单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)，简称单增李斯特菌，是一种重要的食源性人兽共患病原菌^[1]。可感染牛、羊、禽等动物，后经动物性食品如肉、蛋、奶感染人，李斯特菌病会引起孕妇流产、胎儿脑膜炎、败血症等多种疾病，主要见于新生儿、老人、孕妇及免疫缺陷患者，致死率高达30%，因此被WHO列为“零容忍”的食源性病原菌之一^[2–4]。由于单增李斯特菌能够耐受高盐、极寒、氧化等加工、储存和运输环境，相较于大部分食源性致病菌，单增李斯特菌能够耐受氧化胁迫环境。近年来，世界各地几乎每年都有单增李斯特菌引起中毒并造成死亡的报道^[5–7]。因此，对该菌的感染、生存和致病性开展研究具有重要的公共卫生学意义。

氧化还原蛋白是一类参与蛋白质二硫键形成与打开，通过催化二硫键的氧化、还原和异构，保持菌体氧化还原稳态的重要酶活力调节蛋白^[8–9]。已知二硫键是蛋白质维持高级构象、保持生物活性的重要开关，对细菌的生命活动至关重要，近年来，氧化还原蛋白在应激生物学中的意义，已经成为疾病预防与控制的研究热点^[10]。目前对单增李斯特菌氧化还原蛋白家族中的部分成员已经展开了一定的研究，如硫氧还蛋白TrxA、谷氧还蛋白Grx以及含有CX₁X₂C基序的YjbH等，它们在单增李斯特菌对氧化剂如金属离子铜、肼和铬的氧化应激方面发挥着不同的作用，同时，这些硫氧还蛋白家族成员在介导单增李斯特菌致病过程中也扮演着不同的角色^[11‒14]。据Gopal等研究预测，单增李斯特菌中仅有14个含有“CX₁X₂C”活性位点的同源蛋白，Lmo1609就是其中之一^[15]。Lmo1609具有CX₁X₂C的保守结构域，属于硫氧化蛋白家族成员，是一种分子量小(12 kDa)、稳定性强、能够有效应对氧化应激的氧化还原蛋白^[16]，但Lmo1609蛋白的具体功能尚不清楚，对其应激生物学功能进行研究有助于理解单增李斯特菌的致病机制。

本研究通过同源重组方法获得了lmo1609的基因缺失株与回补株，从体外生物学、应激生物学、感染生物学等几个方面初步分析了Lmo1609的功能。本研究发现Lmo1609具有还原酶学活性，可以催化胰岛素二硫键还原，参与细菌抗氧化过程，而对细胞感染和对小鼠的致病力与野生株相比，均未有显著差异。表明Lmo1609参与单增李斯特菌的抗氧化应激但并不影响其致病性。

1 材料与方法 1.1 菌株、载体及试剂

本研究使用的菌株均为本实验室保存，所涉及的菌株有：单增李斯特菌野生株EGD-e、大肠杆菌DH5α和Rosetta。质粒有：表达载体pET30a、温度敏感性质粒pKSV7、整合型穿梭载体pIMK2。大肠杆菌DH5α和Rosetta培养于LB (Luria-Bertani)培养基，单增李斯特菌EGD-e及其突变菌株培养于BHI (brain heart infusion)培养基。除突变株筛选需要用到30 ℃和42 ℃培养外，其他培养条件均为37 ℃培养；根据需要添加抗生素，氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素的终浓度分别为100、30、50 μg/mL。BHI和LB培养基均购自Oxoid公司。

1.2 引物

根据GenBank (NC-003210.1)公布的lmo1609基因序列，分别设计用于扩增lmo1609上、下游同源臂的2对引物lmo1609-UF/UR和lmo1609-DF/DR；设计用于鉴定lmo1609基因缺失株的2对引物lmo1609-a front/lmo1609-DR和pKSV7-M13-Fwd/pKSV7-M13-Rev；设计用于构建回补质粒的引物pSL2154-BamH Ⅰ-F/ pSL2154-Sac Ⅰ-R；设计用于构建表达质粒的引物pSL1605-Nde Ⅰ-F/pSL1605-Xho Ⅰ-R。所用引物均由杭州有康生物科技有限公司合成，引物序列详见表 1。

