2022, Vol. 62中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 熊静, 王士源, 李会, 张阳, 程鹏, 梅翠, 彭练慈, 徐登峰, 高继业, 何玉张, 陈红伟. 2022
- XIONG Jing, WANG Shiyuan, LI Hui, ZHANG Yang, CHENG Peng, MEI Cui, PENG Lianci, XU Dengfeng, GAO Jiye, HE Yuzhang, CHEN Hongwei.
- 抗微生物肽CRAMP联合抗生素分散铜绿假单胞菌生物被膜的增效作用研究
- Synergistic effect of CRAMP and antibiotic against Pseudomonas aeruginosa biofilm
- 微生物学报, 62(8): 3251-3262
- Acta Microbiologica Sinica, 62(8): 3251-3262
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文章历史
- 收稿日期：2021-12-24
- 修回日期：2022-03-15
- 网络出版日期：2022-04-21
引用本文 |
2. 西南大学 医学研究院免疫学研究中心，重庆 402460;
3. 国家生猪技术创新中心，重庆 402460;
4. 重庆市畜牧科学院，重庆 402460
2. Immunology Research Center, Medical Research Institute, Southwest University, Chongqing 402460, China;
3. National Center of Technology Innovation for Pigs, Chongqing 402460, China;
4. Chongqing Academy of Animal Sciences, Chongqing 402460, China
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.a)，是一种重要的人畜共患条件性致病菌，是人类条件性感染的前三大病原菌之一[1]，因其极易形成生物被膜，常常被作为研究生物被膜的模式菌株[2]。细菌生物被膜(biofilm，BF)是指附着于生物或非生物表面被细菌胞外多糖(exopolysaccharides，EPS，包含胞外多糖、蛋白质和eDNA)包裹的有组织的细菌群体[3]。据统计，自然界中超过99%的细菌以生物被膜的形式存在[4]，80%的院内病原菌感染都与生物被膜有关[5]。生物被膜细菌常常能够导致比浮游细菌高10–1 000倍的抗生素耐药[6–7]。目前可以通过抑制生物被膜的形成和清除已经形成的成熟生物被膜2种途径来消灭生物被膜[8]。相较于生物被膜的形成，细菌从成熟生物被膜中分散的机制直到最近才引起人们的重视[9]。
抗微生物肽(antimicrobial peptide，AMP)又称抗菌肽或宿主防御肽，是一类广泛存在于各种生物体内的防御性小肽，是免疫系统的重要组成成分。在包括小鼠和人类在内的各种哺乳动物中都发现了抗微生物肽，其中鼠源抗微生物肽(cathelicidin related antimicrobial peptide，CRAMP)和LL-37是唯一存在于小鼠和人体内的抗微生物肽[10]。近年来，有研究者将LL-37应用于对抗细菌生物被膜领域，LL-37及其修饰物已被报道具有抗生物被膜活性[11–12]，而CRAMP的结构和功能与LL-37极为相似[13]。随着对抗微生物肽的抗菌机理和抗生素的耐药机理的深入研究，有研究报道抗微生物肽和某些抗生素之间存在协同抗菌作用[14]。
本研究通过前期试验发现，CRAMP修饰肽可以抑制铜绿假单胞菌PAO1生物被膜的形成和清除成熟生物被膜，通过激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)发现CRAMP (62.5 μg/mL)修饰肽作用后的PAO1生物被膜体积和数量明显变小[15–16]。初步推测CRAMP修饰肽的这种清除作用，主要是促使PAO1成熟生物被膜提前分散，并主要以分散细菌形式存在。本研究将CRAMP修饰肽与14种抗生素联合应用于PAO1成熟生物被膜，旨在根除生物被膜细菌、杀灭分散细菌及浮游细菌，同时降低药物的使用剂量和延缓细菌耐药性的产生。
