and control of infections caused by P.aeruginosa in aquaculture.
Keywords:
Trionyx sinensis Pseudomonas aeruginosa isolation and identification multilocus sequence typing whole genome virulence and drug resistance
中华鳖(Trionyx sinensis)又名甲鱼，隶属于爬行纲(Reptilia)龟鳖目(Tesudines)鳖科(Trionychidae)动物，是我国珍贵淡水名特优水产养殖动物之一，主要分布于我国的长江、黄河流域和华南地区，尤在湖北、湖南、江西、安徽、江苏等省产量较高[1]。近年来，由于高密度集约化养殖导致中华鳖多种病原性疾病大量暴发[2]。目前已知鳖的病原菌有很多种，有研究表明嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)可导致中华鳖患红脖子病、红底板、出血性肠道坏死、疖疮、腐皮病等[3]，费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)会导致中华鳖患败血症[4]，其他报道的病原菌还包括爱德华氏菌(Edwardsiella)[5]、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)等[6]。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的条件致病菌，属于好氧革兰氏阴性菌，在自然界分布广泛，是土壤中最常见的细菌之一，也存在于水、空气、人的皮肤、呼吸道和肠道等，当机体体表受损或者抵抗力下降时，会侵染机体[7]。铜绿假单胞菌可引起人群严重的感染，是医院病人发生感染的第三大致病菌[8]。畜牧家禽中的猪、牛、羊、马、犬、兔、鸡等体内均可分离出该菌，在实验动物中也有发现[9]。国内已报道从患病的猪[10]、奶牛[11]、水貂[12]的病灶中分离出了铜绿假单胞菌，可见该菌已成为威胁畜禽业发展的重要病原之一。但该菌在水产养殖上并不常见，仅有感染石龟[13] (Mauremys japonica)、广西拟黄喉水龟[14] (Mauremys guangxiensis)的报道。
多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，这种方法通过PCR扩增多个管家基因片段并测定其序列，分析菌株的变异情况[15]。截至目前，铜绿假单胞菌MLST数据库已经收录了22 806条序列，等位基因谱MLST序列3 655条，菌株信息7 714个(https://pubmlst.org/organisms/pseudomonas-aeruginosa)。
2019年10月，在湖北省仙桃市某中华鳖养殖场，一些中华鳖个体发生严重感染并死亡。为探究引起此次中华鳖感染发病的病原，我们从患病中华鳖肝脏、肠道及血液样本中分离获得3株优势菌，通过形态学观察、生理生化反应、16S rRNA基因鉴定等方法，发现3株菌株均为铜绿假单胞菌，并进一步对该菌株的致病力、耐药特征及MLST分型进行了鉴定，最后对其全基因组进行了测定、并对其毒力以及耐药基因进行了分析。本研究旨在为中华鳖疾病的有效防治、及对中华鳖源铜绿假单胞菌的深入研究提供参考和依据。
1 材料与方法 1.1 患病个体解剖与细菌分离纯化患病中华鳖于2019年10月取自湖北仙桃某中华鳖养殖场。在无菌环境下，用酒精擦拭体表后，对中华鳖进行剖检，记录病变情况。取肝脏等样品磨成匀浆后，进行梯度稀释，每个梯度取100 μL，用涂布器均匀涂在LB固体培养基上，于28 ℃恒温培养48 h。挑选优势菌落移接于LB琼脂平板上保存供检验用。
1.2 生理生化鉴定取待检测菌落于生理盐水中，制备成0.5麦氏浊度(McFa-rland，约108 CFU/mL)的菌悬液，取100 μL菌悬液加至肠杆菌科细菌生化鉴定管(购自杭州微生物试剂有限公司)中，封口。按说明书进行操作，参考说明书对结果的阳性和阴性进行分类。
1.3 分离株的分子鉴定利用碱裂解法提取细菌总DNA，所用引物和反应体系参照Clarridge方法扩增分离株16S rRNA基因[16]。PCR产物送武汉擎科生物技术有限公司测序，将序列上传至BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行比对分析，利用MEGA X软件对序列进行遗传进化树的构建。
1.4 人工感染实验实验用中华鳖购自湖北仙桃一中华鳖养殖场，为2年龄健康中华鳖，体重在1 000 g左右，暂养一周。将3株分离株接种于普通固体培养基，28 ℃培养12 h。用无菌生理盐水将分离株配制成浓度为1.0×106 CFU/mL的菌悬液。将所选中华鳖随机分为1个对照组和3个实验组，每组10只，实验组经腹腔注射200 μL的菌液，对照组注射200 μL无菌生理盐水，于隔离的养殖缸中养殖。每12 h观察并记录中华鳖的活动与死亡情况，连续观察7 d，并用Graphpad prism 8.0.2软件绘制生存曲线。
