杆状病毒是一类专性寄生于无脊椎动物的病毒，解析其与宿主之间的相互作用一直是研究热点^[1]。世界上近70个国家均有蚕业生产^[2]，其中属于杆状病毒的家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)，是蚕业生产上危害最严重的病原之一^[3–5]，每年给蚕业生产造成巨大的经济损失^[6–7]。前期研究发现，BmNPV感染BmN-SWU1^[8]细胞将细胞周期阻滞于G2/M期，以利于自身增殖。细胞周期蛋白CyclinB是细胞周期G2期向M期转换的重要调控因子，其与细胞周期蛋白依赖性激酶1 (cyclin-dependent kinase 1，CDK1)组成复合物调控细胞周期由G2期进入M期^[9–12]。研究BmNPV感染过程中CyclinB表达水平及定位变化对解析病毒调控细胞周期的机制具有重要意义，同时探究这一过程中参与调控的宿主基因和病毒基因，可为培育抗BmNPV的家蚕转基因品系提供理论支撑。杆状病毒是一类环状、双链、基因组为超螺旋的DNA病毒^[13]，其基因组大小为80–180 kb^[14–15]。杆状病毒生活周期中可以产生2种不同的病毒粒子^[16–17]：包埋型病毒(occusion-derived virus，ODV)和牙生型病毒(budded virus，BV)。ODV介导个体间的传播，BV介导细胞间的传播。杆状病毒感染宿主，将宿主细胞周期阻滞于G2/M期，形成一个有利于病毒自身增殖复制的环境^[18]。CyclinB从G1晚期开始表达并逐渐积累，在G2晚期达到最大值，一直维持到分裂中期，随后立即降解。CyclinB的积累和降解在维持正常的细胞周期中起着重要的作用，外部因素或内部因素引起CyclinB的不正常表达都会导致细胞周期的紊乱。在家蚕卵巢细胞中干涉CyclinB会抑制细胞增殖，将细胞周期阻滞在G2/M期^[19]。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)感染Sf9细胞，编码ODV-EC27蛋白与CyclinB竞争性结合CDK1，使G2期向M期转换的重要调控复合物CyclinB-CDK1不能发挥作用，G2期不能进入M期，最终将细胞周期阻滞在G2/M期^[20–22]，以利于病毒增殖^[23]。棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(Heliocoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HaSNPV)感染Hz-AM1细胞诱导细胞周期阻滞在G2/M期，并提高CyclinB1表达量^[24]。已有研究发现BmNPV感染BmN-SWU1细胞通过BmNPV IAP1下调BmCDK1蛋白水平的表达将细胞周期阻滞于G2/M期^[25]，与报道的AcMNPV和HaSNPV阻滞细胞周期方式存在差异。BmNPV侵染BmN-SWU1细胞阻滞细胞周期于G2/M期，解析这一过程有利于对BmNPV的防控。在BmNPV侵染BmN-SWU1细胞过程中，探究BmCyclinB表达量及定位变化，鉴定与BmCyclinB发生相互作用的病毒蛋白，为培育抗BmNPV家蚕品系提供分子靶标，同时为解析BmNPV调控宿主细胞周期阻滞周期于G2/M期提供重要线索。

1 材料与方法 1.1 细胞和病毒

家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室建立^[8]并保存，BmNPV(CQ株)由实验室保存。

1.2 试剂和仪器

试剂：各种限制性内切酶、连接酶、DNA Marker、逆转录试剂盒等分子生物学操作试剂购于TaKaRa公司；胶回收试剂盒和RNA提取试剂盒购于Omega公司；抗体和细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒购于Beyotime公司；ECL显色液和定量试剂购于Yeasen公司；各种化学试剂购于成都科隆有限公司。

仪器：超高分辨激光共聚焦显微镜(Olympus)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad)；分光光度计(ThermoFish)；转膜仪(Bio-Rad)；扫描仪(Bio-Rad)；化学发光成像仪(Bio-Rad)；16 ℃连接仪(Eppendorf)。

1.3 BmCyclinB真核表达载体、BmNPV iap1敲除载体和重组病毒构建

利用Primer 5.0进行BmCyclinB的引物设计，其中BmCyclinB^HA-BamH I-F的序列为(CGCggatccATGTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTGAAATTCAACTAAGGCGGCAT)，BmCyclinB-Not I-R的序列为(ATTTgcggccgcTT AAGGGCTTGGGCTTGATATCT)。用Ex-Taq酶进行扩增，扩增片段和pIZ-V5/His载体用BamH I和Not I内切酶进行酶切，利用Solution I连接，选择阳性克隆进行测序。根据文献[25]进行psl1180-sgBmNPV iap1-Cas9-Flag载体构建。

