2022, Vol. 62
表1(Table 1)
拮抗植物病原真菌链霉菌菌株ZH-356的鉴定及其生防评价
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220015
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 张恒, 成娟丽, 朱旭飞, 张嵩林, 闫靓文, 林金水. 2022
- ZHANG Heng, CHENG Juanli, ZHU Xufei, ZHANG Songlin, YAN Liangwen, LIN Jinshui.
- 拮抗植物病原真菌链霉菌菌株ZH-356的鉴定及其生防评价
- Identification and biocontrol evaluation of Streptomyces sp. strain ZH-356 antagonistic to plant pathogenic fungi
- 微生物学报, 62(9): 3421-3436
- Acta Microbiologica Sinica, 62(9): 3421-3436
-
文章历史
- 收稿日期：2022-01-07
- 修回日期：2022-02-12
- 网络出版日期：2022-04-01
引用本文 |
张恒, 成娟丽, 朱旭飞, 张嵩林, 闫靓文, 林金水. 拮抗植物病原真菌链霉菌菌株ZH-356的鉴定及其生防评价[J]. 微生物学报, 2022, 62(9): 3421-3436.
Zhang Heng, Cheng Juanli, Zhu Xufei, Zhang Songlin, Yan Liangwen, Lin Jinshui. Identification and biocontrol evaluation of Streptomyces sp. strain ZH-356 antagonistic to plant pathogenic fungi[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(9): 3421-3436.
拮抗植物病原真菌链霉菌菌株ZH-356的鉴定及其生防评价
1. 陕西省红枣重点实验室(延安大学), 陕西 延安 716000;
2. 延安大学生命科学学院, 陕西 延安 716000;
3. 延安柯龙尼生物科技有限公司, 陕西 延安 716000
2. 延安大学生命科学学院, 陕西 延安 716000;
3. 延安柯龙尼生物科技有限公司, 陕西 延安 716000
摘要：[目的] 对实验室分离到的菌株ZH-356进行鉴定并评价其对植物病原真菌的生物防治效果，为研发针对植物真菌病害的生防菌剂提供理论指导。[方法] 通过平板对峙法确定菌株ZH-356抗菌谱，并通过16S rRNA基因序列分析确定其种属，利用离体枝条的苹果树腐烂病菌感染预防试验和患腐烂病苹果树的防治试验评价其生防效果。[结果] 菌株ZH-356鉴定为链霉菌属，与直丝紫链霉菌(Streptomyces rectiviolaceus)相似性最高，为99.71%。抗菌谱试验表明，菌株ZH-356对苹果树腐烂病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌和番茄早疫病菌等多种植物病原真菌均具有较强的抑制作用，这种抑制作用可导致苹果树腐烂病菌菌丝变粗、交叉扭曲、分支变少且容易断裂。此外，ZH-356产生的抑菌活性物质对温度和酸碱度具有高度稳定性，并且该活性物质只存在于其胞内，只有当ZH-356遇到植物病原真菌时才会被分泌出来以抑制它们的生长。在离体枝条的苹果树腐烂病菌感染预防试验中，ZH-356对苹果树腐烂病防效可达94%以上，而在患腐烂病苹果树的防治试验中，ZH-356菌制剂对苹果树腐烂病的防效高达100%。[结论] 链霉菌ZH-356抑菌谱广，对多种植物病原真菌均具有良好的拮抗活性，可作为防治植物真菌病害的生防菌株，为基于ZH-356菌株的生防菌剂的开发和防治苹果树腐烂病等植物真菌病害奠定了基础。
关键词：链霉菌 16S rRNA 抑菌活性 稳定性 苹果树腐烂病 生物防治
Identification and biocontrol evaluation of Streptomyces sp. strain ZH-356 antagonistic to plant pathogenic fungi
1. Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube (Yan'an University), Yan'an 716000, Shaanxi, China;
2. School of Life Sciences, Yan'an University, Yan'an 716000, Shaanxi, China;
3. Yan'an Kelongni Biological Technology Co., Ltd, Yan'an 716000, Shaanxi, China
2. School of Life Sciences, Yan'an University, Yan'an 716000, Shaanxi, China;
3. Yan'an Kelongni Biological Technology Co., Ltd, Yan'an 716000, Shaanxi, China
Abstract: [Objective] To identify the laboratory-isolated strain ZH-356 and evaluate its biocontrol effect on plant pathogenic fungi, so as to provide theoretical guidance for the development of biocontrol agents against plant fungal diseases. [Methods] The antimicrobial spectrum of strain ZH-356 and its species were determined by the plate confrontation assay and 16S rRNA gene sequence analysis, respectively. The biocontrol effect of strain ZH-356 was evaluated by the infection prevention test of Valsa mali on isolated apple tree branches and the control test of apple valsa canker. [Results] Strain ZH-356 was identified as Streptomyces and had the highest similarity with Streptomyces rectiviolaceus at 99.71%. The antimicrobial spectrum test showed that strain ZH-356 exerted strong inhibitory effect on a variety of plant pathogenic fungi, such as V. mali, Fusarium graminearum, Bipolaris sorokinianum and Alternaria solani, which could lead to the thickening, cross-twisting, infrequent branching and easy fracture of the mycelia of V. mali. In addition, the antimicrobial active substance produced by strain ZH-356 was highly stable to temperature and pH, which only existed in its cells and was secreted in the presence of plant pathogenic fungi to inhibit their growth. In the prevention test of apple valsa canker, strain ZH-356 controlled more than 94% of V. mali infection, and in the control test of apple valsa canker, ZH-356 agents had 100% control of apple valsa canker. [Conclusion] Strain ZH-356 has a wide antimicrobial spectrum and good antagonistic activity against plant pathogenic fungi. It can be used as a biocontrol strain against plant fungal diseases, laying a foundation for the development of ZH-356-based biocontrol agents and the control of plant fungal diseases such as apple valsa canker.