1.5 细菌耐药性实验采用常规琼脂扩散(K-B)法对分离株进行14种抗菌药物敏感性测定，依据CLSI药敏试验标准鉴定手册[17]，以抑菌圈直径大小作为敏感与耐药的判定指标[18]。药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司。
1.6 多位点序列分型根据PubMLST数据库(https://pubmlst.org/organisms/pseudomonas)，选择7个管家基因(ascA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE)针对铜绿假单胞菌进行多位点序列分型。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃最终延伸10 min，结果采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并送武汉擎科生物科技有限公司测序。利用eBURST v.3 (http://eburst.mlst.net)预测不同序列型(sequence type，ST)之间的关系。
1.7 全基因组测序及分析将菌株挑取单菌落接种到100 mL液体LB培养基中，经28 ℃摇床培养至对数生长期，离心收集菌体，将菌体送至武汉菲沙基因信息有限公司，由公司进行DNA提取，采用Illumina高通量测序平台进行测序。测序结果组装后，利用COG数据库对菌株全基因组进行基因功能注释。通过与毒力因子数据库VFDB (http://www.mgc.ac.cn/VFs/)进行比对获得菌株毒力基因的注释结果[19]；利用抗性基因数据库CARD (http://arpcard.Mcmaster.ca，Version 1.1.3)对菌株耐药基因进行预测[20]。
2 结果与分析 2.1 患病鳖的病症所检患病中华鳖为3年龄成年鳖，体重1 600 g左右。鳖患病表现为：发病前期食欲下降、不进食，随后出现了体表出血、背部唇边腐烂(图 1A)，偶伴有便血现象(图 1B)，解剖后发现患病鳖腹腔有出血和大量腹水(图 1C)，肝脏脂肪化和肿大，有些肝脏伴有发黑症状(图 1D)。
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| 图 1 濒死甲鱼的病症 Figure 1 The clinical signs of moribund T. sinensis. A: rotten back shell; B: ulcerated pores on the back shell, excreted blood clot; C: haemorrhage and ascites in the abdominal cavity; D: liver steatosis and tumefaction. |
组织切片结果显示：与健康中华鳖相比，患病的中华鳖肝脏中有红细胞渗出和铁血黄素沉积，肠道中绒毛膜出血并有脱落现象，表明患病的中华鳖肝脏和肠道出现了病变(图 2)。
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| 图 2 中华鳖组织病理切片 Figure 2 Histopathological section of soft-shelled turtle. A, B, C are slices of liver, while D, E, and F are slices of intestinal. A, D are healthy samples, while B, C, E, F are infection samples.a: erythrocyte effusion; b: hemosiderin deposition; c: shedding of intestinal chorionic membrane; d: chorionic hemorrhage. |
2.2 致病菌的分离及形态特征
从患病中华鳖的肝脏等样本中均分离到形态特征一致的优势菌。培养48 h观察，其菌落特征为扁平、湿润，呈亮绿色；扫描电镜观察发现，其菌体呈短杆状(图 3)。将分离获得的3株优势菌株进行纯化，分别命名为HX8、FG10和GC20。
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| 图 3 菌株FG10扫描电镜观察 Figure 3 SEM observation results of strain FG10. |
2.3 分离株的鉴定 2.3.1 生理生化鉴定
生化鉴定结果显示，所分离菌株与分离自林麝的铜绿假单胞菌SP-N[21]以及分离自雏鸡的铜绿假单胞菌菌株[22]生化特性基本一致(表 1)。
表 1. 分离株的生理生化特性
Table 1. Physiological and biochemical characteristics of strain HX8, FG10 and GC20