1.3 载体构建

以单增李斯特菌EGD-e基因组为模板，使用引物lmo1609-UF/lmo1609-UR和lmo1609-DF/ lmo1609-DR分别扩增lmo1609的上、下游同源臂。使用重叠PCR方法获得同源重组片段，使用Pst Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接至pKSV7上，构建lmo1609-pKSV7重组质粒，测序正确后命名为pSL056 (图 1A)。

1.4 Δlmo1609缺失株构建

参照文献[11]进行感受态细胞的制备。将上述重组质粒pSL056电转化入EGD-e感受态细胞中，通过温度和氯霉素抗性双重选择压力进行同源重组克隆筛选，使用引物(lmo1609-a front-UF/lmo1609-DR)对筛选出的重组克隆进行PCR验证。

1.5 CΔlmo1609回补株构建

lmo1609为单转录本，从Promoter 3.0获得该基因启动子后，通过Snapgene设计扩增lmo1609基因的上游启动子区及CDS区的引物，克隆至pIMK2载体，转化至E. coli DH5α中，经测序正确后命名为pSL2154 (图 1B)。将pSL2154电转化至单增李斯特菌Δlmo1609缺失株感受态中，通过卡那霉素抗性筛选、菌落PCR验证及测序验证，获得回补株。

1.6 Lmo1609蛋白表达载体的构建

本试验利用乳糖操纵子调控系统及蛋白质融合His标签与镍柱亲和层析技术进行体外重组蛋白的原核表达与纯化。设计引物pSL1605-Nde Ⅰ-F/pSL1605-Xho Ⅰ-R，扩增Lmo1609 CDS序列，酶切连接至pET30a，转化入DH5α，经菌落PCR及Sanger测序正确后命名为pSL1605。

1.7 蛋白表达与纯化

重组蛋白的原核表达参照文献[17]进行。将1.6中获得的表达质粒pSL1605热转化入Rosetta中获得重组表达菌，从新鲜培养基中挑取重组蛋白表达菌Rosetta (pSL1605)的单菌落，接种至5 mL LB (卡那霉素)培养基中于37 ℃培养过夜，将过夜培养的细菌按照1:100的比例转接于500 mL LB (卡那霉素)培养基中，37 ℃、200×g振荡培养至OD₆₀₀约为0.6，向菌液中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37 ℃振荡培养约4 h以诱导蛋白表达。收集菌体、离心、洗涤、经超声破碎后，使用镍柱亲和层析纯化上清以获得目的蛋白，经SDS-PAGE验证重组蛋白的表达和纯化情况后使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，保存备用。

1.8 Lmo1609的还原酶学活性测定

本研究采用经典的胰岛素二硫键还原试验检测重组蛋白的还原酶学活性。胰岛素由2个二硫键连接的A链和B链组成，在二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)等还原剂存在条件下，胰岛素的二硫键被还原导致B链沉降，溶液变浑浊，B链的沉淀量可以通过检测波长OD₆₅₀处的吸收峰来测定，此时胰岛素二硫键被还原的速度是极缓慢的。如果在反应体系中同时添加具有还原酶活性的蛋白，胰岛素二硫键被DTT还原的速度则会显著加快，溶液浑浊度增加，B链的沉降量增多，OD₆₅₀数值升高，提示胰岛素被还原的程度越高，也表明外加蛋白的还原酶学活性越强^[18]。将浓度为1、5、10和30 μmol/L的Lmo1609重组蛋白，150 μmol/L胰岛素(底物)，1 mmol/L DTT电子供体和2 mmol/L EDTA混合在10 mmol/L PBS缓冲液中，于25 ℃反应150 min，每个反应设置3个平行实验，间隔10 min使用多功能酶标仪测定OD₆₅₀处吸光值，并使用GraphPad Prism软件绘制酶活时间曲线图。

根据上述实验结果确定Lmo1609蛋白的最佳工作浓度，选用不同浓度的胰岛素(15、30、60、90和120 μmol/L)作为底物，其余反应体系同上，于25 ℃反应150 min，间隔10 min使用多功能酶标仪对OD₆₅₀处吸光值进行测定，并使用GraphPad Prism软件绘制酶活时间曲线图。