Keywords:
Streptomyces 16S rRNA antimicrobial activity stability apple valsa canker biological control
真菌是造成植物病害的罪魁祸首之一[1]，给农业带来了重大损失，如锈病、黑穗病、腐烂病、枯萎病、炭疽病等植物病害[2–8]。目前对于植物真菌病害主要通过使用化学杀菌剂来控制，如氨基苯并咪唑、邻苯二甲酰亚胺[9]。然而，长期使用已导致植物病原真菌对化学杀菌剂产生了耐药性[10]。此外，化学杀菌剂的长期使用也可能导致严重的食品和环境污染[11–13]。这些都严重制约了化学杀菌剂的使用。因此，寻找高效安全的植物真菌病害防治方法已经迫在眉睫。生物防治具有无毒、无污染、不易产生抗性等优点，已成为多种植物真菌病害的安全有效防治方法之一。近年来，使用微生物制作生防制剂对植物真菌病害进行防治，受到越来越多的关注。
尽管生防制剂在商业上得到规模而广泛的使用依然有限，但许多科学报告表明，有益微生物具有被开发成生防制剂的潜力。放线菌作为一种具有丰富资源的生防微生物类群，能够产生种类繁多的拮抗活性次级代谢产物[14]，在农业生物灾害预防和控制中发挥着重要作用[15]。如棕榈链霉菌CMU-AB204Tex作为潜在的生防菌剂用于预防棕榈基部茎腐病[16]；来自于秦岭地区的苹果树内生菌极长链霉菌SL01对苹果树腐烂病具有生物防治的潜力[17]；灰霉病菌是一种攻击许多植物(如烟草和番茄)的病原体，由球形链霉菌JK-1产生的挥发性有机化合物具有极好的抗灰霉病菌活性[18]。同时，由灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)制成的商品化生物杀真菌剂MYCOSTOP®用于防治通过种子和土壤传播的由镰刀菌、疫霉菌、链格孢菌和腐霉菌引起的植物真菌病害；由利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)菌株WYEC108制成的商品化生物杀菌剂产品Actinovate®则可抑制根腐病、猝倒真菌和其他叶面真菌病原体[19–20]。而链霉菌对植物病原真菌的拮抗作用可能是通过水解植物病原真菌的细胞壁而造成的[21–22]。
中国是全球苹果生产大国，已形成了多个产区，其种植面积和产量均占全球50%左右[23]。然而，我国苹果单位面积产量明显低于美国、意大利等发达国家，造成我国苹果单产水平不高的重要原因之一是病害的严重发生[24]。由苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)引起的苹果树腐烂病是危害我国苹果生产的毁灭性病害之一[25]，并且苹果树腐烂病发病率高达52.5%，严重时其死亡率为5%[26]。目前已经有许多利用生物防治的方法防治苹果树腐烂病的报道。如，薛应钰等分离筛选出的娄彻氏链霉菌对苹果树腐烂病菌有抑制作用[27]；Li等分离自黄瓜根部的内生放线菌Hhs.015可以在苹果树皮内部定殖，并且对苹果树腐烂病菌有抑制作用[28]；张清明等从健康的苹果枝条中分离到的卡伍尔链霉菌菌株A-2对苹果树腐烂病菌具有极高的抑制率[29]。然而，目前将生防菌菌剂在田间用于苹果树腐烂病的防治依然少见，主要有2方面原因：一是因为生防菌的种类及数量相对较少，限制了生防菌菌剂的开发和利用；二是外来菌种无法适应实际环境，不能在植物上有效定殖[30]。本研究对一株分离自枣树枝条的拮抗植物病原真菌的ZH-356生防菌株的抑菌及生防特性进行研究，以期为基于ZH-356菌株的生防菌剂的开发和防治苹果树腐烂病等植物真菌病害提供指导。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂 1.1.1 菌株供试菌株ZH-356是从枣树枝条中分离得到的，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. M2020690。供试病原真菌苹果树腐烂病菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokinianum)和番茄早疫病菌(Alternaria solani Sorauer)由延安大学生命科学学院病害绿色防控研究室提供。
1.1.2 实验试剂胰蛋白胨、酵母提取物(OXOID公司)，天冬酰胺、甜菜碱(索莱宝)，丙酮、丙三醇、甲醇(天津市富宇精细化工有限公司)，无水乙醇(天津市天力化学试剂有限公司)，其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基菌株形态特征观察采用高氏Ⅰ号培养基；培养特征观察采用高氏Ⅰ号培养基、M1培养基、LB培养基和TSB培养基；菌种鉴定采用高氏Ⅰ号培养基；拮抗试验采用PDA培养基。
M1培养基(g/L)：天冬酰胺1，酵母浸膏粉5，甘油10，KNO3 5，甜菜碱1.25，琼脂粉12，使用双蒸水定容至1 L，pH 7.2。
PDA培养基(g/L)：去皮马铃薯200，葡萄糖20，琼脂粉15，使用双蒸水定容至1 L，pH 7.2。
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂粉15，使用双蒸水定容至1 L，pH 7.2。
高氏Ⅰ号培养基(g/L)：可溶性淀粉20，KNO3 1，K2HPO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，琼脂粉15，使用双蒸水定容至1 L，pH 7.2–7.4。
TSB培养基(g/L)：胰蛋白胨大豆肉汤20，琼脂粉15，使用双蒸水定容至1 L，pH 7.2。
上述所有培养基均于121 ℃灭菌20 min。
1.2 菌株ZH-356的鉴定 1.2.1 分子鉴定采用16S rRNA基因序列分析方法，用酚氯仿抽提法[31]提取菌株ZH-356的总DNA，采用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′)进行PCR扩增。反应体系50 µL，包含：1 µL TransTaq-T DNA Polymerase，正反引物各2 µL，5 µL DNA模板，4 µL dNTPs (2.5 mmol/L)，5 µL 10×TransTaq-T Buffer，31 µL ddH2O。PCR扩增反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，31个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增结束后，将PCR产物利用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测；将经纯化回收约1 400 bp的PCR产物与载体pMD19-T连接后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞；挑取阳性转化子送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序；获得该菌株ZH-356的16S rRNA基因序列，将该序列在EzTaxon (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)上进行序列相似性搜索和比对，再利用BioEdit和MEGA X64软件最大似然法构建系统发育树，从而确定该菌株的进化位置[32]。
1.2.2 培养特征与形态特征观察培养特征观察参照《链霉菌分类和鉴定》[33]等方法。将菌株ZH-356分别在高氏Ⅰ号培养基、M1培养基、LB培养基和TSB培养基平板上划线或液体培养基中培养，28 ℃培养7 d，逐日观察并记录该菌株的气生菌丝、基生菌丝颜色、可溶性色素的有无及生长状况等特征。
形态特征观察采用插片法[34]，在油镜下观察菌丝形态、孢子特征并拍照。将菌株ZH-356划线接种到高氏Ⅰ号培养基上，将无菌的盖玻片斜45°插入培养基，每个培养皿插入3片，28 ℃、相对湿度为50%的条件下黑暗培养7 d后，观察菌株ZH-356的菌丝及孢子形态。
1.3 菌株ZH-356抑菌谱的测定采用平板对峙培养法[35]。将菌株ZH-356于高氏Ⅰ号固体培养基上28 ℃培养4–6 d，备用。将供试植物病原真菌分别在PDA培养基上培养4–6 d后，备用。将菌株ZH-356和供试植物病原真菌用无菌打孔器均打制成菌饼(直径为5 mm)，将4种供试植物病原真菌的菌饼菌面朝下紧贴于PDA平板(直径90 mm)中央，再在其四侧对称25 mm处分别放置ZH-356菌饼，菌面朝下紧贴于PDA平板，25 ℃培养4–6 d，用十字交叉法[36]测量抑菌圈直径的大小，计算抑制率，每个处理重复3次，取平均值。以测定抑菌圈直径为指标确定其抑菌活性。
抑制率(%)=(对照菌落直径−处理菌落直径)/(对照菌落直径−菌饼直径)×100。