将BmCyclinB^Flag克隆到pFastBac1载体上，随后通过Bac to Bac转座到vBm基因组上^[26]，构建重组病毒vBm-BmCyclinB^Flag。

1.4 RNA提取和逆转录实验

细胞转染48 h后以感染复数MOI=5添加病毒，将细胞轻轻吹下，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗1遍，加入TRK裂解液，按试剂盒说明书提取RNA，分光光度计测量RNA浓度后，立即使用逆转录试剂进行逆转录实验。10 µL反应体系包括gDNA Eraser 1 µL，5×gDNA Eraser Buffer 2 µL，RNA 1 µg，RNase Free ddH₂O补足到10 µL；42 ℃保温2 min后加PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 µL，5×PrimeScript Buffer 24 µL，RT Primer Mix 4 µL，RNase Free ddH₂O 1 µL，37 ℃反应30 min；85 ℃保温5 s以终止反应，最后利用家蚕肌动蛋白基因Actin3的扩增引物A3-F (5ʹ-CATGAAGATCCTCACCGAGCG-3ʹ)和A3-R (5ʹ-CGTAGCACAGCTTCTCCTTGATA-3ʹ)^[27]检测逆转录反应是否成功。

1.5 荧光定量PCR

以逆转录获得的cDNA为模板，进行定量PCR检测，10 µL的体系包括：SYBR®Green Supermix 5 µL、DEPC水5 µL、引物(10 µmol/L)各0.3 µL、模板(反转1 µg RNA) 0.8 µL。反应程序为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环40次；最后95 ℃变性10 s。选用翻译起始因子4A^[28](sw22934)作为内参基因，引物为qsw22934-F (5ʹ-TTCGTACTGGCTCTTCTCGT-3ʹ)和qsw22934-R (5ʹ-CAAAGTTGATAGCAATTC CCT-3ʹ)。用于BmCyclinB检测的引物为qBmCyclinB-F (5ʹ-TGTCAAAAATGTTATTCAG CC-3ʹ)和qBmCyclinB-R (5ʹ-TTTCCGTAAAGA GTCAGTTCC-3ʹ)。

1.6 免疫荧光

根据TransIT ^®-Insect Transfection Reagent说明书将pIZ-BmcyclinB-HA载体进行转染，无菌培养48 h后添毒。PBST (PBS加Tween-20)清洗，加入200 μL 4%多聚甲醛溶液，室温固定15 min，PBST清洗，加入200 μL 1% Triton X-100，室温下通透15 min，PBST清洗。加250 μL封闭液(3% BSA，10%羊血清，90% PBS) 37 ℃封闭1 h。加入一抗，37 ℃孵育2 h，PBST清洗30 min，加入二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBST清洗。取干净载玻片，做好标记，将爬片小心取出固定在载玻片上，在荧光共聚焦显微镜下观察。

1.7 细胞核蛋白及细胞浆蛋白分离

利用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒进行细胞浆蛋白和细胞核蛋白的分离。将细胞样品吹下，吸出一部分作为总蛋白，其余进行细胞浆蛋白和细胞核蛋白的分离，具体步骤见试剂盒说明书。最后在所得到的总蛋白、细胞核蛋白和细胞浆蛋白中加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水煮10 min，−80 ℃保存备用。

1.8 Western blotting

将BmN-SWU1细胞样品吹下离心，沉淀加入IP裂解液(IP裂解液: PMSF=100:1)冰上裂解30 min，然后加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴中煮10 min备用。利用SDS-PAGE (12%分离胶，5%浓缩胶)凝胶进行电泳，结束后通过转膜仪将蛋白质电转至PVDF膜上，将膜置于封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液)中室温封闭2 h，然后以一抗和封闭液比为1:2 000加入HA/Flag抗体(兔/鼠)，室温孵育2 h，TBST缓冲液清洗5次，每次6 min，再以二抗和封闭液比为1:5 000加入HRP标记的山羊抗兔/鼠IgG二抗，室温孵育1 h，重复上步清洗步骤。最后加ECL显色液进行曝光。

1.9 免疫共沉淀

向细胞中添加重组病毒vBm-BmCyclinB^Flag，48 h后，将细胞吹下离心，沉淀中加入1 mL IP裂解液，冰上摇动裂解30 min后吸出100 μL样品作为总蛋白样品。另准备2个新的离心管，做好标记，分别加入50 μL Protein A磁珠，磁力架上用PBST洗涤3次。加入300 μL PBST，2个离心管分别加入3 μL鼠/兔IgG和3 μL Flag(HA)鼠/兔抗体，翻转仪上孵育2 h。磁力架上去除上清，2个离心管中各加入450 μL蛋白样品，翻转仪上孵育2 h。PBST洗涤3次，随后2个离心管中分别加入100 μL IP裂解液和25 μL 5×蛋白上样缓冲液，沸水中煮10 min。磁力架上将煮好的蛋白转移至新的做好标记的离心管中，−80 ℃保存备用。