1.9 生长曲线的测定

挑取野生株EGD-e、缺失株Δlmo1609和回补株CΔlmo1609的单菌落接种至5 mL BHI培养基中于37 ℃、200×g条件下培养12 h。然后取1 mL菌液，使用10 mmol/L PBS洗涤1次，并调整菌液OD₆₀₀至0.6，起始菌液使用BHI培养基稀释100倍后，按200 μL/孔的量加入96孔板中于37 ℃静置培养12 h，间隔1 h取样，测定OD₆₀₀值，使用GraphPad Prism绘制细菌生长曲线。

1.10 运动性试验

分别挑取野生株EGD-e、缺失株Δlmo1609和回补株CΔlmo1609单菌落接种至5 mL BHI培养基振荡培养过夜，次日按1:100转接至新的5 mL BHI培养基中，培养至OD₆₀₀至0.6，用牙签蘸取菌液，竖直点在TSA半固体培养基(0.25%琼脂、2%氯化钠及1.5%胰蛋白胨)中，分别于30 ℃以及37 ℃静置培养24 h、48 h后观察并记录细菌的运动圈直径。

1.11 氧化应激试验

挑取野生株EGD-e、Δlmo1609株和CΔlmo1609回补株的单菌落接种至5 mL BHI培养基中振荡培养过夜，调整OD₆₀₀至0.6，并依次点板于含有不同浓度氧化剂的BHI固体培养基上，37 ℃静置培养过夜后观察并拍照。氧化应激以H₂O₂为直接氧化剂，肼为硫醇特异性氧化剂，铜(Copper，Cu)、镉(Cadmium chloride，Cd)二价金属离子为氧化活性胁迫性氧化剂。双氧水、肼、Cd²⁺和Cu²⁺的浓度分别为5.0、1.0、1.0和0.5 mmol/L。

1.12 黏附和入侵和增殖试验

细胞实验参照文献[11−12]进行。在25 cm²细胞培养瓶中使用含有10 mL 10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基将Caco-2细胞置于的于37 ℃、含有5%的CO₂培养箱中培养。用DMEM细胞培养基对Caco-2细胞进行铺板，密度为10⁶个/mL。分别将野生株EGD-e、Δlmo1609和CΔlmo1609菌液浓度调整至OD₆₀₀至0.6，细菌按照感染复数(MOI)=10:1的比例感染Caco-2细胞，黏附用细胞感染30 min后，用PBS洗涤3次，并用100 μL Trypsin-EDTA (0.25%)和400 μL冰浴后的ddH₂O吹打裂解细胞，稀释到合适梯度涂布至BHI平板。入侵用细胞在细菌感染1.5 h后，使用终浓度为50 μg/mL庆大霉素杀菌1.5 h，并用PBS洗涤3次后裂解细胞，随后对裂解液进行稀释点板，并计算黏附和侵袭至Caco-2细胞中的细菌数。

胞内增殖用的RAW264.7巨噬细胞置于含10% FBS血清的DMEM培养基中，过夜培养使细胞充分贴壁。以MOI=10:1的比例加入细菌，1 h后用PBS洗涤3次，用50 μg/mL庆大霉素杀菌1 h后，记为2 h，分别在细菌感染2 h、6 h和12 h后裂解细胞，通过稀释点板进行细菌计数，使用GraphPad Prism软件作图并比较野生株、缺失株和回补株感染巨噬细胞2 h、6 h和12 h后在RAW264.7胞内的增殖能力。

1.13 细菌存活及小鼠脏器增殖试验

雌性ICR小鼠(16–22 g)购自浙江省杭州医学院，适应环境3 d后随机分组，每组24只。

分别挑取野生株EGD-e、缺失株Δlmo1609和回补株CΔlmo1609的单菌落至5 mL BHI液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜；使用10 mmol/L PBS洗涤1次，随后调整OD₆₀₀至0.6 (细菌浓度约为2×10⁹ CFU/mL)，将菌液稀释100倍后用于腹腔感染小鼠；每只小鼠腹腔注射100 μL菌液(感染量约为2×10⁶ CFU)，观察小鼠在14 d内的存活和死亡数。统计野生株EGD-e、缺失株Δlmo1609和回补株CΔlmo1609对小鼠的致病力。同时在感染后24 h和48 h分别从每组中取8只小鼠分离脾脏和肝脏，加入1 mL 10 mmol/L PBS，使用组织匀浆仪研磨组织，将匀浆液稀释至合适的倍数后点板于BHI培养基进行细菌计数。研究野生株EGD-e、缺失株Δlmo1609和回补株CΔlmo1609在小鼠肝脏和脾脏中的增殖情况。该试验进行2次重复。