1.4 菌株ZH-356的发酵培养及发酵液活性提取物的制备 1.4.1 种子培养菌株ZH-356接种于高氏Ⅰ号固体培养基上，28 ℃培养4–6 d后，挑取单菌落接种至TSB培养基中，28 ℃、200 r/min振荡培养3 d，得到种子液。
1.4.2 发酵培养将得到的种子液接入M1液体培养基中，接种量为1%，28 ℃、200 r/min振荡培养7 d，得到发酵液。
1.4.3 活性物质提取、浓缩将得到的发酵液通过离心，分别收集发酵上清液及菌体；上清液经0.22 µm无菌微孔滤膜过滤后加入1–2倍体积的丙酮，然后使用旋转蒸发仪浓缩去除绝大部分溶剂后，即得到上清提取物；菌体用丙酮浸泡1 d，离心收集丙酮提取液，而离心后的沉淀再次用丙酮浸泡，并用超声波辅助提取，离心收集丙酮提取液(重复3次，直至丙酮提取液变为无色透明)，合并丙酮提取液，使用旋转蒸发仪浓缩后，即得到胞内提取物；将得到上清提取物和胞内提取物合并，即为发酵液活性提取物，置于4 ℃保存。
1.4.4 发酵液活性提取物活性检测采用平板对峙培养法[35]和滤纸片法[37]。将发酵液活性提取物用甲醇溶解，备用。将供试植物病原真菌用无菌打孔器均打制成菌饼(直径为5 mm)，将4种供试植物病原真菌的菌饼菌面朝下紧贴于PDA平板(直径90 mm)中央，菌面朝下紧贴于PDA平板，再在其四侧对称25 mm处分别放置无菌滤纸片(4 mm)，在滤纸片上添加10 µL的发酵液活性提取物，待滤纸片晾干后，25 ℃培养4–6 d，用十字交叉法[36]测量抑菌圈直径的大小，计算抑制率，每个处理重复3次，取平均值。以测定抑菌圈直径为指标确定其抑菌活性。
抑制率(%)=(对照菌落直径−处理菌落直径)/(对照菌落直径−菌饼直径)×100。
1.5 菌株ZH-356抑菌活性物质的分泌测试按1.4.3的方法分别制备上清提取物和胞内提取物，采用杯碟法对上清提取物和胞内提取物进行真菌拮抗实验。在PDA平板中心位置接种倒置的供试真菌菌饼(d=5 mm)，使用灭菌后的打孔器(d=5 mm)在距离中心点25 mm处均匀打3个孔，分别加入200 µL的上清提取物和胞内提取物，以丙酮为对照，供试真菌为苹果树腐烂病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌和番茄早疫病菌，25 ℃正置培养，每个处理设3个重复。
1.6 菌株ZH-356胞内活性提取物的稳定性测试制备PDA平板，用对称法在PDA平板背面做标记，平板中心位置接种倒置的供试真菌菌饼(d=5 mm)，菌饼两侧25 mm处使用灭菌后的打孔器(d=5 mm)打孔。将菌株ZH-356的胞内活性提取物用80%甲醇溶解，以苹果树腐烂病菌为指示菌，将胞内活性提取物质分别在50、60、70、80、90、100 ℃温度下处理30 min；使用1 mol/L HC1和1 mol/L NaOH将胞内活性提取物的pH值分别调至2、4、6、8、10、12等，以1 mol/L HC1和1 mol/L NaOH作为对照，每孔各添加200 µL样品，25 ℃正置培养，每个处理设3个重复，进行胞内活性提取物的稳定性分析[38]。
1.7 菌株ZH-356的菌体及胞内活性提取物对苹果树腐烂病的防效测定 1.7.1 离体枝条的苹果树腐烂病菌感染预防试验参照烫伤接种法[34]测定菌株ZH-356对苹果树离体枝条感染苹果树腐烂病菌的预防作用。采集多年生“富士”苹果枝条若干(d=15–20 mm)，截成25 cm长的枝段，先用自来水冲洗枝条接着用75%酒精消毒10 min，最后用无菌水冲洗3遍，两端口封蜡。用烧红的铁钉帽(d=5 mm)烫伤枝条，在烫伤处分别涂抹菌株ZH-356的菌体或其胞内活性提取物原液、2、5、10、20、50和100倍稀释液，晾干后接种培养5 d的苹果树腐烂病菌菌饼(d=5 mm)，每个枝条1个接种点，每组处理重复5个枝条，以涂抹无菌水做对照。25 ℃黑暗保湿培养，7 d后采用十字交叉法测量病斑长度，计算病斑面积及防效。计算公式为：病斑面积=1/4×π×病斑长径×病斑短径；防病效果=(对照病斑面积–处理病斑面积)/对照病斑面积×100%。
1.7.2 盆栽苹果树苗感染苹果树腐烂病菌后的防治试验软膏菌剂制备：称取水杨酸0.1 g，用少量无水乙醇溶解，称取阿拉伯树胶40 g，甘油5 g，H2O 120 mL，混合后充分搅拌使其溶解，得到基质。将基质中的水换成菌株ZH-356的发酵液，则制备成软膏菌剂。室温储存，备用。
参照烫伤接种法[34]测定菌株ZH-356对盆栽苹果树苗感染苹果树腐烂病菌后的防治效果。盆栽3年生矮化的“富士”苹果树，待其长出新绿叶后开始实验。
制备苹果树腐烂病菌菌饼：将在PDA固体培养基上培养5 d的苹果树腐烂病菌制成菌饼(d=5 mm)，备用。
用烧红的铁钉帽(d=5 mm)烫伤苹果树苗枝干，在烫伤处接种培养5 d的苹果树腐烂病菌菌饼(d=5 mm)，用保鲜膜固定菌饼，每棵树苗设3个接种点，采用透明的塑料袋(60 cm×90 cm)整体套住苹果树苗，自然光照下室温培养，等待苹果树腐烂病菌侵染苹果树，在此期间每天向苹果树喷洒水，使密封环境充分保湿。
苹果树腐烂病菌接种伤口5 d后，侵染成功，形成典型的腐烂病病斑。接下来将被侵染的部位用刀片刮去表皮，将被感染的苹果树分为3组，第一组不做任何处理(空白对照组)，第二组向侵染部位涂抹基质(基质组)，第三组向侵染部位涂抹软膏菌剂，涂抹后，自然光照下室温培养，每10 d涂抹1次，30 d后观察记录防治效果。
1.8 统计分析所有试验至少有3个平行并且独立重复2次，所有数据均表示为平均值±标准偏差。用Adobe Illustrator 2020软件(Adobe)作图，用GraphPad Prism version 5.00软件(GraphPad software Inc.)的Dunnett-t新复极差法进行差异显著性分析。
2 结果与分析 2.1 菌株ZH-356的鉴定 2.1.1 形态特征和培养特征观察分离自枣树枝条的菌株ZH-356的形态特征和培养特征如下：(1) 形态特征：经过插片法培养7 d后，将盖玻片取出，置于载玻片上，在油镜下进行观察，发现菌株ZH-356的孢子丝纤细、分支多；孢子卵圆形呈荧光绿色(图 1A−C)。(2) 培养特征：菌株ZH-356在高氏Ⅰ号固体培养基上的菌落密集成褶皱状，如图 1D1所示。菌株培养2 d时呈白色，7 d左右变为黑色，菌体绒毛状，坚实、干燥，质地致密而不易挑起，可产生黑色素，使菌落和培养基变黑；在TSB固体培养基上的菌落如图 1D2所示，较小而不蔓延，呈圆形、光平、黄色、菌落起初表面光滑、后面逐渐形成褶皱，犹如四叶草形，菌落坚实、质地致密而不易挑起；在LB固体培养基上的菌落如图 1D3所示，菌落较大，呈圆形，黄色，表面具有微绒毛，质地坚硬而不易挑起；在M1固体培养基上的菌落如图 1D4所示，菌落较小而密集，不产生黑色素，起初表面光滑，后表面具微绒毛，且逐渐形成褶皱，形如四叶草，菌落坚硬而不易被挑起。在不同液体培养基中生长形态也不同，结果如图 1E所示。图 1E1是菌株ZH-356在高氏Ⅰ号液体培养基中的生长状况，图 1E2是菌株ZH-356在TSB液体培养基中生长状况，图 1E3是菌株ZH-356在LB液体培养基中的生长状况，图 1E4是菌株ZH-356在M1液体培养基中的生长状况。培养3 d时，菌株ZH-356在高氏Ⅰ号液体培养基中开始产生色素，到7 d时产生的色素完全变黑，致使培养基变为黑色；培养5 d时，菌株ZH-356在M1液体培养基中开始产生色素，到7 d时产生的色素变为黑褐色，导致培养基变为黑褐色。即菌株ZH-356能在高氏Ⅰ号液体培养基和M1液体培养基的发酵培养后期会产生色素，且色素颜色分别为黑色和黑褐色，导致培养液变成黑色和黑褐色，而在TSB和LB中则不会产生黑色素。
|
| 图 1 菌株ZH-356培养和形态观察 Figure 1 Culture and morphological observation of strain ZH-356. A: coverslip culture; B: spore producing chains; C: spore; D: solid culture; E: liquid culture. 1: Gauze's medium No.1; 2: TSB medium; 3: LB medium; 4: M1 medium. |
2.1.2 分子鉴定分析
菌株ZH-356的16S rRNA基因序列经过生工生物工程(上海)股份有限公司测序，其16S rRNA基因序列有效长度为1 374 bp (国家微生物科学数据中心核酸序列编号：NMDCN0000RCC)。将该序列在EzTaxon上进行序列相似性搜索和比对发现，该菌株与链霉菌属(Streptomyces)菌株具有非常高的相似度，说明该菌株为链霉菌属中的一员。利用BioEdit和MEGA X64软件最大似然法构建系统发育树，发现菌株ZH-356与直丝紫链霉菌(Streptomyces rectiviolaceus NRRL B-16374T)位于系统进化树上的同一分枝，它们的序列同源性最高为99.71% (图 2)，表明它们的亲缘关系最近。因此，结合形态特征和培养特征将ZH-356菌株鉴定为链霉菌，命名为链霉菌ZH-356 (Streptomyces sp. ZH-356)。