| Biochemical project | HX8 | FG10 | GC20 | SP-N[21] | HQ041011[22] |
| Glucose | – | – | – | – | + |
| Citrate utilization | + | + | + | + | + |
| Arginine double hydrolysis | + | + | + | * | + |
| Maltose | – | – | – | – | – |
| Semi-solid agar (motility) | + | + | + | * | + |
| DNA enzyme | + | + | + | * | + |
| Acetamide | + | + | + | + | + |
| Carbamide | + | + | + | + | + |
| Mannitol | + | + | – | * | – |
| Glucose (gas) | – | – | – | * | – |
| Lysine | – | – | – | * | * |
| Ornithine | + | + | + | * | * |
| Raffinose | – | – | – | * | – |
| Sorbitol | – | – | – | * | – |
| Peptone water | – | – | – | – | * |
| H2S (gas) | – | – | – | – | – |
| Glucoside | – | – | – | * | * |
| +: positive; –: negative; *: no determination. | |||||
2.3.2 16S rRNA同源性分析
对3个分离株的16S rRNA基因片段进行扩增，获得了约1 500 bp的目标条带，将测序结果分别上传到NCBI获取登录号，BLAST比对结果发现：3株分离株与铜绿假单胞菌PAO1 (GenBank：MT772097)的16S rRNA基因的序列一致性为99.7%–99.9%。进一步构建细菌16S rRNA基因系统发育树，结果显示：菌株HX8、FG10、GC20同属一个分支，且在铜绿假单胞菌所在分支中(图 4)。以上结果表明：3株分离株均为铜绿假单胞菌。
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| 图 4 基于16S rRNA基因序列的N-J系统发育树 Figure 4 Neighbor-joining (N-J) tree based on the comparison of 16S rRNA gene sequences of Pseudomonas spp. GenBank accession numbers are given in parentheses. Genetic distances were constructed using p-distance model. Horizontal bar, genetic distance of 0.01. |
2.4 分离株对中华鳖的人工回归感染
将3株分离株分别腹腔注射感染健康中华鳖。实验组中华鳖感染后前2天均未出现死亡，第3天均死亡1只，在第5天每组死亡2只，7 d内全部死亡；对照组在7 d内均无死亡(图 5)。死亡个体表现出唇边腐烂、腹部积水、肠道充血、肝脏发黑等症状，与自然发病个体病症相似。从实验组死亡中华鳖的肝脏均能分离到与攻毒菌株形态一致的菌落，对其进行16S rRNA基因鉴定，结果显示均为对应的攻毒菌株。以上回归感染数据表明：3株分离株是导致此次中华鳖死亡的主要病原菌。
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| 图 5 3株铜绿假单胞菌对中华鳖的致病力 Figure 5 Pathogenicity of three P. aeruginosa isolates to T. sinensis. |
2.5 分离株的药敏性
依据CLSI药敏试验标准鉴定手册[18]及《中华人民共和国兽药典》[23]中予以公布的水产用药物，对3株分离菌株进行了药敏实验。结果显示：3株分离株均对哌拉西林-他唑巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、美罗培南、左氧氟沙星、诺氟沙星敏感，而对多西环素、氟苯尼考以及磺胺异唑耐受(表 2)。
表 2. 3株分离菌株药敏实验结果
Table 2. Drug sensitivity test results of 3 isolates
| Antimicrobial class | Antimicrobial agent | Disk content/μg | Zone diameter/mm (phenotype) | Zone diameter (mm) interpretive criteria | |||||