2 结果和分析 2.1 Lmo1609氨基酸序列生物信息学分析

将Lmo1609与单增李斯特菌的硫氧还蛋白TrxA、大肠杆菌的硫氧还蛋白TrxA和TrxC以及枯草芽孢杆菌的硫氧还蛋白TrxA通过CLC sequence viewer 8软件进行比较，分析单增李斯特菌Lmo1609与已知硫氧还蛋白的同源性和特殊结构域，发现Lmo1609在69–72 aa区域具有保守的双半胱氨酸活性基序CX₁X₂C，由Cys-Gly-Asp-Cys (CGDC)构成，与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和单增李斯特菌的TrxA的CGPC基序存在一个关键氨基酸的突变(图 2)。因此，可以推论Lmo1609属于硫氧还蛋白家族成员，且其功能可能与突变的Asp位点密切相关。

2.2 lmo1609缺失株及回补株的构建 2.2.1 单增李斯特菌lmo1609缺失株构建及筛选验证

根据单增李斯特菌无痕基因敲除原理，利用引物lmo1609-UF/UR和lmo1609-DF/DR，分别扩增出长度为476 bp的上游同源臂和485 bp的下游同源臂，将上下游同源臂通过重叠PCR方法得到大小为961 bp的同源重组片段，随后将重叠PCR产物连接至pKSV7缺失载体中。42 ℃同源重组后，使用引物lmo1609-a front/ lmo1609-DR扩增菌落，获得条带大小为1 076 bp的产物(图 3A，泳道1)，较野生株EGD-e (图 3A，泳道2) 1 388 bp减少了312 bp，缺少的碱基数与lmo1609的CDS区大小相符。在30 ℃传代丢失pKSV7质粒后，使用引物pKSV7-M13-Fwd/pKSV7-M13-Rev进行菌落PCR验证，无条带，说明质粒已丢失，突变株构建成功。经测序验证已经完成基因敲除，并将该缺失株命名为Δlmo1609。

2.2.2 单增李斯特菌lmo1609回补株的构建及筛选验证

根据CΔlmo1609重组质粒构建方法，将构建好的回补质粒pSL2154电转化入Δlmo1609感受态细胞，使用引物pSL2154-Fwd-BamH Ⅰ/ pSL2154-Rev-Sac Ⅰ扩增菌落，得到CΔlmo1609重组质粒目的片段436 bp (图 3B)，与预期的lmo1609启动子区和回补的lmo1609 CDS区大小相符。经测序验证正确后命名为CΔlmo1609。

2.3 Δlmo1609的体外生物学功能研究 2.3.1 单增李斯特菌生长能力分析

将单增李斯特菌EGD-e、Δlmo1609和CΔlmo1609转接至BHI液体培养基中培养12 h，每小时取200 μL培养液于OD₆₀₀处进行吸光值测定，并绘制如图 4A所示生长曲线，结果发现Δlmo1609缺失株的生长速率与野生株和回补株相似，无显著差异，表明lmo1609基因缺失不影响单增李斯特菌生长。

2.3.2 单增李斯特菌运动性分析

配制半固体琼脂培养基，利用半固体琼脂扩散试验验证Δlmo1609缺失株、CΔlmo1609回补株以及野生株在体外的运动能力是否发生变化。结果如图 4B所示，在30 ℃静置培养条件下，Δlmo1609缺失株在24 h及48 h的运动扩散面积较野生株EGD-e分别下降75%和33%，回补株CΔlmo1609在24 h及48 h的运动扩散面积未恢复至野生株水平，推测该基因存在更为复杂的调控方式来影响细菌的运动能力。