1 材料与方法 1.1 菌株和药品铜绿假单胞菌PAO1株，中国普通微生物菌种保藏管理中心。
CRAMP修饰肽由苏州强耀生物科技有限公司合成和修饰，氨基酸序列和修饰见国家发明专利(201810701474.7)；美罗培南(meropenem，MEM)、亚胺培南(imipenem，IMP)、哌拉西林(piperacillin，PIP)、头孢他啶/碳酸钠(ceftazidime with sodium carbonate，CAZ)、头孢喹诺(cefquinome sulfate，CQN)、头孢哌酮酸(cefoperazone acid，CFP)、硫酸阿米卡星(amikacin sulfate，AMK)、阿奇霉素(azithromycin，AZM)、罗红霉素(roxithromycin，ROX)、乳酸环丙沙星(ciprofloxacin lactate，CIP)、盐酸万古霉素(vancomycin hydrochloride，VAN)均购自美仑生物技术有限公司；硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate，GEN)、多粘菌素E硫酸盐(colistin sulfate，COL)、恩诺沙星(enrofloxacin，ENX)购自上海源叶生物科技有限公司。
1.2 主要试剂MH肉汤、LB肉汤、LB琼脂、TSA琼脂均购自青岛海博生物技术有限公司；1%结晶紫、Triton X-100购自北京索莱宝科技有限公司；96孔细胞培养板(3599)购自康宁公司；Lab-TekTMⅡ腔室盖玻片、FilmTracerTM LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.3 CRAMP修饰肽对PAO1成熟生物被膜细菌的影响将PAO1菌株隔夜培养，10 000 r/min离心10 min，弃上清重悬于等体积MH肉汤。调整OD600=0.1，并稀释100倍，作为工作菌液。将工作菌液加入96孔板中，37 ℃培养72 h，形成成熟生物被膜，每隔24 h更换一次MH肉汤[16]。培养完毕后，用PBS溶液洗去浮游菌。将成熟生物被膜分为Control组、62.5 μg/mL组、31.2 μg/mL组和15.6 μg/mL组，加入提前稀释好的药物，于37 ℃作用1 h。作用完毕后，将孔里上层菌液转移至洁净的96孔板中(用于上层细菌活菌计数)，用PBS溶液洗涤生物被膜，再加入0.1% Triton溶液洗脱生物被膜细菌(用于生物被膜细菌活菌计数)。将上层细菌与生物被膜细菌10倍稀释至合适浓度梯度后涂布于TSA琼脂板上，于37 ℃静置培养16–18 h观察结果。所有试验均独立重复3次以上，下同。
1.4 CRAMP修饰肽及14种抗生素的MIC和MBC值测定将CRAMP修饰肽与抗生素用无菌水溶解稀释，然后将药物溶液通过0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。采用微量肉汤稀释法测定CRAMP修饰肽及14种抗生素对铜绿假单胞菌PAO1的最小抑菌浓度(MIC)。然后通过细菌计数确定药物的MBC值。以能使细菌减少99.9%的药物浓度作为该药物对铜绿假单胞菌PAO1的最小杀菌浓度(MBC)[17]。
1.5 CRAMP修饰肽及14种抗生素单用和联用的MBEC值测定在96孔板中培养3 d成熟生物被膜，然后用PBS溶液洗去浮游菌。将CRAMP修饰肽和抗生素倍比稀释后加入孔中，并设置Control组，于37 ℃静置培养24 h。作用完毕后，用PBS溶液洗去药物及浮游菌。再加入0.1% Triton溶液洗脱生物被膜细菌。将生物被膜细菌10倍稀释至合适浓度梯度后涂布于TSA琼脂板上，于37 ℃静置培养16–18 h观察结果。与Control组相比，以用药浓度能够使得铜绿假单胞菌PAO1成熟生物被膜细菌下降99.9%作为生物被膜最小根除浓度(MBEC)。
1.6 CRAMP修饰肽联用万古霉素、罗红霉素和阿奇霉素对PAO1生物被膜细菌的TKC在96孔板中培养3 d成熟生物被膜，然后用PBS溶液洗去浮游菌。将成熟生物被膜分为Control组、CRAMP修饰肽组、抗生素组和联合用药组(CRAMP修饰肽为62.5 μg/mL、药物为1×MBEC浓度)分别进行试验。加入提前稀释好的药物，于37 ℃分别作用0、0.5、1、3、6、24 h。作用完毕后，用PBS溶液洗去药物和浮游细菌。再加入0.1% Triton溶液洗脱生物被膜细菌。将生物被膜细菌10倍稀释至合适浓度梯度后涂布于TSA琼脂板上，于37 ℃静置培养16–18 h观察结果。最后将试验结果以时间变化作为横坐标，生物被膜细菌存活数量作为纵坐标，绘制时间杀菌曲线(time killing curve，TKC)。
