2022, Vol. 62
表1(Table 1)
肽酶PepT参与副溶血弧菌的浮游运动和生物被膜形成
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220063
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 齐瑜, 刘鹏选, 张小芸, 白雪瑞, 王权, 方维焕, 蒋蔚. 2022
- QI Yu, LIU Pengxuan, ZHANG Xiaoyun, BAI Xuerui, WANG Quan, FANG Weihuan, JIANG Wei.
- 肽酶PepT参与副溶血弧菌的浮游运动和生物被膜形成
- Peptidase T is related to swimming motility and biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus
- 微生物学报, 62(9): 3646-3657
- Acta Microbiologica Sinica, 62(9): 3646-3657
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文章历史
- 收稿日期：2022-02-03
- 修回日期：2022-03-17
- 网络出版日期：2022-05-19
引用本文 |
齐瑜, 刘鹏选, 张小芸, 白雪瑞, 王权, 方维焕, 蒋蔚. 肽酶PepT参与副溶血弧菌的浮游运动和生物被膜形成[J]. 微生物学报, 2022, 62(9): 3646-3657.
Qi Yu, Liu Pengxuan, Zhang Xiaoyun, Bai Xuerui, Wang Quan, Fang Weihuan, Jiang Wei. Peptidase T is related to swimming motility and biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2022, 62(9): 3646-3657.
肽酶PepT参与副溶血弧菌的浮游运动和生物被膜形成
1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241;
2. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095;
3. 上海市农业学校动物科学技术系，上海 201600;
4. 浙江农林大学动物科技学院，浙江 临安 311300
2. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095;
3. 上海市农业学校动物科学技术系，上海 201600;
4. 浙江农林大学动物科技学院，浙江 临安 311300
摘要：[目的] 本文选取PepT为研究对象，研究其对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响。[方法] 通过构建缺失株ΔpepT和回补株CΔpepT，比较菌株在运动性、生物被膜、环境耐受、细胞毒性等方面的差异。[结果] 与野生株相比，ΔpepT缺失株的极性鞭毛转录水平极显著下降，浮游运动能力降低; 同时生物被膜形成能力减弱，而细菌群集运动及环境耐受能力无显著差异。此外，缺失pepT基因会导致副溶血弧菌的细胞毒性和小鼠毒力作用显著下降。[结论] pepT基因与副溶血弧菌浮游运动和生物被膜形成能力相关，并且影响其致病性。
关键词：副溶血弧菌 金属依赖性肽酶 生物被膜 运动性 致病性
Peptidase T is related to swimming motility and biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus
1. Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China;
2. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China;
3. Department of Animal Science and Technology, Shanghai College of Agriculture, Shanghai 201600, China;
4. College of Animal Science and Technology, Zhejiang Agriculture & Forestry University, Lin'an 311300, Zhejiang, China
2. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China;
3. Department of Animal Science and Technology, Shanghai College of Agriculture, Shanghai 201600, China;
4. College of Animal Science and Technology, Zhejiang Agriculture & Forestry University, Lin'an 311300, Zhejiang, China
Abstract: [Objective] In this study, PepT was chosen to explore the effect of gene deletion on the biological characteristics and pathogenicity of V. parahaemolyticus. [Methods] The pepT gene deletion mutant ΔpepT and the complementary strain CΔpepT were generated and their differences of various strains in motility, biofilm, environmental tolerance and cytotoxicity were compared. [Results] Compared with the wild-type strain, ΔpepT had significantly decreased transcription level of polar flagella and reduced swimming mobility. Furthermore, the biofilm formation ability of ΔpepT was weakened, but there were not statistically significant in the swarming mobility and environmental tolerance. In addition, the pepT gene deletion resulted in remarkably lowered cytotoxicity and virulence of V. parahaemolyticus in mice. [Conclusion] The pepT gene deletion affects the swimming motility and biofilm formation ability as well as the pathogenicity of V. parahaemolyticus.