2.4 Δlmo1609的氧化应激功能研究

细菌的生长与外界环境息息相关，为验证Lmo1609是否有抗氧化应激能力，利用不同氧化剂：5 mmol/L H₂O₂、0.5 mmol/L Cu²⁺、1 mmol/L Cr²⁺和1 mmol/L肼，在相同的培养条件下进行氧化应激试验。最后通过稀释点板对其生长能力进行分析。结果如图 5所示，在以H₂O₂为氧化剂的应激平板上，菌液稀释至10^–4、10^–5和10^–6时，可见缺失株Δlmo1609的菌落数比野生株多，表明lmo1609基因缺失后，单增李斯特菌对氧化剂H₂O₂的应激能力增强。对氧化剂Cu²⁺、Cr²⁺和肼的应激能力显示，lmo1609基因突变后，细菌菌落数没有明显改变，只是在低稀释度时缺失株的菌落形态较野生株增大，结合lmo1609基因缺失不影响细菌生长速率但是减弱其运动能力这一结果提示lmo1609基因有可能通过影响单增李斯特菌鞭毛运动进而影响了细菌菌落扩散。回补株CΔlmo1609对氧化剂的应激能力未恢复至野生株水平，推测lmo1609基因通过整合回补至基因组后涉及更为复杂的调控网络来影响细菌的氧化应激能力。

2.5 Δlmo1609的感染生物学功能研究

Caco-2和RAW264.7细胞是研究单增李斯特菌在肠道上皮细胞黏附、侵袭以及在巨噬细胞内增殖能力较为理想与经典的细胞模型^[19]。通过计算不同时间点感染细胞的细菌量，分析细菌在细胞中的黏附、侵袭与增殖能力。结果如图 6所示，Δlmo1609株、回补株和野生株EGD-e在感染Caco-2细胞0.5 h和1.5 h时均未有显著差异(P > 0.05)。在细菌感染RAW264.7细胞2、6、12 h后统计各菌株在巨噬细胞中的增殖数量，发现缺失株在RAW264.7细胞中的增殖能力与野生株相比无显著差异(P > 0.05)，表明lmo1609基因缺失不影响单增李斯特菌对细胞的黏附、侵袭和增殖能力。

2.6 Δlmo1609对小鼠的致病力分析 2.6.1 Δlmo1609对单增李斯特菌在ICR小鼠脏器内的增殖能力的影响

细菌在ICR小鼠肝脏和脾脏中的定殖量如图 7所示，使用GraphPad Prism对结果进行了输入、整理和输出，经t-test检验进行结果分析，发现细菌感染小鼠24 h和48 h后，Δlmo1609缺失株在肝脏和脾脏中的细菌量与野生株相比无显著差异(P > 0.05)。

2.6.2 Δlmo1609在ICR小鼠体内的存活试验

经腹腔注射的方式感染小鼠，每只小鼠接种约4×10⁶ CFU的菌量，观察并记录小鼠在7 d内的死亡情况，结果如图 8所示，与野生株相比，缺失株Δlmo1609和回补株CΔlmo1609对小鼠的致病力没有明显差异(P > 0.05)，结合细胞试验及定殖试验结果，可确定lmo1609基因的缺失不影响单增李斯特菌的致病力。

2.7 单增李斯特菌Lmo1609蛋白酶学活性的测定 2.7.1 蛋白表达与纯化

经PCR鉴定和Sanger测序验证，蛋白表达载体pSL065构建成功，经过IPTG体外诱导表达、细胞破碎和镍柱亲和层析获得了重组蛋白Lmo1609。将分离纯化的蛋白稀释成不同浓度进行SDS-PAGE，结果如图 9A所示，可见一条与目的蛋白理论分子量大小(11.7 kDa)基本一致的主蛋白条带，表明蛋白表达成功。进一步使用Western blotting方法验证Lmo1609蛋白的表达，如图 9B所示，在11.7 kDa处发现该蛋白与多克隆抗体的反应强度随着蛋白浓度的增加而增强，反应条带与SDS-PAGE一致，可以满足蛋白酶学活性测定需要。图 9B中在大约25 kDa处显示有一Western blotting的反应条带，根据抗体的专一性和特异性，可以认为这一条带应是重组蛋白Lmo1609的二聚体。