药物协同效应的判定：协同作用或拮抗作用定义为药物作用后能使得生物被膜细菌数量与原始生物被膜细菌数量相比减少或增加2 log10 (CFU/mL)以上，若变化范围在2 log10 (CFU/mL)以内，则定义为相加作用[18]。为了更好地说明哪一个时间点的协同效应更强，采用了bliss公式(1)来辅助判断。若实际抑制率与理论抑制率差值越大，则说明协同效应越高[19]。
| $ Z=X+Y(1–X) $ | 公式(1) |
X值代表两种药物中任意一种药物的生物被膜细菌抑制率，Y值代表另外一种药物的生物被膜细菌抑制率，Z值代表 2种药物联用后产生的理论生物被膜细菌抑制率。
1.7 激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)表征生物被膜形态将工作菌液加入Lab-TekTM Ⅱ腔室盖玻片中。在37 ℃条件下静置培养3 d，每隔24 h更换培养基。将成熟生物被膜平均分成4个组，分别为Control组、CRAMP修饰肽组、抗生素组和联合用药组。培养3 d后，弃上清液并用PBS溶液洗去浮游细菌，加入提前稀释好的药物，于37 ℃作用1 h。药物干预结束后，用0.9%的NaCl溶液洗去未附着的浮游细菌。在暗室中用Filmtracer™ LIVE/DEAD™ Biofilm Viability Kit染色。用灭菌水洗去多余的染料，在Nikon Eclipse Ti2共聚焦激光显微镜20倍镜下观察生物被膜[16]。激发波长分别为488 nm (SYTO)和561 nm (PI)，针孔大小采用60 μm。在20倍物镜下随机选取视野，并进行Z-stack，每个组至少3次独立重复试验的9个随机视野，图像导出处理采用NIS Viewer v5.21.00软件处理。生物被膜相关试验参数，如荧光强度、生物被膜体积、生物被膜面积等均采用开源软件Biofilm Q[20]进行分析处理。
2 结果与分析 2.1 CRAMP修饰肽对PAO1成熟生物被膜细菌的影响CRAMP修饰肽作用于铜绿假单胞菌PAO1 72 h成熟生物被膜后，在62.5 μg/mL浓度下，生物被膜细菌下降1.76个log10 (CFU/mL)的值，上层液细菌下降0.02个log10 (CFU/mL)的值；在31.2 μg/mL浓度下，生物被膜细菌下降1.08个log10 (CFU/mL)的值，上层液细菌增加1.36个log10 (CFU/mL)的值；在15.6 μg/mL浓度下，生物被膜细菌下降0.25个log10 (CFU/mL)的值，上层液细菌增加0.17个log10 (CFU/mL)的值。CRAMP修饰肽各浓度对铜绿假单胞菌PAO1 72 h成熟生物被膜细菌和上层液细菌的作用具体情况详见图 1。
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| 图 1 CRAMP对PAO1成熟生物被膜细菌的影响 Figure 1 Effects of CRAMP on PAO1 mature biofilm bacteria. The black color represents the number of dispersal cells in the upper suspension, the gray color represents the number of biofilm cells. The error bar represents the standard deviation of at least three independent repeats of data at the same point in time. |
2.2 CRAMP修饰肽及14种抗生素的MIC、MBC、MBEC值和CRAMP修饰肽联合14种抗生素的MBEC值
CRAMP修饰肽作用于铜绿假单胞菌PAO1 72 h成熟生物被膜后MBEC值大于5 000 μg/mL。2种碳青霉烯类药物(美罗培南和亚胺培南)和4种β-内酰胺类药物(哌拉西林、头孢他啶、头孢喹诺和头孢哌酮)对铜绿假单胞菌PAO1 72 h成熟生物被膜的MBEC值均大于2 048 μg/mL。阿奇霉素、罗红霉素、万古霉素和多粘菌素E对铜绿假单胞菌PAO1成熟生物被膜的MBEC值分别为16、512、128和1 024 μg/mL，其他大多数抗生素的MBEC值均≤2 μg/mL。