Keywords:
Vibrio parahaemolyticus metal dependent peptidase T biofilm motility pathogenicity
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐微生物，可引起鱼和对虾早期死亡综合征及急性肝胰腺坏死病，严重威胁国内外水产养殖业的健康发展[1–2]。副溶血弧菌还是一种重要的食源性肠道致病菌，食用受污染或未煮熟的海鲜，不仅能引发急性胃肠炎，还可通过伤口感染导致败血症[3–4]。从最初在日本“夏季腹泻”病例中分离出副溶血弧菌后，其引起的食物中毒病例不断增加[5]，已成为威胁人类健康的主要食源性疾病之一[6]。目前，副溶血弧菌毒力因子研究较多的主要包括溶血毒素、黏附素、Ⅲ型(T3SSs)和Ⅵ型(T6SSs)分泌系统等[7–8]，而对氨肽酶在其致病过程中发挥的作用知之甚少。
微生物中的氨肽酶PepT最先从大肠杆菌[9–10]和鼠伤寒沙门菌[11]中分离出来，能特异性催化三肽N端释放出游离氨基酸[12]。PepT是金属肽酶M20家族成员，其亚基中包含一个金属结合域和一个介导二聚化的第二结构域[13–14]。M20家族氨肽酶成员的生物学功能受到广泛关注：例如，在大肠杆菌中发现的PepN参与了整个胞浆蛋白的降解[15]；乳酸杆菌的氨基肽酶PepV参与氨基酸利用[16]；乳酸杆菌作为食品工业上主要的发酵剂，利用氨肽酶将牛奶中酪蛋白降解成细菌新陈代谢所需的氨基酸成分[17]，才能在牛奶中生长，并将牛奶发酵成奶酪。最近，氨基肽酶参与发病机制的研究也引起广泛关注。研究表明，氨肽酶PepN在感染鼠伤寒沙门氏菌小鼠模型的全身感染过程中发挥重要作用[18]。在牛羊肝片吸虫中，氨基肽酶是入侵、获取营养物质和逃避宿主免疫反应的必需酶[19]。在猪链球菌中通过差异蛋白质组学与弱毒株对比，强毒株中亮氨酸氨肽酶和氨肽酶T两种氨肽酶表达上调[20]。以上研究表明氨肽酶功能极其多样化，因此，氨肽酶PepT的研究具有巨大的生物技术应用潜力。
研究表明，PepT等氨肽酶通过影响关键蛋白的生物活性参与细菌应激反应和毒力，证明了氨肽酶在金黄色葡萄球菌发病机制中的重要性[21]，但其在副溶血弧菌致病机制过程中发挥的作用研究较少。本研究选取副溶血弧菌pepT基因，通过构建缺失株和回补株，研究其在副溶血弧菌生物学特性及致病性中的作用，为治疗副溶血弧菌引发的感染提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌株和质粒副溶血弧菌SH112 (GenBank登录号：JACYGZ000000000.1)野生型菌株(wild-type，WT)、同源重组质粒pYAK1、辅助菌pRK2013-HB101、pMMB-207载体，以及HeLa细胞均为本实验室保存。
1.1.2 主要试剂细菌基因组DNA快速提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和质粒小提试剂盒均购自天根生化科技(上海)有限公司；限制性内切酶和T4连接酶购自TaKaRa公司；CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒购自Promega公司；DMEM细胞培养基和胎牛血清均购自Gibco公司；细胞培养相关耗材购自美国Corning公司；硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)购自广东环凯微生物公司；结晶紫染色液购自于上海碧云天生物技术有限公司。
1.2 pepT基因缺失株和回补株的构建使用Primer Premier 5.0软件设计引物(表 1)，以副溶血弧菌SH112的DNA为模板，利用引物对pepT-A/B和pepT-C/D，扩增出具有重叠15 bp同源臂的片段，以pepT-A/D引物对扩增pepT基因组位点侧翼序列的PCR片段，利用Pst Ⅰ和Sma Ⅰ双酶切PCR片段，将其连接到具有相同限制性酶切位点的pYAK1载体。将重组质粒热激转化到感受态细胞CC118 λpir中，涂布于氯霉素(10 μg/mL)抗性的LB平板，挑取长出的单菌落增菌后提取DNA，利用引物pepT-A/D进行PCR鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pepT-pYAK1。在辅助菌pRK2013-HB101的作用下，与副溶血弧菌SH112进行接合转移，分别在10 μg/mL氯霉素的TCBS平板和含20%蔗糖LB固体培养基上进行传代筛选，利用表 1所列的一系列特异性引物，对可疑的双交叉突变株进行了PCR和qRT-PCR验证，将成功缺失pepT的菌株命名为ΔpepT。利用pepT-pMMB-F/R引物，从SH112基因组中扩增含有pepT的整个阅读框(ORF)的1 107 bp片段，利用限制性内切酶对pMMB-207质粒和目的片段进行酶切，通过T4连接酶连接后转化到大肠杆菌CC118 λpir中。将该互补载体经过上述方法，接合转导至相应的缺失突变株中，在氯霉素抗性的TCBS平板上进行抗性筛选，利用引物pepT-E/F和pepT-pMMB-F/R进行PCR鉴定，鉴定正确的互补株菌株命名为CΔpepT。