1.10 银染和质谱鉴定

将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后进行以下处理：固定液(甲醇50 mL、冰乙酸12 mL、甲醛50 μL、纯水38 mL)固定1 h；洗涤液(甲醇125 mL、纯水125 mL)清洗2 h；增感液(无水硫代硫酸钠0.01 g、纯水250 mL)增感90 s；超纯水洗涤3次，每次20 s；染色液(硝酸银0.2 g、甲醛75 μL、纯水100 mL)染色，避光孵育30 min；超纯水洗涤3次，每次20 s；显影液(无水硫代硫酸钠6 g、增感液8 mL、甲醛50 μL、纯水92 mL)显色，直到蛋白条带清晰可见后加入终止液(甲醇50 mL、冰乙酸12 mL、纯水38 mL)终止显影，蛋白胶于扫描仪上成像和分析。将差异条带切下送北京华大基因进行质谱鉴定，质谱条带以家蚕数据库和BmNPV基因组信息为参照。

2 结果与分析 2.1 BmNPV感染BmN-SWU1细胞影响BmCyclinB表达

探究BmNPV感染对宿主细胞周期G2期向M期转换的关键调控基因BmCyclinB的影响，利用实时荧光定量PCR检测病毒感染0、12、24、36、48 h后BmCyclinB的表达。以未感染病毒的细胞做对照，结果显示，BmNPV感染后，BmCyclinB转录水平发生显著下调(图 1)。

2.2 BmNPV感染BmN-SWU1细胞促进BmCyclinB在核内积累

为了探究BmNPV对BmCyclinB定位的影响，构建了BmCyclinB过表达载体pIZ-BmcyclinB-HA，并通过定量水平验证，构建成功(图 2A和2B)，将其转染细胞，48 h后添毒进行免疫荧光观察。结果显示，在未感染病毒的对照组中，BmCyclinB定位于细胞质，感染病毒后BmCyclinB定位发生改变，细胞质和细胞核都有，但主要定位于细胞核(图 2C)。进一步将表达BmCyclinB的细胞按处于细胞质或细胞核进行统计分析，结果显示，在未感染时，BmCyclinB定位于细胞核占比34.96%，感染12 h占比41.70%，感染24 h占比50.76%，感染48 h占比88.92%，感染病毒后BmCyclinB定位于细胞核内的比例显著增加(图 2D)。

为了进一步验证BmNPV感染后是否促进BmCyclinB在核内积累，以正常培养的未感染病毒作为对照，进行细胞质蛋白细胞核蛋白分离实验，以微管蛋白tubulin^[29]和增殖细胞核抗原^[30] (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)分别代表细胞质蛋白和细胞核蛋白。Western blotting结果显示，实验组与对照组的细胞质蛋白中未检测到PCNA，细胞核蛋白中未检测到tubulin，说明所收样品符合实验要求，可用于后续实验。对照组中，在总蛋白及细胞质蛋白中均检测到BmCyclinB的表达，但在细胞核蛋白中未检测到BmCyclinB蛋白(图 2E)；实验组中，在三者中均检测到了BmCyclinB的表达(图 2F)。以上结果说明BmNPV感染BmN-SWU1细胞促进BmCyclinB于核内积累。

2.3 BmCyclinB互作蛋白分析

为了探究BmNPV感染BmN-SWU1细胞促进BmCyclinB核内积累的机制，利用重组病毒vBm-BmCyclinB^Flag感染细胞，收集蛋白进行免疫共沉淀实验，银染后切取IgG条带和IP条带进行质谱鉴定。结果显示，与对照IgG相比，vBm-BmCyclinB^Flag有5条差异带(图 3A)。质谱结果结合差异条带的大小和蛋白丰度，筛选到与BmCyclinB蛋白互作的病毒蛋白有7个，分别是病毒衣壳蛋白(BV/ODV-C42)、第67个开放阅读框(Bm67)、碱性核酸酶(alkaline nuclease，AN)、凋亡抑制基因(BmNPV IAP1)、通用反式转录因子(global transactivator，Gta)、第128个开放阅读框(Pe38)和第89个开放阅读框(He65)(表 1)。进一步对BmCyclinB与BmNPV IAP1进行了共定位观察，结果显示，BmCyclinB与BmNPV IAP1共定位于细胞核和细胞质，并主要定位于细胞核(图 3B)。免疫共沉淀和免疫印迹分析结果显示，BmCyclinB与BmNPV IAP1蛋白之间存在一定相互作用(图 3C)。