CRAMP修饰肽联合2种碳青霉烯类药物(美罗培南和亚胺培南)和4种β-内酰胺类药物(哌拉西林、头孢他啶、头孢喹诺和头孢哌酮)后对铜绿假单胞菌PAO1 72 h成熟生物被膜的MBEC值仍大于2 048 μg/mL。其他抗生素相较于单用药物的MBEC值，联合CRAMP修饰肽后的MBEC值药物使用浓度均有不同程度的下降。万古霉素、罗红霉素和阿奇霉素下降倍数最明显(4倍)。各个药物对PAO1的MIC、MBC、MBEC值和CRAMP修饰肽联合14种抗生素的MBEC值，结果详见表 1。
| Antimicrobial agents | MIC/(μg/mL) | MBC/(μg/mL) | MBEC/(μg/mL) | MBEC(AMP+antibiotic)/(μg/mL) | Fold change |
| CRAMP | 15.625 | 31.25 | > 5 000 | – | – |
| MEM | 0.5 | 2 | > 2 048 | > 2 048 | – |
| IMP | 2 | 8 | > 2 048 | > 2 048 | – |
| PIP | 2 | 4 | > 2 048 | > 2 048 | – |
| CAZ | 1 | 2 | > 2 048 | > 2 048 | – |
| CQN | 2 | 2 | > 2 048 | > 2 048 | – |
| CFP | 4 | 4 | > 2 048 | > 2 048 | – |
| GEN | 0.5 | 1 | 2 | 1 | 2× |
| AMK | 0.25 | 0.5 | 1 | 0.5 | 2× |
| AZM | 16 | 16 | 16 | 4 | 4× |
| ROX | 512 | 512 | 512 | 128 | 4× |
| CIP | 0.031 | 0.063 | 0.125 | 0.125 | 1× |
| ENX | 0.5 | 1 | 1–2 | 1–2 | 1× |
| COL | 0.25 | 0.5 | 128 | 64 | 2× |
| VAN | 1 024 | 1 024 | 1 024 | 256 | 4× |
| “–” indicates that the MBEC value of the drug has not been measured or there is no significant change in the MBEC value of the drug combined with antimicrobial peptide. | |||||
2.3 CRAMP修饰肽联用万古霉素等对PAO1生物被膜细菌的TKC
对照组在前6 h内生物被膜细菌数量上升了2.60 (99.75%)个log10 (CFU/mL)的值。但与6 h相比，生物被膜细菌数量在24 h略有减少(仅上升1.77个log10 (CFU/mL)的值，约98.30%)。CRAMP修饰肽组3 h时能够减少1.41个log10 (CFU/mL) (96.11%)的生物被膜细菌，3 h后生物被膜细菌数量逐渐增多。3种抗生素单用组药物使用后均能使得生物被膜细菌数量有着不同的下降。万古霉素组在6 h时能够杀灭全部(100%)的生物被膜细菌，罗红霉素在24 h时能够杀灭全部(100%)的生物被膜细菌，阿奇霉素在24 h时也能使生物被膜细菌数量下降3.14 (99.93%)个log10 (CFU/mL)的值。而联用CRAMP修饰肽后，万古霉素组仅3 h时就能够杀灭全部(100%)的生物被膜细菌，罗红霉素和阿奇霉素在相同时间点杀灭生物被膜细菌的数量都有提高。CRAMP修饰肽联用万古霉素、罗红霉素、阿奇霉素各个时间点生物被膜细菌数量见图 2。
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| 图 2 CRAMP联用万古霉素、罗红霉素和阿奇霉素对PAO1生物被膜细菌的时间杀菌曲线 Figure 2 The time-kill curve of CRAMP combined with vancomycin, roxithromycin and azithromycin against PAO1 biofilm bacteria. VAN: vancomycin (A); ROX: roxithromycin (B); AZM: azithromycin. +CRAMP (C) combinations observed by time-kill determinations against biofilms of PAO1 at 1×MBEC. The X- and Y-axis represents time and logarithmic PAO1 survival in biofilm, respectively. Error bars indicate the standard deviations between strains. CFU: colony-forming unit, Control: PAO1 biofilms without any antimicrobial treatment. The error bar represents the standard deviation of at least three independent repeats of data at the same point in time. |
2.4 CRAMP修饰肽联用万古霉素等抗PAO1生物被膜细菌的协同效应判定
除CRAMP修饰肽组，其余药物干预组在作用铜绿假单胞菌PAO1成熟生物被膜24 h后生物被膜细菌数量均减少3 log10 (CFU/mL)以上。药物作用1 h时，CRAMP修饰肽与万古霉素联用组生物被膜细菌下降为3.46 log10 (CFU/mL)，CRAMP修饰肽组与万古霉素单用组生物被膜细菌存活数量分别为5.54 log10 (CFU/mL)和5.70 log10 (CFU/mL)。药物作用3 h时，CRAMP修饰肽与万古霉素联用组生物被膜细菌下降为0 (CFU/mL)，CRAMP修饰肽组与万古霉素单用组生物被膜细菌存活数量分别为4.58 log10 (CFU/mL)和3.36 log10 (CFU/mL)。在1 h和3 h时，万古霉素联用药物组比单药组生物被膜细菌均减少2 log10 (CFU/mL)以上，判定为协同作用。而CRAMP修饰肽与罗红霉素和阿奇霉素联用后，铜绿假单胞菌PAO1成熟生物被膜细菌下降量均大于单用药物组，但无论在哪个时间点，变化幅度均在2 log10 (CFU/mL)以内，判定为相加作用。
2.5 CRAMP修饰肽联用万古霉素的协同效应系数计算CRAMP修饰肽联用万古霉素作用PAO1成熟生物被膜1、3 h均下降2 log10 (CFU/mL)以上。根据bliss公式，CRAMP修饰肽与万古霉素单用、联用生物被膜细菌理论、实际抑制率(%)详见表 2。结果表明，CRAMP修饰肽联用万古霉素作用PAO1成熟生物被膜1 h时协同效应最大。
| t/h | Z' | CRAMP | VAN | Z | Z'–Z |
| 1 | 99.70 | 48.71 | 81.80 | 81.80 | 17.90 |
| 3 | 100.00 | 96.11 | 99.77 | 99.99 | 0.01 |
| The Zʹ represented the real inhibition rate of PAO1 biofilm treated by the combination drugs, the Z represented the theoretical inhibition rate of PAO1 biofilm treated by the combination drugs. the value of Zʹ–Z was used to describe the degree of synergy, the higher the Zʹ–Z value was, the more pronounced the synergistic effect was. | |||||
2.6 共聚焦激光扫描显微镜观察CRAMP修饰肽联用万古霉素对PAO1成熟生物被膜的影响
本研究利用共聚焦激光扫描显微镜观察了1×MBEC浓度下CRAMP修饰肽和万古霉素单用、联用对PAO1成熟生物被膜的影响，代表性图片和Biofilm Q量化生物被膜分析数据见图 3。