表 1. 本研究中所用引物名称及序列
Table 1. Primers used in this study
| Primers | Primer pairs sequences (5′→3′) | Restriction enzyme |
| pepT-A/B | GCGCTGCAGAAGCGGGAGTTTCAAGAC/TTGGGTGTCTCTTTCTTTTGGGGTCGA | Pst Ⅰ |
| pepT-C/D | GAAAGAGACACCCAACCTCACTCAAATATTT/TATCCCGGGTGATGCCGTGTTAGGGTC | Sma Ⅰ |
| pepT-E/F | TTGTTCAATGCCTTGGCTGTC/CAGTTACTGCCGTGCCTC | |
| pepT-pMMB-F/R | CGCGGATCCATGACACAAATTAATCAAGA/TAGCTGCAGCTACTTCACCAAAAAATGCT | BamH Ⅰ Pst Ⅰ |
| sacB-F/R | ACGGCACTGTCGCAAACTAT/TTCCGTCACCGTCAAAGAT | |
| Restriction enzyme sites are underlined. | ||
1.3 生长曲线测定
将野生株SH112、ΔpepT和CΔpepT在3% NaCl固体LB培养基上划线涂板，次日挑取单克隆进行培养，菌液OD600=0.2±0.02后，以1:100 (V/V)接种于新鲜的3% NaCl-LB液体培养基中，37 ℃振荡连续培养12 h，每隔1 h吸取100 μL菌液，重复3孔，测定OD600值，该实验重复3次。
1.4 环境压力耐受因子检测将各菌株37 ℃过夜培养，转接100 μL至5 mL 3% NaCl-LB培养基至对数生长期，即OD600=0.2±0.02后，分别以1:100倍稀释至pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的3% NaCl-LB液体培养基、含1%、3%、5%、7%、9%和11% NaCl的LB培养基中混匀，再加到96孔板中(200 μL/孔)，重复4次，静置培养于37 ℃温箱，每隔1 h测定其OD600值，绘制不同环境条件下的生长曲线。
1.5 qRT-PCR检测基因转录水平使用TRIzol法提取SH112、ΔpepT和CΔpepT菌株的RNA，用DNase Ⅰ处理，排除基因组DNA污染。根据制造商说明书，使用PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa)进行cDNA合成。根据表 2特异性引物，以gap基因作为内参，通过qRT-PCR检测目的基因mRNA水平。使用SYBR Premix Ex Taq kit (TaKaRa)试剂盒进行SYBR Green PCR，反应体系为：cDNA模板2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，2×ChamQ Universal SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，去离子水7.2 μL，总体积20 μL。使用ABI 7500 RT-PCR系统进行相对定量RT-PCR，设置反应参数：95 ℃预变性2 min；PCR反应阶段：95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，40个循环。采用比较周期阈值法(2–ΔΔCT法)分析基因表达水平。
表 2. 荧光定量PCR鉴定基因mRNA转录水平引物
Table 2. Primers used in real-time PCR
| Primers | Primer pairs sequences (5′→3′) |
| pepT-RT-F | GAGCTGTCACATGGATACGGTAACG |
| pepT-RT-R | ATAGTGTTGCCTTTCGAGCGGATG |
| flaA-RT-F | ATCAGCAACCTAGACAACATA |
| flaA-RT-R | TTAGCCCAACAAGCTTAGCGC |
| fliD-RT-F | ATTCGTACGCGAGAGAAAAGT |
| fliD-RT-R | TTAACCTAACGCACTCATAAG |