| HX8 | FG10 | GC20 | S | I | R | ||||
| Penicillins and β-lactam/β-lactamase inhibitor combination | Piperacillin-tazobactam | 100/10 | 26 S | 26 S | 28 S | ≥21 | 15–20 | ≤14 | |
| Cephems | Cefepime | 30 | 30 S | 30 S | 31 S | ≥18 | 15–17 | ≤14 | |
| Cefotaxime | 30 | 26 S | 25 S | 25 S | ≥18 | 15–17 | ≤14 | ||
| Monobactams | Aztreonam | 30 | 18 I | 25 S | 27 S | ≥22 | 16–21 | ≤15 | |
| Carbapenems | Meropenem | 10 | 29 S | 35 S | 29 S | ≥19 | 16–18 | ≤15 | |
| Aminoglycosides | Gentamicin | 10 | 12 R | 14 I | 12 R | ≥15 | 13–14 | ≤12 | |
| Quinolones | Ciprofloxacin | 5 | 9 R | 6 R | 11 R | ≥21 | 16–20 | ≤15 | |
| Levofioxacin | 5 | 26 S | 30 S | 30 S | ≥17 | 14–16 | ≤13 | ||
| Antibiotics for aquatic products | Neomycin | 30 | 12 R | 12 R | 13 I | ≥17 | 13–16 | ≤12 | |
| Doxycycline | 30 | 9 R | 9 R | 11 R | ≥16 | 13–15 | ≤12 | ||
| Florfenicol | 30 | 6 R | 6 R | 6 R | ≥18 | 13–17 | ≤12 | ||
| Sulfagan | 300 | 6 R | 6 R | 6 R | ≥17 | 13–16 | ≤12 | ||
| Enrofloxacin | 5 | 22 S | 24 S | 23 S | ≥21 | 16–20 | ≤15 | ||
| Norfloxacin | 10 | 25 S | 25 S | 30 S | ≥17 | 13–16 | ≤12 | ||
| S: susceptible; I: intermediate; R: resistant. | |||||||||
2.6 分离株的MLST鉴定及eBURST分析
MLST鉴定结果显示，3株分离的铜绿假单胞菌序列型均为ST252型。在铜绿假单胞菌的MLST数据库中(https://pubmlst.org/organisms/pseudomonas)，共记录了33株ST252型铜绿假单胞菌菌株，其中分离自澳大利亚6株，法国5株，巴西4株，英国1株，分离自痰、支气管、感染的软组织等人(医)源环境。本研究首次从中国分离出铜绿假单胞菌ST252型菌株，并表明该型的分离株可以导致养殖中华鳖发生严重感染并死亡。
eBURST分析是一种根据序列型运算来分析发现菌株亲缘关系的一种生物信息学分析方法，它依据菌株的序列型将菌株分为不同的克隆谱系，进而研究菌株间的进化关系。从MLST数据库、已发表全基因组或文献中共获得铜绿假单胞菌分型菌株7 116个，分属3 515个ST型。
从分离地点来看，分离自法国的最多，有725个，澳大利亚其次，有712个。法国最流行的序列型是ST308型，共有94个分离株；澳大利亚最流行的序列型是ST274型，共有29个分离株。分离自中国的铜绿假单胞菌菌株有352株，分属于324个ST型，这些ST型参与形成了38个克隆复合体(clonal complexes，CC)，其中，CC277、CC235、CC1239、CC740、CC2370、CC3284、CC252是主要的克隆复合体。
从分离源来看，铜绿假单胞菌菌株主要是医源(人源)菌株，其次是从环境水体中分离的，主要分离源包括感染的软组织、感染的尿路、痰、血、支气管灌洗、水等，表明铜绿假单胞菌主要的流行区域是医院和环境水体。
eBURST分析显示，本研究分离的3株菌株所属的ST252型，其与分离自荷兰的ST489、澳大利亚的ST924与ST1107、法国、加拿大与澳大利亚的ST9、英国的ST118亲缘关系较近，构成了CC252；其中ST252是CC252的原始序列型(founder ST) (图 6)。