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| 图 3 CLSM观察CRAMP联合万古霉素对PAO1成熟生物被膜的影响 Figure 3 Confocal laser scanning microscope observation of CRAMP combined with vancomycin on PAO1 mature biofilm. A (Control), B (CRAMP), C (VAN), D (CRAMP+VAN) are representative orthogonal view; E (Control), F (CRAMP), G (VAN), H (CRAMP+VAN) are representative 3D biofilms; I: the number of biofilms, J: biofilm volume, K: biofilm area, L: fluorescence intensity per unit area (fluorescence intensity/area) were analyzed by Biofilm Q. Significant differences were indicated as *: P < 0.05, **: P < 0.01. |
CRAMP修饰肽联用万古霉素对PAO1成熟生物被膜数量和体积的影响，与Control组相比，CRAMP修饰肽组、联用药物组生物被膜数量分别减少79.03%和85.92%，差异极显著(P < 0.01)；但是VAN组生物被膜数量减少38.20%，差异显著(P < 0.05)。CRAMP修饰肽、VAN组及联用药物组生物被膜体积分别减少91.83%、73.38%和88.71%，差异极显著(P < 0.01)；与VAN组相比，CRAMP修饰肽组生物被膜数量和体积分别减少66.06%和69.33%，差异极显著(P < 0.01)；与万古霉素组相比，联用组生物被膜数量减少77.21%，差异极显著(P < 0.01)，生物被膜体积减小57.60%，差异显著(P < 0.05)(图 3I–3J)。
CRAMP修饰肽联用万古霉素对PAO1成熟生物被膜面积的影响，CRAMP修饰肽联用万古霉素组与Control组相比，生物被膜面积减少20.12%，差异极显著(P < 0.01)；与CRAMP修饰肽组相比，生物被膜面积减少14.31%，差异显著(P < 0.05)；与万古霉素组相比，生物被膜面积减少17.30%，差异极显著(P < 0.01)(图 3K)。
CRAMP修饰肽联用万古霉素对PAO1成熟生物被膜单位面积荧光强度的影响，用药组与Control组相比，CRAMP修饰肽、VAN组及联用药物组SYTO9 (染色为绿色，代表活菌)单位面积荧光强度分别减少69.19%、68.04%和73.71%，PI (染色为红色，代表死菌)单位面积荧光强度分别减少85.42%、62.17%和55.63%，均差异极显著(P < 0.01)；但是，与CRAMP修饰肽组相比，VAN组PI单位面积荧光强度增加2.59倍，差异显著(P < 0.05)，联用药物组PI单位面积荧光强度增加3.04倍，差异显著(P < 0.05)(图 3L)。
3 讨论与结论随着抗生素的广泛应用及不合理使用，细菌耐药性形势变得十分严峻。近年来，细菌生物被膜由于其高度的抗生素耐药性，使其受到了越来越多的研究人员关注。本研究考察了14种传统抗生素的抗生物被膜能力，发现大部分抗生素的最小生物被膜根除浓度(MBEC)远大于最小杀菌浓度(MBC)，表明生物被膜细菌较其浮游细菌具有不同程度的抗生素耐药，这可能与生物被膜EPS的成分和抗生素的渗透性相关。另外，本研究在CRAMP修饰肽对PAO1成熟生物被膜的分散作用考察中发现，62.5、31.2和15.6 μg/mL的CRAMP修饰肽均能不同程度降低生物被膜活菌数(分别减少了98.3%、91.7%和43.8%)，值得注意的是31.2和15.6 μg/mL浓度作用下，上层细菌(即72 h成熟生物被膜的上层培养液中的细菌)与对照组比较显著增多(分别增多了95.6%和32.4%)，表明大量生物被膜细菌被分散进入上层培养液中，而62.5 μg/mL作用时上层细菌不仅没有增多，反而降低了，表明该浓度的CRAMP修饰肽对分散细菌也具有明显的抑杀作用。前期我们通过转录组学研究发现，CRAMP修饰肽可能作用于PAO1环二鸟苷酸(c-di-GMP)系统，并且与其密度感应(quorum sensing，QS)系统和藻酸盐合成相关[15–16]。根据文献报道，低水平的c-di-GMP促进细菌运动性，促使生物被膜细菌向浮游菌转变，留下中心空洞的生物被膜，最终导致生物被膜分散[9]。结合近期我们的研究结果发现，CRAMP修饰肽可显著减低PAO1成熟生物被膜的c-di-GMP水平(另文发表)，表明CRAMP修饰肽对PAO1成熟生物被膜的清除作用实质是一种分散作用。但生物被膜的分散并不是一劳永逸的，在无抗生素治疗的小鼠伤口模型中，利用糖苷水解酶分散生物被膜时，引起了小鼠体内大规模的细菌扩散和败血症。而辅助抗生素治疗时，小鼠的存活率及生物被膜根除率得到显著的提升[9, 21]。上述研究结果表明，对已经成熟的生物被膜提前且彻底地分散，并对释放出的细菌进行杀灭，将是一种非常有前途的控制生物被膜感染的策略[9]。