|
| 图 2 基于16S rRNA基因序列构建的菌株ZH-356系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree of strain ZH-356 constructed based on 16S rRNA gene sequences. Numbers in parentheses are GenBank or National Microbiology Data Center accession numbers; values above the branches are parsimony bootstrap; the value on the scale represents each nucleotide sites replacement value. |
2.2 菌株ZH-356抑菌谱的鉴定
通过平板对峙法检测链霉菌ZH-356的菌体和发酵液活性提取物对4种供试植物病原真菌的拮抗活性，发现链霉菌ZH-356的菌体和发酵液活性提取物对4种供试植物病原真菌均具有明显的抑制作用(图 3)。其中链霉菌ZH-356的菌体和发酵液活性提取物对苹果树腐烂病菌抑制率最大，分别为95.01%±0.49%和95.64%±0.36%，对番茄早疫病菌抑制率最小，分别为85.85%±1.01%和87.87%±0.65%。
|
| 图 3 菌株ZH-356抗丝状真菌谱的分析 Figure 3 Analysis of resistance spectrum of strain ZH-356 to filamentous fungi. A: Valsa mali; B: Bipolaris sorokinianum; C: Fusarium graminearum; D: Alternaria solani. 1: antagonistic effect of strain ZH-356 on plant pathogenic fungi; 2: antagonistic effect of active extracts of strain ZH-356 on plant pathogenic fungi; 3: culture of plant pathogenic fungi as control. |
2.3 菌株ZH-356抑菌活性物质的分泌测试
前面结果表明，链霉菌ZH-356的发酵液活性提取物对于植物病原真菌具有明显的抑制作用，但不清楚链霉菌ZH-356发酵产生的抑菌活性物质能否分泌到胞外。为此，本研究将发酵液的上清和菌体分开并分别提取和浓缩，通过拮抗实验进行抑菌活性评价，结果如图 4所示，与溶剂对照一样，上清提取物对供试真菌无明显的拮抗作用，而胞内提取物则对供试真菌显示出极强的拮抗作用。同时，由于发酵液经0.22 µm无菌微孔滤膜过滤后得到的无细胞上清液对供试真菌也无显著的拮抗作用(图片未展示)，这排除了溶剂丙酮的浓缩作用对上清液活性的影响。因此，这些结果表明在发酵培养期间链霉菌ZH-356所产生的抑菌活性物质只在胞内积累，并不会分泌至胞外。
|
| 图 4 菌株ZH-356抑菌活性物质的分泌检测 Figure 4 Secretion detection of antagonistic active substances in strain ZH-356. A: Valsa mali; B: Bipolaris sorokinianum; C: Fusarium graminearum; D: Alternaria solani. 1: solvent control; 2: supernatant extract of strain ZH-356; 3: intracellular extract of strain ZH-356. |
2.4 菌株ZH-356胞内活性提取物的稳定性测试
在农业上所使用的生物制剂都有许多特点，其中稳定性备受大家关注，因为良好的稳定性是生物制剂被推广使用的必备条件之一。为此，本研究探究了链霉菌ZH-356的胞内活性物质的稳定性，结果如表 1所示。链霉菌ZH-356的胞内活性提取物经过不同温度处理后，其活性依旧存在，且活性大小没有发生显著变化。在不同pH中，只有pH≤4时胞内活性提取物的拮抗活性才明显降低，其余pH范围下其活性不受影响，表明链霉菌ZH-356的胞内活性物质的抑菌活性对温度和酸碱性的变化不敏感。
表 1. 胞内活性提取物在不同温度和pH下的稳定性
Table 1. The stability of intracellular active extracts of strain ZH-356 at different temperatures and pH
| T/℃ | Antimicrobial activity | pH | Antimicrobial activity |
| 25 | +++ | 2 | ++ |
| 50 | +++ | 4 | ++ |
| 60 | +++ | 6 | +++ |
| 70 | +++ | 8 | +++ |
| 80 | +++ | 10 | +++ |
| 90 | +++ | 12 | +++ |
| 100 | +++ | CK1 (1 mol/L HCl) | – |
| ND | ND | CK2 (1 mol/L NaOH) | – |
| +++: strong antimicrobial activity; ++: moderate antimicrobial activity; –: no antimicrobial activity; ND: no data. | |||
2.5 菌株ZH-356对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响
前面的结果显示，菌株ZH-356对植物病原真菌具有广谱的抑菌活性，但是不清楚这种抑菌作用是否直接对植物病原真菌的菌丝造成影响。因此本研究以苹果树腐烂病菌为供体菌，探究菌株ZH-356拮抗苹果树腐烂病菌时对其菌丝形态的影响。2种菌对峙培养后，挑取因ZH-356菌株拮抗形成的抑菌圈边缘处的苹果树腐烂病菌菌丝于显微镜下观察，以非对峙面正常生长的菌丝作为对照。结果如图 5所示，与正常生长的苹果树腐烂病菌菌丝相比(图 5A)，受ZH-356菌株拮抗后的菌丝变得更粗、交叉扭曲、分支变少且容易断裂(图 5B−D)。说明菌株ZH-356的拮抗作用改变了苹果树腐烂病菌的菌丝形态。
|
| 图 5 对峙培养中菌株ZH-356对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响 Figure 5 Effects of strain ZH-356 on the mycelial morphology of Valsa mali during confrontation culture. A: mycelial morphology of Valsa mali in non-confronting area; B–D: mycelial morphology of Valsa mali in confronting area. |
2.6 菌株ZH-356对苹果树腐烂病的防效测定 2.6.1 菌株ZH-356对苹果树离体枝条感染苹果树腐烂病菌的预防作用
为了从体内研究链霉菌ZH-356对植物真菌病害的防治效果，我们首先以苹果树腐烂病菌的苹果树离体枝条侵染模型来分析链霉菌ZH-356对苹果树腐烂病的预防效果，结果如图 6、表 2和表 3所示。预先涂抹链霉菌ZH-356的菌体能够有效预防苹果树腐烂病病菌对苹果树离体枝条的侵染，从而有效地抑制苹果树离体枝条上腐烂病病斑的扩展，防病效果达到94.30% (图 6A和表 2)。同样，预先涂抹链霉菌ZH-356的胞内活性提取物也能够有效预防苹果树腐烂病病菌对苹果树离体枝条的侵染，从而有效地抑制苹果树离体枝条上腐烂病病斑的扩展，其中胞内活性提取物原液、2倍和5倍稀释液在离体枝条上对苹果树腐烂病的预防效果分别达到94.84%，94.59%和93.99%，当稀释倍数达到20倍时依然有超过80%的预防效果(图 6B和表 3)，暗示链霉菌ZH-356产生的抑菌活性物质的效价较高。
|
| 图 6 菌株ZH-356预防苹果树离体枝条感染苹果树腐烂病菌的作用 Figure 6 Effect of strain ZH-356 on prevention of apple tree branches infection with Valsa mali. A: apple tree branches were pretreated with or without strain ZH-356; B: apple tree branches were pretreated with intracellular extracts of strain ZH-356 at different concentrations. |