2.4 敲除BmNPV IAP1对BmCyclinB定位的影响

将psl1180-sgBmNPV iap1-Cas9-Flag载体转染进BmN-SWU1细胞，48 h后添毒，以空载为对照，添毒24 h后进行免疫荧光实验，随后用荧光共聚焦显微镜观察BmCyclinB细胞质细胞核分布情况(图 4A)。对表达BmCyclinB的细胞中BmCyclinB处于细胞核的细胞进行统计，结果显示，对照组中接近50%的BmCyclinB进入细胞核，而敲除BmNPV iap1后BmCyclinB进入细胞核的数量显著减少(图 4B)。

3 讨论

本文首次探讨了BmNPV与BmCyclinB之间的关系。已有研究表明，BmNPV侵染家蚕细胞将细胞周期阻滞在G2/M期^[31]。CyclinB是细胞G2期向M期转换的重要细胞周期蛋白，与CDK1形成CyclinB-CDK1复合物^[32]，调控G2期向M期的转换^[33]。在G2早期，CyclinB-CDK1复合物出核速度快于入核速度；在G2晚期，CyclinB-CDK1复合物出核速度慢于入核速度，在细胞核累积，调控G2期进入M期^[34]。本研究结果显示，BmNPV感染导致BmCyclinB转录水平下调；BmCyclinB蛋白定位发生变化，感染前主要定位于细胞质，感染后主要定位于细胞核。进一步通过细胞质细胞核蛋白分离实验证明，BmNPV感染后BmCyclinB蛋白有部分进入细胞核内，而对照组的细胞核蛋白组中未检测到BmCyclinB蛋白。细胞周期分为间期和分裂期两个阶段，其中间期占据整个过程的大部分时间，分裂期只占据小部分，如HeLa细胞周期约为22 h，其中细胞间期为21 h，分裂期为1 h^[35]，因此本研究在对照组中未检测到BmCyclinB蛋白。

AcMNPV编码的ODV-EC27蛋白能够和CyclinB竞争性结合CDC2和CDC6，调控宿主细胞周期进程，将细胞周期阻断于G2/M期^[20]。而BmNPV编码BmNPV IAP1下调BmCDK1的表达，阻滞细胞周期于G2/M期^[25]。为了探讨BmNPV侵染BmN-SWU1细胞将细胞周期阻滞在G2/M期的阻滞机制，本研究以BmCyclinB为诱饵钓取了与其相互作用的病毒蛋白。结果发现了7个与BmCyclinB互作的病毒蛋白，分别是BV/ODV-C42、Bm67、AN、BmNPV IAP1、Gta、Pe38和He65。已有研究发现一种鼠凋亡抑制基因TIAP在同步化的NIH 3T3细胞重新进入细胞周期的S期向G2/M期转换过程中高表达^[36]，暗示其在调节细胞周期转换中发挥重要功能。因此，本文选取了BmNPV IAP1作进一步研究。通过免疫荧光和免疫共沉淀证明BmCyclinB与BmNPV IAP1之间存在一定相互作用，敲除BmNPV IAP1后BmCyclinB定位于细胞核的数量显著减少，BmNPV通过BmNPV IAP1促进BmCyclinB在核内积累，使其不能与CDK1形成复合物行使功能，或者在CyclinB- CDK1复合物未被激活的情况下促进入核，复合物不能正常发挥功能，从而导致细胞周期不能从G2期顺利进入M期，最终将细胞周期阻滞于G2/M期。HaSNPV感染Hz-AM1细胞，阻滞CyclinB1进核，将细胞周期阻滞在G2/M期^[24]，BmNPV促进CyclinB在核内积累以调控宿主细胞周期，与HaSNPV调控方式存在差异，但可为解析杆状病毒调控宿主细胞周期方式提供参考。

本研究发现BmNPV IAP1与BmCyclinB存在一定相互作用，参与BmNPV调控宿主细胞周期。IAP是凋亡抑制基因，在细胞中起调控细胞凋亡的作用^[37–38]，本文发现与研究报道的IAP功能不一样，一方面丰富了IAP基因功能研究，另一方面为解析病毒与宿主之间的调控方式提供新思路。最后，细胞周期是一个复杂的调控网络，参与其中的基因涉及很多，通过BmCyclinB钓取的其他病毒蛋白是否也参与BmNPV调控细胞周期的过程，有待进一步研究。

4 结论

BmNPV感染BmN-SWU1细胞，通过降低BmCyclinB表达量以及通过BmNPV IAP1促进BmCyclinB在核内积累，以调控宿主细胞周期阻滞在G2/M期。