| flgE-RT-F | TGGGGTGAATCAAACAAAGGC |
| flgE-RT-R | TTATCTAATCTGCAGGATATT |
| flgM-RT-F | AGCCAACAAAGTAAAGCCGTC |
| flgM-RT-R | TTAGCTTTTGCCTTGCAATTC |
| fliF-RT-F | GAAACCAGCCTAATTGGTAGC |
| fliF-RT-R | TTAGCCATTTTCGTTCATCCA |
| gap-RT-F | TTTGAAGAGCGTCCGTTGGTG |
| gap-RT-R | TTAAGCCAACACAACGTTACG |
1.6 群集和浮游运动
将野生株SH112、ΔpepT和CΔpepT过夜活化后，按1:100转接培养至对数生长期。用新鲜的3% NaCl-LB液体培养将各组菌液浓度调整一致。将菌液2 μL垂直点样于浮游运动培养板(含0.3% 琼脂、3% NaCl-LB的LB)上，浮游平板正置37 ℃温箱培养4 h；将菌液2 μL垂直点样于群集平板(含1.5%琼脂、3% NaCl-LB的BHI)上，群集平板30 ℃温箱正置培养24 h。拍照记录2种平板上菌株运动情况，并测量直径。
1.7 ICR小鼠感染实验将雌性ICR小鼠(3–4周龄)分成4组，每组10只。将SH112、ΔpepT和CΔpepT这3种菌株培养至对数生长期，收集沉淀后用PBS清洗3遍，以5×107 CFU/只攻毒，腹腔注射实验组小鼠，同时空白对照组小鼠注射同体积生理盐水，连续48 h观察小鼠精神状态，记录小鼠的死亡时间及数量，最终根据所得数据绘制小鼠存活曲线图。
1.8 各菌株生物被膜形成能力的测定将野生株SH112、ΔpepT和CΔpepT菌株过夜活化后，划线涂布于3% NaCl-LB固体培养基，次日在平板上挑取单菌落，接种到液体培养基中，37 ℃、6 180 r/min培养至对数生长期，以1:100比例稀释混匀，在96孔板中每孔添加200 μL，每种菌株重复8个孔，以空白培养基为对照组，然后放入37 ℃的恒温培养箱中静置培养48 h。培养完成后，每孔加250 μL的无菌PBS清洗3次。然后用200 μL的无水甲醇室温下固定15 min，弃去甲醇后，室温静置干燥。再用200 μL结晶紫染色15 min后回收结晶紫，用PBS冲洗，将平板室温晾干，加200 μL的95%乙醇溶解结晶紫，最后用酶标仪测定OD590值。实验独立重复3次。
1.9 细胞毒性试验参考文献[22]实验方法，将HeLa细胞铺于96孔细胞板中，过夜培养长至80%–90%覆盖率，用PBS清洗2遍后，每个试验孔加入50 μL无酚红DMEM待用。将SH112、ΔpepT和CΔpepT培养至对数生长期，用无酚红DMEM清洗3遍后，按照MOI=100:1倍比稀释后，试验孔加入50 μL菌液感染HeLa细胞，重复6个孔；将细胞板放置于37 ℃、5% CO2培养箱中感染2 h。根据CytoTox 96试剂盒说明书操作，检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的释放，通过计算试验组LDH释放百分比，比较不同菌株对HeLa细胞毒性。
1.10 数据统计分析数据采用GraphPad Prism 8.0.1软件中单因素方差分析(one-way ANOVA)，用平均数±标准差(x±SD)表示。星号表示P值，****，P < 0.000 1；***，P < 0.001；**，P < 0.01；*，P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 PepT生物信息学分析结果使用pepT-pMMB-F/R引物扩增，PCR扩增SH112株的基因组，将目的条带纯化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，利用DNAStar软件将核苷酸序列翻译为氨基酸序列。通过NCBI的BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库对氨基酸序列进行同源性比对，并使用MEGA软件绘制进化树；通过NCBI的CDD数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对PepT蛋白的功能结构域进行预测。结果发现，pepT基因共包含1 107个核苷酸(GenBank：OM307225)，编码368个氨基酸残基。通过MEGA软件绘制进化关系(图 1)，结果表明，PepT序列在副溶血弧菌分离株中高度保守，同源性达99%以上。
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| 图 1 PepT的系统进化树 Figure 1 Phylogenetic tree of PepT. |