表 2. 菌株ZH-356的菌体在离体枝条上对苹果树腐烂病的预防效果
Table 2. Effect of the cells of strain ZH-356 on prevention of apple tree branches infection with Valsa mali
| Strain | Average length of lesions/mm | Average lesion widths/mm | Lesion area/mm2 | Disease prevention effect/% |
| ZH-356 | 8.67±0.58b | 8.03±0.10b | 69.33±4.62b | 94.30±0.38 |
| CK | 44.67±7.09a | 26.67±5.69a | 954.29±343.99a | |
| Data with the different lowercase letters in the same column indicate significant difference at P < 0.05 level. | ||||
表 3. 菌株ZH-356的胞内活性提取物在离体枝条上对苹果树腐烂病的预防效果
Table 3. Effect of intracellular extracts of strain ZH-356 on prevention of apple tree branches infection with Valsa mali
| Strain | Diluted times | Average length of lesions/mm | Average lesion widths/mm | Lesion area/mm2 | Disease prevention effect/% |
| ZH-356 | 1 | 8.50±0.50f | 6.67±0.58e | 44.35±2.18f | 94.84±0.25a |
| 2 | 8.83±0.76f | 6.67±0.58e | 46.45±7.71f | 94.59±0.90a | |
| 5 | 8.50±1.80f | 7.67±0.58de | 51.55±13.78f | 93.99±1.60a | |
| 10 | 14.33±1.53e | 8.33±1.15d | 92.89±5.57e | 89.18±0.65b | |
| 20 | 16.67±1.53d | 8.33±0.29d | 115.39±8.16d | 86.57±0.95c | |
| 50 | 23.00±2.00c | 14.00±1.00c | 252.25±0.48c | 70.64±2.38d | |
| 100 | 31.33±1.53b | 20.67±1.53b | 563.37±68.04b | 40.85±4.85e | |
| CK | – | 36.00±2.65a | 30.33±1.53a | 859.05±104.49a | |
| Data with the different lowercase letters in the same column indicate significant difference at P < 0.05 level. | |||||
2.6.2 菌株ZH-356对盆栽苹果树苗感染苹果树腐烂病菌后的防治效果
前面的结果显示，链霉菌ZH-356对苹果树离体枝条上的腐烂病具有显著的预防效果，但是链霉菌ZH-356对苹果树上的腐烂病是否也具有防治效果并不确定。为此，本研究继续以苹果树腐烂病菌的盆栽苹果树苗侵染模型来分析链霉菌ZH-356对苹果树腐烂病的防治效果，结果如图 7和表 4所示。侵染了苹果树腐烂病菌的苹果树苗，经30 d的治疗处理后显示，涂抹了由链霉菌ZH-356制成的软膏菌剂后苹果树苗的存活率高达100%，而涂抹了基质的处理组和不涂抹的处理组的苹果树苗的存活率分别均仅为10%。表明由链霉菌ZH-356制成的软膏菌剂对苹果树腐烂病具有显著的防治效果。
|
| 图 7 菌株ZH-356对苹果树苗感染苹果树腐烂病菌后的防治效果 Figure 7 Control effect of strain ZH-356 on apple tree seedlings infected with Valsa mali. |
表 4. 软膏菌剂处理30 d后对苹果树腐烂病的防治效果
Table 4. Control effect of ointment agents on apple valsa canker after 30 days treatment
| Treatments | Number of infected trees | Number of dead trees | Number of surviving trees | Survival rate/% |
| Control | 20 | 18 | 2 | 10 |
| Basic material | 20 | 18 | 2 | 10 |
| Ointment agents | 20 | 0 | 20 | 100 |
3 讨论与结论
利用拮抗微生物来防治植物病害是当下的一个研究热点。本研究从枣树中筛选出一株对苹果树腐烂病具有显著抑制作用的菌株ZH-356，经培养特征观察和16S rRNA基因鉴定分析，将其鉴定为链霉菌，与直丝紫链霉菌(Streptomyces rectiviolaceus)的亲缘关系最近。
直丝紫链霉菌在自然界中广泛存在并且具有多种生物学活性。例如，Kim等发现来自韩国丹阳省土壤样品的直丝紫链霉菌DY46菌株对番茄果实灰霉病具有明显的抑制作用[39]。Taha等从土壤中分离到的直丝紫链霉菌可以促进番茄根部鲜重的增加[40]。Ma等从青藏高原紫花针茅中分离到的与直丝紫链霉菌16S rRNA基因序列99%相似性的链霉菌QZGYEb4对大肠杆菌和铜绿假单胞菌具有抗菌活性[41]。但对于直丝紫链霉菌防治苹果树腐烂病在国内外报道甚少。本研究从枣树中筛选到一株与直丝紫链霉菌16S rRNA基因序列相似性为99.71%的链霉菌ZH-356，其对丝状真菌具有广谱的抗菌活性，对苹果树腐烂病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌和番茄早疫病菌等植物病原真菌有显著的抑制效果，抑菌率均在85%以上，这种抑制作用可导致苹果树腐烂病菌菌丝变粗、交叉扭曲、分支变少且容易断裂。
本研究显示，链霉菌ZH-356不仅能预防苹果树离体枝条感染苹果树腐烂病菌，对患腐烂病的盆栽苹果树苗也具有明显的防效作用，而且其抑菌活性物质对于温度和酸碱度都具有高稳定性。同时，在发酵培养过程中，链霉菌ZH-356会产生黑色素，导致培养基变为黑褐色。黑色素是一种生物界普遍存在的，具有防止蛋白质降解、光子屏蔽、化学保护等作用，特别是对紫外线和辐射具有强的抵抗性[42–44]。比如，黑色素对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白起到明显的紫外线保护作用[45–47]，因此将多种特定的目的杀虫晶体蛋白基因导入黑色素产生菌，使得构建广谱、高效、持久生物杀虫剂成为可能。同样，微生物产生的黑色素对自身所产生的其他次级代谢物也起到保护作用[43]。因此，筛选兼具生防和产黑色素特性的微生物功能菌株在植物病害防治方面具有非常重要的经济和生态价值。此外，本研究还发现链霉菌ZH-356菌株产生的抑菌活性物质只在胞内积累，并不会分泌至胞外。然而，图 3的结果又显示链霉菌ZH-356菌体对植物病原真菌具有显著的抑制作用，这暗示只有当链霉菌ZH-356遭遇植物病原真菌时，胞内的拮抗活性物质才会被诱导分泌出来以抑制周围植物病原真菌的生长，说明链霉菌ZH-356采取了一种更为节能的策略来对抗植物病原真菌，但是链霉菌ZH-356的这种拮抗活性物质的诱导分泌机制还有待于进一步地研究解析。综上所述，链霉菌ZH-356可作为防治植物真菌病害的生防菌株，为基于ZH-356菌株的生防菌剂的开发和防治苹果树腐烂病等植物真菌病害奠定了基础。然而，尽管室内活体试验表明链霉菌ZH-356对苹果树腐烂病具有显著的防治效果，但是菌株ZH-356在植物中的长期定殖情况及其在大田中的适应能力和生防效果均尚不清楚，这些也需要进一步地研究。
References
| [1] | Yeng CM, Pahirulzaman KAK. Potential application of actinomycetes as natural fungicide. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 2021, 756(1): 012066. DOI:10.1088/1755-1315/756/1/012066 |