2.7.2 Lmo1609还原酶学活性测定

采用经典的胰岛素二硫键还原试验，首先是使用不同浓度的重组蛋白催化浓度为150 μmol/L的胰岛素，以还原酶学活性较高的硫氧还蛋白TrxA为阳性对照，以仅加胰岛素的组别为阴性对照。由于反应体系中含有DTT，随着反应时间的增加胰岛素逐渐被还原(空白对照组)，但是该进程非常缓慢。随着加入的Lmo1609蛋白浓度的增加，相同时间点测得的OD₆₅₀数值越高，表明随着Lmo1609蛋白浓度增加，胰岛素被还原的程度增加，其中10 μmol/L Lmo1609还原的胰岛素的量最多(图 10A)。为进一步分析该酶的催化活性，选择10 μmol/L Lmo1609蛋白催化底物浓度分别为15、30、60、90和120 μmol/L的胰岛素，观察Lmo1609蛋白在150 min内催化胰岛素还原的能力，结果如图 10B所示。当胰岛素浓度为15 μmol/L和30 μmol/L时，检测到的OD₆₅₀增加的数值较低，且随着检测时间的增加，OD₆₅₀数值未有明显变化，说明底物量较少时，Lmo1609瞬间就可以将胰岛素催化完全；当胰岛素浓度为60 μmol/L时，在10 min时，OD₆₅₀基本就达到最高值；而随着胰岛素浓度进一步增加，Lmo1609需要经过一段时间才能催化底物完全还原，所以不同底物浓度呈现出的反应曲线不尽相同。结果表明，在体外单增李斯特菌Lmo1609重组蛋白可以将含有二硫键的氧化型胰岛素还原，因此该蛋白具有硫氧还蛋白还原酶活性。

3 讨论与结论

本研究构建了lmo1609基因缺失株、回补株及表达菌株，并通过分子生物学、应激生物学和细胞生物学等手段，分析了Lmo1609蛋白的酶学活性，比较了野生株和突变株在体外生长、运动、抗氧化应激、细胞黏附、侵袭和增殖及对ICR小鼠致病性等方面的生物学差异。结果显示，Lmo1609具有硫氧化蛋白的还原酶学活性，缺失lmo1609后细菌的运动性降低、抵抗H₂O₂的氧化应激能力增强。表明硫氧还蛋白Lmo1609在细菌运动、抗H₂O₂氧化应激及毒力方面发挥着不同的作用，为丰富硫氧还蛋白功能，深入研究硫氧还蛋白介导应激和感染的作用机制奠定了基础。

本研究证实了缺失lmo1609不影响单增李斯特菌的生长速率，但在30 ℃时能使细菌运动性降低。本实验室前期研究表明，与Lmo1609同样具有氧化还原酶学活性的其他氧化还原蛋白DsbA、TrxA和YjbH等的缺失均会影响细菌运动能力^[20]，由此，我们推测Lmo1609影响了鞭毛相关基因的表达。其中TrxA与鞭毛关键蛋白MogR之间存在互作，且TrxA缺失后影响鞭毛基因fliG、fliE等基因的转录与翻译^[12]。除了已经报道的鞭毛相关合成蛋白，相对于革兰氏阴性菌，单增李斯特菌鞭毛形成的具体机制尚不明确^[21]。有研究表明，糖基化酶可以同时介导单增李斯特菌鞭毛运动和环境耐受，提示细菌鞭毛运动和环境耐受之间可能存在联系^[22]。因此我们推测单增李斯特菌鞭毛合成相关蛋白中含有二硫键，需要氧化还原蛋白的参与来实现鞭毛蛋白二硫键的正确定位与氧化和还原进而发挥功能。但是Lmo1609究竟影响了哪些鞭毛合成相关基因的表达还有待进一步研究。后续我们将针对包括Lmo1609在内的硫氧还蛋白在调控鞭毛基因合成及运动性中的差异机制进行深入探索，完善单增李斯特菌氧化还原蛋白在调控细菌运动行为中发挥作用的机理。

本研究已经证实单增李斯特菌Lmo1609属于硫氧还蛋白家族，具有经典的“CX₁X₂C”基序和氧化还原酶活性。CX₁X₂C基序是包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌等在内的细菌氧化还原蛋白应对氧化应激的关键活性位点^[23–25]。生物信息学分析发现Lmo1609的活性位点与硫氧还蛋白家族成员TrxA仅有一个氨基酸的差别。那么X₁X₂序列对活性位点有何影响还有待进一步研究。

因此，硫氧还蛋白通过参与维持细菌体内氧化还原平衡的机制进而参与细菌不同的生物学过程。基于本研究基础，下一步将系统探究单增李斯特菌硫氧还蛋白活性位点参与细菌酶活及调控细菌致病力过程的具体分子机制，为最终解析硫氧还蛋白系统在细菌感染宿主过程中的氧化还原修饰机制奠定基础。