2.2 基因缺失株ΔpepT及回补株CΔpepT的鉴定
通过同源臂双交换重组法，构建pepT基因缺失株，使用pepT-E/F引物对验证基因缺失株的正确性。结果如图 2所示，野生株扩增出2 878 bp长条带(泳道1)，而缺失株扩增出1 771 bp短片段(泳道2)，此时构建成功的互补株也扩增出1 771 bp短片段(泳道3)。用引物pepT-pMMB-F/R扩增时，野生株有目的片段1 107 bp (泳道4)，缺失株无扩增片段(泳道5)，互补株有目的条带(泳道6)，与野生株大小相同。综上所述，pepT基因的缺失株ΔpepT和回补株CΔpepT构建成功。
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| 图 2 副溶血弧菌WT、ΔpepT及回补株CΔpepT的鉴定 Figure 2 PCR identification of WT, ΔpepT and CΔpepT of V. parahaemolyticus using pepT-E/F primers (lanes 1–3) and pepT-pMMB-F/R primers (lanes 4–6), respectively. M: DL2000. |
将构建成功的缺失株和互补株在3% NaCl-LB平板上连续培养20代，最终PCR验证，条带大小均正确，表明ΔpepT、CΔpepT具有良好的遗传稳定性。
2.3 qRT-PCR检测目的基因转录水平结果通过qRT-PCR对WT、ΔpepT和CΔpepT进行目的基因pepT转录情况分析，结果如图 3所示，ΔpepT无目的基因转录，而野生株和互补株中基因pepT转录水平正常。
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| 图 3 WT、ΔpepT和CΔpepT菌株的pepT基因表达情况 Figure 3 Expression of pepT gene in WT, ΔpepT and CΔpepT strains. ****: P < 0.000 1. |
2.4 各菌株的生长曲线
如图 4所示，3% NaCl-LB培养基中培养野生株、缺失株和互补株，结果表明，基因pepT的缺失并不影响副溶血弧菌的生长趋势(P > 0.05)，排除了由于该基因缺失造成副溶血弧菌的生长规律的改变对后续试验的影响。
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| 图 4 WT、ΔpepT和CΔpepT菌株在3% NaCl-LB的生长曲线 Figure 4 The growth curve of WT, ΔpepT and CΔpepT. P > 0.05. |
2.5 各菌株的环境压力耐受因子
如图 5所示，耐环境压力试验证实，缺失株ΔpepT对酸、碱、高渗透压的抵抗力与野生株相比，没有显著差异(P > 0.05)。
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| 图 5 WT、ΔpepT和CΔpepT在不同酸碱度(A)和盐浓度(B)培养基中生长曲线 Figure 5 Effects of NaCl (A) and acid-base stress concentration (B) on the growth ability of WT, ΔpepT and CΔpepT. |
2.6 各菌株的生物被膜形成能力
本研究采用结晶紫染色法检测生物被膜形成能力(图 6A)，95%乙醇溶解后，OD595读数结果如图 6B，结果显示，ΔpepT生物被膜形成能力显著低于野生株(P < 0.01)，互补株生物被膜形成能力恢复，表明基因pepT与副溶血弧菌生物被膜形成有关。
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| 图 6 各菌株生物被膜形成能力的比较 Figure 6 Biofilm formation ability of strains. A: the photograph of stained cells was taken at 2 days after incubation in 3% NaCl-LB; B: stained cells dissolved in 95% ethanol solution read at OD595. *: P < 0.05. |
2.7 基因pepT缺失对浮游运动和群集运动的影响
在运动性试验中，浮游运动如图 7A所示，各菌株呈半透明圆形运动轨迹，通过测量运动直径，缺失株ΔpepT的浮游运动能力相较于野生株显著降低(P < 0.05)，互补株部分恢复至野生株水平。群集运动如图 7B，缺失株ΔpepT的运动的菌斑直径与野生株相比，无显著差异(P > 0.05)。提示基因pepT参与副溶血弧菌的浮游运动能力，而不参与群集运动。