| [2] | Pakdeevaraporn P, Wasee S, Taylor PWJ, Mongkolporn O. Inheritance of resistance to anthracnose caused by Colletotrichum capsici in Capsicum. Plant Breeding, 2005, 124(2): 206-208. DOI:10.1111/j.1439-0523.2004.01065.x |
| [3] | Ashokvardhan T, Rajithasri A, Prathyusha P, Satyaprasad K. Actinomycetes from Capsicum annuum L. rhizosphere soil have the biocontrol potential against pathogenic fungi. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 2014, 3(4): 894-903. |
| [4] | Meng XL, Yang R, Liu AT, Hu TL, Wang YN, Cao KQ, Wang ST. The influence of lower temperature induction of Valsa mali on the infection of apple trees. Plant Disease, 2021, 105(10): 2776-2780. DOI:10.1094/PDIS-01-21-0086-SC |
| [5] | Kiani T, Mehboob F, Hyder MZ, Zainy Z, Xu L, Huang L, Farrakh S. Control of stripe rust of wheat using indigenous endophytic bacteria at seedling and adult plant stage. Scientific Reports, 2021, 11: 14473. DOI:10.1038/s41598-021-93939-6 |
| [6] | Gao YY, Ren CL, Liu Y, Zhu JM, Li BX, Mu W, Liu F. Pepper-maize intercropping affects the occurrence of anthracnose in hot pepper. Crop Protection, 2021, 148: 105750. DOI:10.1016/j.cropro.2021.105750 |
| [7] | Iannone LJ, Vignale MV, Pinget AD, Re A, Mc Cargo PD, Novas MV. Seed-transmitted Epichloë sp. endophyte alleviates the negative effects of head smut of grasses (Ustilago bullata) on Bromus auleticus. Fungal Ecology, 2017, 29: 45-51. DOI:10.1016/j.funeco.2017.06.001 |
| [8] | Drakopoulos D, Kägi A, Six J, Zorn A, Wettstein FE, Bucheli TD, Forrer HR, Vogelgsang S. The agronomic and economic viability of innovative cropping systems to reduce Fusarium head blight and related mycotoxins in wheat. Agricultural Systems, 2021, 192: 103198. DOI:10.1016/j.agsy.2021.103198 |
| [9] | Gutter Y, Shachnai A, Schiffmann-Nadel M, Dinoor A. Chemical control in Citrus of green and blue molds resistant to benzimidazoles. Journal of Phytopathology, 1981, 102(2): 127-138. DOI:10.1111/j.1439-0434.1981.tb03372.x |
| [10] | Bardas GA, Veloukas T, Koutita O, Karaoglanidis GS. Multiple resistance of Botrytis cinerea from kiwifruit to SDHIs, QoIs and fungicides of other chemical groups. Pest Management Science, 2010, 66(9): 967-973. DOI:10.1002/ps.1968 |
| [11] | Bai YB, Zhang AL, Tang JJ, Gao JM. Synthesis and antifungal activity of 2-chloromethyl-1H-benzimidazole derivatives against phytopathogenic fungi in vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(11): 2789-2795. DOI:10.1021/jf3053934 |
| [12] | Bai YB, Gao YQ, Nie XD, Tuong TM, Li D, Gao JM. Antifungal activity of griseofulvin derivatives against phytopathogenic fungi in vitro and in vivo and three-dimensional quantitative structure-activity relationship analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(22): 6125-6132. DOI:10.1021/acs.jafc.9b00606 |
| [13] | Nandinsuren T, Shi W, Zhang AL, Bai YB, Gao JM. Natural products as sources of new fungicides (Ⅱ): antiphytopathogenic activity of 2, 4-dihydroxyphenyl ethanone derivatives. Natural Product Research, 2016, 30(10): 1166-1169. DOI:10.1080/14786419.2015.1041140 |
| [14] | Wei J, Liu LL, Dong S, Li H, Tang D, Zhang Q, Xue QH, Gao JM. Gabosines P and Q, new carbasugars from Streptomyces sp. and their α-glucosidase inhibitory activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2016, 26(20): 4903-4906. |
| [15] | Tang D, Liu LL, He QR, Yan W, Li D, Gao JM. Ansamycins with antiproliferative and antineuroinflammatory activity from moss-soil-derived Streptomyces cacaoi subsp. asoensis H2S5. Journal of Natural Products, 2018, 81(9): 1984-1991. DOI:10.1021/acs.jnatprod.8b00203 |
| [16] | Sujarit K, Pathom-aree W, Mori M, Dobashi K, Shiomi K, Lumyong S. Streptomyces palmae CMU-AB204T, an antifungal producing-actinomycete, as a potential biocontrol agent to protect palm oil producing trees from basal stem rot disease fungus, Ganoderma boninense. Biological Control, 2020, 148: 104307. DOI:10.1016/j.biocontrol.2020.104307 |