抗微生物肽作为一类具有独特的作用机制的阳离子型多肽，能与两亲性脂质膜融合形成孔洞使得细菌外膜通透性发生改变[22]。近年来，研究者还将抗微生物肽广泛应用于抗生物被膜研究中[11–12, 16]，发现抗微生物肽不仅在细胞外膜上起作用，还可能在细胞内的转录和翻译等过程发挥作用[23]。但是，血浆半衰期较短、溶血性和细胞毒性是抗微生物肽难以广泛应用于临床的局限所在。研究者们通过筛选、改造和合成等多种手段希望能够解决这一瓶颈问题，但往往收效甚微且研发时间周期较长，因此在已有基础药物上的合理联合用药成为解决这一问题的关键[24]。Dosler等利用抗微生物肽联用抗生素时对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的协同或相加作用[18, 25]。Paduszynska等利用短的脂肽和庆大霉素联用发现其能够增强庆大霉素对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物被膜细菌的抗菌活性[26]。本研究也具有类似的发现，CRAMP修饰肽联合抗生素后能够使得抗生素的MBEC值下降2–4倍。我们发现在远低于MBEC浓度条件下，CRAMP修饰肽与万古霉素的联用，不仅比万古霉素单用药浓度更低，且杀灭生物被膜细菌速度更快。
考虑到联合用药分级抑制浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FIC值)测定方法中需要以不同浓度梯度的CRAMP修饰肽与不同浓度梯度的抗生素两两分别联合，这将会使得细菌计数工作量陡然上升，再加上不同抗生素的联用组合，对于药物筛选来讲这几乎是一个不可能完成的任务。因此在联合用药时，我们选择了前期试验中可以使得生物被膜分散的浓度(62.5 μg/mL)。联合用药时通过固定CRAMP修饰肽为62.5 μg/mL (前期试验发现能够清除成熟生物被膜的浓度[16])与不同浓度抗生素联用的办法进行MBEC试验。虽然MIC和MBEC证明了抗生素和CRAMP修饰肽对铜绿假单胞菌PAO1有一定的杀菌和抗生物被膜作用，但不能提供关于抗菌活性作用过程的信息。使用TKC研究可以克服这一局限性[18, 25]。本研究选择了联合用药后MBEC下降最明显的3种药物(万古霉素、罗红霉素和阿奇霉素)进行时间杀菌测试。结果显示，CRAMP修饰肽联用万古霉素显示出协同作用，而与红霉素和阿奇霉素联用显示出相加作用。这与文献报道的外膜渗透性增强剂PEG-DG偶联物可以提高低渗透性抗生素万古霉素和红霉素对铜绿假单胞菌PAO1的抗菌活性类似[27]。推测可能是由于CRAMP修饰肽属于阳离子型多肽，通过提高PAO1外膜的通透性，使得万古霉素能够更好渗透，有利于更好地根除生物被膜细菌。有研究者指出[27]，革兰氏阴性细菌因其外膜的不对称磷脂和脂多糖结构，这是革兰氏阴性细菌对大型支架抗生素(万古霉素、罗红霉素等)产生天然耐药的原因之一。而铜绿假单胞菌的外膜渗透性比大肠杆菌低约12倍，很多临床多重耐药细菌(multi-drug resistance，MDR)也已被证明与外膜通透性结构改变相关[27–28]。我们不仅在对生物被膜细菌的作用中观察到CRAMP修饰肽与万古霉素的协同作用，在针对浮游菌的FIC值测定中也观察到了明显的协同效应(数据未呈现)。因此，在新型抗生素开发周期较长的当下，如何提高已有抗生素的利用度，克服传统抗生素的应用局限是一个值得深入研究的课题。
综上所述，CRAMP修饰肽对铜绿假单胞菌成熟生物被膜具有分散作用，联用万古霉素后的这种分散作用具有明显的协同效应，且联用后可杀灭生物被膜细菌和分散细菌。提示在防治生物被膜引起的慢性感染中，有效的生物被膜分散剂联用抗生素不仅有望解决生物被膜感染难以治愈的问题，而且能有效降低药物的使用剂量、减轻药物的毒副作用、延缓耐药性的产生。总之，CRAMP修饰肽有望开发成为新型抗生素增效剂，即生物被膜分散剂，将为生物被膜感染提供新的防治策略。
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