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| 图 6 利用eBURST对P. aeruginosa菌株进行归属谱系分析 Figure 6 The lineage classification of P. aeruginosa strains analyzed by eBURST. Each black dot represents a different sequence type, and the lines between the black dots form different clonal complexes (CC252, CC235, CC277, CC1239, CC2370, CC3284). The original sequence type is marked in red, and the original sequence type of the subgroup is marked in yellow. The red box indicates CC252 which ST252 belongs to in this study. |
2.7 铜绿假单胞菌FG10全基因组测序及注释
为进一步分析鳖源铜绿假单胞菌的全基因组特征，我们对菌株FG10进行了全基因组测序。对原始的测序片段(reads)进行序列组装，共得到125个重叠群(contigs)，基因组覆盖度为98.5%，FG10全基因序列总长度为5.65 Mb，GC含量为65.30%，共预测到5 956个基因。菌株FG10基因组上传到NCBI获得GenBank登录号为JAJGXC000000000。
COG数据库注释结果显示，菌株FG10共有4 292个基因获得注释，注释结果分属于24类(图 7)。其中，参与氨基酸转运和代谢的有394个、转录的有384个、参与无机离子转运和代谢的有270个、能量产生和转换的有272个。此外，有377个基因COG分类缺乏明显特征，功能尚不明确。
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| 图 7 菌株FG10的COG功能分类 Figure 7 Gene distribution based on COG classification of strain FG10. |
2.8 铜绿假单胞菌FG10的毒力基因分析
依据VFDB数据库，在FG10全基因组中共预测到873个毒力相关基因，分别与黏附、毒素、分泌系统、铁摄取系统和双组分系统等相关(表 3)。其中，155个基因与黏附(adherence)相关，如趋化基因ctpH (locus_tag：FG10620252_ 01334)、膜脂蛋白基因tpn32 (locus_tag：FG10620252_02040)、长链醇脱氢酶基因(locus_tag：FG10620252_04042)等。有113个基因参与分泌系统(secretion system)形成，FG10中存在Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅵ型分泌系统，其中有19个基因参与了Ⅲ型分泌系统的形成，转录激活子exsA (locus_tag：FG10620252_05848)负责调控Ⅲ型分泌系统所有基因的表达[24]；参与形成Ⅵ型分泌系统的基因有49个，其中，Ⅵ型分泌系统的分子伴侣蛋白基因clpV有3个拷贝(locus_tag：FG10620252_01258、05610、05796)，该基因参与蛋白质的新陈代谢过程，如细胞因子的代谢、蛋白质修饰、蛋白质代谢的正负调节和受体生物合成过程等，调节菌株的致病力[25]。与毒素(toxin)相关的基因有49个，其中包含4个拷贝的腺苷酸环化酶基因cya (locus_tag：FG10620252_05631、03346、02503、04963)，该基因编码的蛋白是参与碳水化合物和氨基酸代谢的重要蛋白质之一，同时对细菌的菌毛和鞭毛的表达有一定影响[26]。有52个基因与铁摄取系统(iron uptake system)相关，有研究表明，细菌毒力与细菌铁载体获得铁的能力有关，细菌获得铁的效率越高，毒力越高，致病性越高[27]。有21个基因与胁迫蛋白(stress protein)相关，其中包含有5个拷贝的clpC基因(locus_tag：FG10620252_02588、01840、04744、01198、01461)和2个拷贝的clpP基因(locus_tag：FG10620252_04783、05944)，这2个基因参与调节蛋白水解，以此来应激细菌生长、细胞分裂及分化、生物被膜形成和蛋白质分泌等基本过程[28]。
表 3. FG10的毒力基因预测分类统计表
Table 3. Virulence genes of P. aeruginosa strain FG10 predicted by VFDB
| Classification of virulence factors | Gene No. |
| Adherence | 155 |
| Secretion system | 113 |
| Toxin | 49 |
| Antiphagocytosis | 21 |
| Iron uptake system | 52 |
| Regulation | 38 |
| Two-component system | 19 |
| Genotoxin | 14 |