| [17] | Dai PB, Zong ZF, Ma Q, Wang Y. Isolation, evaluation and identification of rhizosphere actinomycetes with potential application for biocontrol of Valsa mali. European Journal of Plant Pathology, 2019, 153(1): 119-130. DOI:10.1007/s10658-018-1547-z |
| [18] | Li QL, Ning P, Zheng L, Huang JB, Li GQ, Hsiang T. Effects of volatile substances of Streptomyces globisporus JK-1 on control of Botrytis cinerea on tomato fruit. Biological Control, 2012, 61(2): 113-120. DOI:10.1016/j.biocontrol.2011.10.014 |
| [19] | Gangwar M. Antifungal activity of Actinomycetes from rhizospheric soil of medicinal plants against phytopathogenic fungi. Current Microbiology, 2015, 4(3): 182-187. |
| [20] | Gomes EDB, Dias LRL De Miranda RDCM. Actinomycetes bioactive compounds: biological control of fungi and phytopathogenic insect. African Journal of Biotechnology, 2018, 17(17): 552-559. DOI:10.5897/AJB2017.16323 |
| [21] | Awla HK, Kadir J, Othman R, Rashid TS, Wong MY. Bioactive compounds produced by Streptomyces sp. isolate UPMRS4 and antifungal activity against Pyricularia oryzae. American Journal of Plant Sciences, 2016, 7(7): 1077-1085. DOI:10.4236/ajps.2016.77103 |
| [22] | Kavitha A, Vijayalakshmi M, Sudhakar P, Narasimha G. Screening of actinomycetes strains for the production of antifungal metabolites. African Journal of Microbiology Research, 2010, 4: 27-32. |
| [23] |
Wang JZ, Mao ZQ, Cong PH, Lü DG, Ma FW, Ren XL, Shu HR, Li BH, Guo YR, Hao YJ, Jiang YM, Zhang XZ, Yang X, Cao KQ, Zhao ZY, Han ZH, Huo XX, Wei QP. Fruit scientific research in New China in the past 70 years: apple. Journal of Fruit Science, 2019, 36(10): 1255-1263.
(in Chinese) 王金政, 毛志泉, 丛佩华, 吕德国, 马锋旺, 任小林, 束怀瑞, 李保华, 郭玉蓉, 郝玉金, 姜远茂, 张新忠, 杨欣, 曹克强, 赵政阳, 韩振海, 霍学喜, 魏钦平. 新中国果树科学研究70年——苹果. 果树学报, 2019, 36(10): 1255-1263. |
| [24] |
Hu QY, Hu TL, Wang YN, Wang ST, Cao KQ. Survey on the occurrence and distribution of apple diseases in China. Plant Protection, 2016, 42(1): 175-179.
(in Chinese) 胡清玉, 胡同乐, 王亚南, 王树桐, 曹克强. 中国苹果病害发生与分布现状调查. 植物保护, 2016, 42(1): 175-179. DOI:10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.032 |
| [25] |
Li L, Zhang SW, Chen DW, Xu BL. Evaluation of the control efficacy of five mineral source pesticide against the plant pathogen of Valsa mali. Plant Protection, 2019, 45(2): 247-252.
(in Chinese) 李丽, 张树武, 陈大为, 徐秉良. 5种矿物源药剂对苹果树腐烂病菌室内防效评价. 植物保护, 2019, 45(2): 247-252. |
| [26] |
Cao KQ, Guo LY, Li BH, Sun GY, Chen HJ. Investigations on the occurrence and control of apple canker in China. Plant Protection, 2009, 35(2): 114-117.
(in Chinese) 曹克强, 国立耘, 李保华, 孙广宇, 陈汉杰. 中国苹果树腐烂病发生和防治情况调查. 植物保护, 2009, 35(2): 114-117. DOI:10.3969/j.issn.0529-1542.2009.02.027 |
| [27] |
Xue YY, Fan WZ, Zhang SW, Xu BL. Screening, identification and biocontrol effect of antagonistic actinomycetes against the pathogen of Cytospora sp. for apple tree. Chinese Journal of Applied Ecology, 2016, 27(10): 3379-3386.
(in Chinese) 薛应钰, 范万泽, 张树武, 徐秉良. 苹果树腐烂病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及防效. 应用生态学报, 2016, 27(10): 3379-3386. |
| [28] | Li ZP, Gao XN, Kang ZS, Huang LL, Fan DY, Yan X, Kang ZS. Saccharothrix yanglingensis strain Hhs.015 is a promising biocontrol agent on apple Valsa canker. Plant Disease, 2016, 100(2): 510-514. DOI:10.1094/PDIS-02-15-0190-RE |
| [29] |
Zhang QM, Wang CX, Wang HY, Li BH, Dong XL, Li GF. Identification of antagonistic endophytic actinomycetes A-2 and evaluation of its activity against Valsa mali. Chinese Journal of Pesticide Science, 2013, 15(3): 286-292.
(in Chinese) 张清明, 王彩霞, 王海艳, 李保华, 董向丽, 李桂舫. 苹果树腐烂病内生拮抗放线菌A-2的鉴定及其活性评价. 农药学学报, 2013, 15(3): 286-292. DOI:10.3969/j.issn.1008-7303.2013.03.08 |
| [30] |
Xue YY, Li XY, Li FK, Gou PN, Li L, Xu BL. Identification of Z-12A fungus for biocontrol of apple tree canker. Microbiology China, 2021, 48(1): 57-69.