| Enzyme | 71 |
| Endotoxin | 19 |
| Stress protein | 21 |
| Invasion | 15 |
| Other | 286 |
2.9 铜绿假单胞菌FG10的耐药基因分析
为深入研究菌株FG10的耐药特征，对FG10的主要耐药基因进行了预测(表 4)。结果显示：FG10基因组含有与肽类、三氯生类、喹诺酮类、苯酚类、碳青霉烯类、磷霉素类以及双环霉素类等抗生素相关耐药基因，并且核苷酸一致性极高(95.8%–100.0%)。这些基因主要通过改变抗生素靶点(antibiotic target alteration)以及抗生素外排(antibiotic efflux)的方式来对抗生素产生耐药性，其中，基因FG10620252_01262通过抗生素外排的方式对喹诺酮类抗生素产生耐药性。
表 4. 菌株FG10中的主要耐药基因
Table 4. The main antibiotic resistance genes from strain FG10
| Genes | AMR gene family | Drug class | Resistance mechanism | Identity/% |
| FG10620252_00638, FG10620252_04474 | Phosphoethanolamine transferase; Pmr | Peptide | Antibiotic target alteration; antibiotic efflux | 100.0 |
| FG10620252_01055 | RND antibiotic efflux pump | Triclosan | Antibiotic efflux | 95.8 |
| FG10620252_01262 | RND antibiotic efflux pump | Fluoroquinolone | Antibiotic efflux | 100.0 |
| FG10620252_02049, FG10620252_04656 | OXA beta-lactamase | Carbapenem | Antibiotic inactivation | 100.0 |
| FG10620252_02353 | Chloramphenicol acetyltransferase CAT | Phenicol | Antibiotic inactivation | 100.0 |
| FG10620252_03362 | Fosfomycin thiol transferase | Fosfomycin | Antibiotic inactivation | 100.0 |
| FG10620252_04683 | MFS antibiotic efflux pump | Bicyclomycin | Antibiotic efflux | 100.0 |
3 讨论
近几年，有关铜绿假单胞菌的报道主要集中在医院内感染和畜牧家禽中的感染，针对水产养殖中的研究比较少见。崔来宾等报道了铜绿假单胞菌可感染草鱼引起类似赤皮病的症状[29]；陶保华等在患病罗氏沼虾的腮部和肝胰腺组织中分离鉴定出了铜绿假单胞菌[30]。何苹萍等从属于龟鳖目的黄喉拟水龟肝脏中分离出一株铜绿假单胞菌，但在黄喉拟水龟其他多个组织器官中未分离到病原细菌，推测铜绿假单胞菌是主要病原，并且感染的主要器官是肝脏[14]，而在本研究中，中华鳖的肝脏和肠道都出现了不同程度的组织病变(图 1和图 2)。在过往报道的中华鳖细菌性疾病中，大多数病原为嗜水气单胞菌，出现反应迟钝、红底板、红脖子、腐皮病、出血性肠炎等症状[3]，在本研究中也出现了类似腐皮病和肠道出血的症状，说明虽然两种病原菌不同，但均能引起中华鳖出现相同的病症。
陶保华等研究表明，用分离的铜绿假单胞菌菌株DM1回归感染罗氏沼虾，DM1菌株引发健康虾发病死亡的时间在7–10 h，24 h内完全死亡[30]。本研究中经腹腔注射分离株菌悬液的健康中华鳖在感染早期(1–3 d)死亡较慢，但在7 d内全部死亡(图 5)，显示健康中华鳖在攻毒感染后的病程相对较慢。这表明虽然铜绿假单胞菌对水产养殖动物感染后病程快慢有所差异，但均能导致较大规模死亡，需在养殖中加以重视。
在以往研究中，为了解铜绿假单胞菌的分子分型情况应用过多种方法，如PFGE (pulse field gel electrophoresis)、EPIC-PCR (emulsion paired isolation and concatenation PCR)、RAPD (random amplified polymorphic DNA)等，这些方法均有一定局限性，而MLST技术有着众多优点，如成本低、重复性高、分辨率高等，因其数据在全球范围内共享所以在交流结果中更方便快捷，成为被广泛应用的微生物分型研究的“黄金标准”[31]。在本研究中，MLST分析结果表明3株分离株均属于ST252型。在数据库中，已知的ST252型菌株均分离于人(医)源和中国以外地区，本研究首次报道非人源(动物源) ST252型菌株。根据eBURST的分析结果(图 6)，ST252型是CC252的原始序列型，暗示其可以产生更多的变异型，本研究首次在中国发现了ST252型菌株，为以后的病原流行病学研究提供了帮助，具有公共卫生意义。