(in Chinese) 薛应钰, 李兴昱, 李发康, 苟攀宁, 李龙, 徐秉良. 苹果树腐烂病生防真菌Z-12A的鉴定及其生防效果. 微生物学通报, 2021, 48(1): 57-69. |
| [31] |
Du JY, Wang N, Yan H. Four methods for extraction and purification of DNA from Prevotella intermedia. China Journal of Modern Medicine, 2015, 25(11): 17-20.
(in Chinese) 都佳寅, 王宁, 闫卉. 4种提取口腔产黑色素细菌DNA方法的比较. 中国现代医学杂志, 2015, 25(11): 17-20. DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2015.11.004 |
| [32] |
Cui LX, Yang CD, Wei LJ, Xue L, Zhang JL. Isolation, identification and biological characterization of Streptomyces galilaeus, a new pathogen of potato scab in Dingxi City, Gansu Province. Plant Protection, 2018, 44(5): 206-211.
(in Chinese) 崔凌霄, 杨成德, 魏立娟, 薛莉, 张俊莲. 甘肃省定西市马铃薯疮痂病新病原Streptomyces galilaeus的分离、鉴定及生物学特性研究. 植物保护, 2018, 44(5): 206-211. |
| [33] | 阎逊初. 放线菌的分类和鉴定. 北京: 科学出版社, 1992. |
| [34] |
Xue YY, Li FK, Li P, Zhao N, Xu BL. Screening and identification of antagonistic actinomycetes JPD-1 against the pathogen Valsa mali. Journal of Plant Protection, 2020, 47(1): 134-142.
(in Chinese) 薛应钰, 李发康, 李培, 赵娜, 徐秉良. 苹果树腐烂病菌拮抗放线菌JPD-1的筛选及鉴定. 植物保护学报, 2020, 47(1): 134-142. |
| [35] |
Jia FA, Chen L, Chen L, Chen WL. Isolation and characterization of antagonistic bacteria against three major fungal pathogens of greenhouse melon. Journal of Plant Protection, 2010, 37(6): 505-510.
(in Chinese) 贾凤安, 陈亮, 陈立, 陈五岭. 大棚甜瓜三种主要真菌病害拮抗细菌的筛选与鉴定. 植物保护学报, 2010, 37(6): 505-510. |
| [36] |
Deng ZS, Zhao LF, Zhang WW, Ji YL, Wei GH. Isolation of endophytic fungi from Ginkgo biloba l. and their antagonism on the Valsa mali miyabe et yamada. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2009, 29(3): 608-613.
(in Chinese) 邓振山, 赵龙飞, 张薇薇, 冀玉良, 韦革宏. 银杏内生真菌的分离及其对苹果腐烂病病原菌的拮抗作用. 西北植物学报, 2009, 29(3): 608-613. DOI:10.3321/j.issn:1000-4025.2009.03.028 |
| [37] |
Lin JS, Gao QQ, Tian Y, Zhang H, Cheng JL, Wang YF, Zhang XQ. Study on the extraction and biological activities of antimicrobial and antibiotic sensitizing active components from wild jujube fruits. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2020, 40(1): 160-169.
(in Chinese) 林金水, 高倩倩, 田野, 张恒, 成娟丽, 王延峰, 张向前. 酸枣果抗菌增敏活性成分的提取及生物学活性研究. 西北植物学报, 2020, 40(1): 160-169. |
| [38] |
Xu LB, Di CX, Liu AP, Wulanbateer, Zhao HX. Antibacterial characteristics of actinomycete strain NMG8-2. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2010, 25(6): 167-172.
(in Chinese) 徐林波, 狄彩霞, 刘爱萍, 乌兰巴特尔, 赵海霞. 一株拮抗放线菌NMG8-2的抑菌特性. 华北农学报, 2010, 25(6): 167-172. |
| [39] | Kim JD, Park MY, Jeon BJ, Kim BS. Disease control efficacy of 32, 33-didehydroroflamycoin produced by Streptomyces rectiviolaceus strain DY46 against gray mold of tomato fruit. Scientific Reports, 2019, 9: 13533. DOI:10.1038/s41598-019-49779-6 |
| [40] | Taha M, Ghaly M, Atwa H, Askoura M. Evaluation of the effectiveness of soil streptomyces isolates for induction of plant resistance against tomato mosaic virus (ToMV). Current Microbiology, 2021, 78(8): 3032-3043. DOI:10.1007/s00284-021-02567-w |
| [41] | Ma AA, Zhang XF, Jiang K, Zhao CM, Liu JL, Wu MD, Wang Y, Wang MM, Li JH, Xu SJ. Phylogenetic and physiological diversity of cultivable actinomycetes isolated from alpine habitats on the Qinghai-Tibetan Plateau. Frontiers in Microbiology, 2020, 11: 555351. DOI:10.3389/fmicb.2020.555351 |
| [42] | Tran-Ly AN, Reyes C, Schwarze FWMR, Ribera J. Microbial production of melanin and its various applications. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2020, 36(11): 170. |
| [43] |
Chen HY, Chen XD, Yu LS. Biosynthesis, function and applications of melanin. Biotic Resources, 2020, 42(6): 652-659.
(in Chinese) 陈海雁, 陈向东, 俞黎姗. 黑色素形成机理、生物学功能和应用开发的研究进展. 生物资源, 2020, 42(6): 652-659. |
| [44] | Dong WF, Wang Y, Huang CG, Xiang SF, Ma PM, Ni ZB, Chen MQ. Enhanced thermal stability of poly(vinyl alcohol) in presence of melanin. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2014, 115(2): 1661-1668. DOI:10.1007/s10973-013-3419-2 |
| [45] | Rizvi A, Ahmed B, Zaidi A, Khan MS. Bioreduction of toxicity influenced by bioactive molecules secreted under metal stress by Azotobacter chroococcum. Ecotoxicology: London, England, 2019, 28(3): 302-322. DOI:10.1007/s10646-019-02023-3 |
| [46] |
Zhang JP, Cai J, Deng YY, Chen YH, Ren GX. Characterization of melanin produced by a wild-type strain of Bacillus cereus. Microbiology, 2006, 33(1): 42-45.
(in Chinese) 张建萍, 蔡峻, 邓音乐, 陈月华, 任改新. 野生Bc菌株产黑色素的研究. 微生物学通报, 2006, 33(1): 42-45. DOI:10.3969/j.issn.0253-2654.2006.01.009 |
| [47] | Patel KR, Wyman JA, Patel KA, Burden BJ. A mutant of Bacillus thuringiensis producing a dark-brown pigment with increased UV resistance and insecticidal activity. Journal of Invertebrate Pathology, 1996, 67(2): 120-124. DOI:10.1006/jipa.1996.0018 |