铜绿假单胞菌的基因组是细菌中已知的相对较大的基因组，铜绿假单胞菌模式菌株PAO1 (GenBank：NC_002516)的基因组为6.26 Mb。通常基因组越大的菌株，其代谢能力和耐受能力越强，更能适应多种环境[32]。本研究通过全基因组测序及基因功能注释，结果显示菌株FG10同样具有较大的基因组，且参与细胞代谢与耐受的基因丰富(图 7)，暗示菌株FG10可能具有较强的环境适应能力，提醒我们在养殖过程中应做好有效防控。
在FG10毒力基因分析结果中，黏附相关的基因在预测结果中占主要部分(占到全部预测毒力基因的17.8%，表 3)。预测结果显示，FG10基因组中存在许多与趋化作用相关的ACF家族基因，可与毒素共同调节菌毛相关基因簇的表达水平[33]。菌毛形成增加可以促进生物被膜形成、增加细菌的黏附能力，从而增强细菌的致病力[34-35]。分泌系统属于进攻性毒力因子，FG10中存在Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅵ型分泌系统，Ⅱ型分泌系统(T2SS)参与很多毒力因子的分泌过程，向胞外分泌多种蛋白，如气溶素、蛋白酶等，通过这些蛋白毒力因子破坏宿主细胞，从而引起组织坏死；此外，T2SS与细菌的运动性及生物被膜形成等方面也有很多联系[36]。FG10中存在T2SS，推测其主要功能是将毒素和酶分泌到胞外[37]。Ⅵ型分泌系统(T6SS)在铜绿假单胞菌中是一种重要的分泌系统，可以促进生物被膜的形成，还可以将细胞内的多种蛋白毒力因子分泌到细胞外或者环境中，是影响铜绿假单胞菌致病性和耐药性的重要因素[38]。有研究表明铜绿假单胞菌T6SS不仅可以转运毒性蛋白，还可以转运铁离子[39]。大量研究还表明，铜绿假单胞菌致病的关键因素是T6SS可以将毒力因子精准输送至宿主细胞[40]。铁与致病菌的毒力、生物被膜形成等功能密切相关。在肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)中，铁离子的浓度会作用于Ⅲ型分泌系统(T3SS)的表达，T3SS会介导肠道沙门氏菌对细胞的感染[41]，铁稳态对于细菌的生存和繁殖极为重要，所以铁元素摄取会受到铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator)的严格调控[42]，细胞外游离铁的缺乏是限制入侵病原菌利用铁的有效手段[43]。在铜绿假单胞菌中，可以分泌产生可能位于膜上的铁还原酶，Fe3+会被还原成更容易溶解的Fe2+形式，Fe2+的摄取将通过多个转运系统的协作来完成[44-45]。FG10中还存在多套双组分调控系统(表 3)。双组分调控系统是细菌感应并响应外界复杂环境最为重要的信号传导系统，可以在病原菌感染过程中调控温度、镁离子、磷酸盐、渗透压和宿主激素等因素，以此来调节对外界环境的适应性[46-47]。病原菌在感染宿主的不同阶段对环境的适应性适应不仅需要一些特定的毒力因子的表达，也需要对代谢过程进行严格的调控，双组分调节系统在这些过程中都起到了重要作用[48]。
芮萍等研究显示，从患出血性肺炎的水貂中分离的铜绿假单胞菌对内酰胺类、碳青霉烯类、喹诺酮类的左氧氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星均高度敏感，庆大霉素也有一定抑菌效果[49]。王永强等的研究显示，从鸵鸟体内分离的铜绿假单胞菌对头孢类、内酰胺类、庆大霉素、环丙沙星、美罗培南、氨曲南高度敏感，对氟苯尼考、氯霉素耐药[50]。以上药敏结果与本研究存在一定区别(表 2)，在本研究中3株分离株同样对头孢类、美罗培南等高度敏感，但对环丙沙星及庆大霉素耐药。不同地区和宿主的细菌耐药性有区别，可能是与养殖中抗生素的使用环境有关，所以需要合理地选择使用抗生素去治疗[51]。
喹诺酮类抗生素是水产养殖中的常见药物，目前在水产养殖中广泛应用[52]。但由于长期不合理使用，造成水产致病菌不可避免地产生耐药性，导致在治疗水产动物细菌性疾病时无法对症下药，给养殖者带来经济损失；另一方面，在养殖中抗生素用量的增加使得抗生素药物在水产动物体内残留的风险增高，也使水体中抗生素含量超标，给人类的食品健康安全带来隐患[53-54]。本研究中，3株分离株对喹诺酮类抗生素(环丙沙星)均表现为耐药(表 2)，在菌株FG10中，确实也预测到保守的喹诺酮类耐药基因(locus_tag：FG10620252_01262，表 4)。以菌株FG10为例，对喹诺酮类抗生素耐药的铜绿假单胞菌在水产养殖环境中的存在，加之其可能存在强的环境适应能力，推测对喹诺酮类抗生素耐药的铜绿假单胞菌很可能未来会在水产养殖上快速、广泛传播，水产从业者应引起重视。
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