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| 图 7 各菌株在浮游平板和群集平板上运动情况 Figure 7 The results of swimming ability and swarming ability of strains. A: the track of three strains on swimming patterns; B: motility zone diameter (cm) measured on swimming patterns; C: the track of three strains on swarming patterns. D: motility zone diameter measured on swarming patterns. *: P < 0.05. |
2.8 各菌株鞭毛相关基因的表达水平
通过qRT-PCR分析WT、ΔpepT和CΔpepT极性鞭毛基因的转录表达情况。如图 8所示，和WT相比，ΔpepT菌株中的极性鞭毛基因flaA、fliD、flgE、flgM的mRNA水平极显著下调(P < 0.000 1)，在CΔpepT菌株中的转录水平回复至野生株水平，提示缺失pepT基因影响副溶血弧菌的极性鞭毛基因的转录。
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| 图 8 各菌株极性鞭毛基因转录水平的测定 Figure 8 Determination of the transcription levels of polar flagella-related genes in WT, ΔpepT and CΔpepT. ****: P < 0.000 1. |
2.9 各菌株对HeLa的细胞毒性
WT、ΔpepT和CΔpepT以MOI为100:1感染HeLa细胞2 h后，根据CytoTox 96试剂盒说明书操作，检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的百分含量。结果如图 9所示，ΔpepT对HeLa细胞的毒性水平显著下降(P < 0.05)，互补株的细胞毒性百分比基本与野生株水平一致。表明基因pepT缺失后能够降低副溶血弧菌对HeLa细胞的毒性作用。
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| 图 9 各菌株对HeLa细胞的毒性测定结果 Figure 9 Comparison of cytotoxic effects of WT, ΔpepT and CΔpepT. Determination of LDH release in the supernatant of HeLa cells *: P < 0.05. |
2.10 各菌株对ICR小鼠的致病性
为探讨pepT基因对副溶血弧菌毒力的影响，将WT、ΔpepT和CΔpepT菌株分别感染小鼠。如图 10所示，对照组小鼠存活率为100%，感染野生株的小鼠存活率为0，而感染缺失株ΔpepT菌株后小鼠存活率为40%，显著高于感染野生株。回补株部分恢复野生株毒力水平，其感染的小鼠存活率为30%，低于缺失株水平。以上结果提示，缺失基因pepT能减弱副溶血弧菌对ICR小鼠的致病性。
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| 图 10 各菌株感染小鼠的存活率比较 Figure 10 Survival curve of ICR mice infected with WT, ΔpepT and CΔpepT. |
3 讨论与结论
副溶血性弧菌可通过释放多种毒力因子对宿主引起细胞毒性和肠毒性作用，严重时导致脓毒症甚至死亡[23]。细菌依赖多种氨肽酶来实现各种细胞功能，如生长、新陈代谢、参与致病过程等[24–25]。氨肽酶PepT在大多数副溶血弧菌分离株中高度保守，以氨肽酶PepT作为研究对象，分析其在副溶血弧菌环境适应性和致病性中的作用，将为预防和治疗副溶血性弧菌感染提供新的策略。
副溶血弧菌作为一种栖息于海洋和河水域的革兰氏阴性细菌，其对低渗透压敏感，需要高于0.5%的氯化钠水平才能生长[26]。此外，副溶血性弧菌作为一种人类病原体，一旦进入人体宿主，与大多数肠道病原体一样，必须克服胃酸和肠道内pH变化的挑战[27]。但是本研究发现，基因pepT缺失株对酸、碱、高渗透压的抵抗力与野生株一致，即基因pepT缺失不影响副溶血弧菌对酸碱压力环境的适应性。
生物被膜是一种由附着在生命或非生命物表面以及细菌菌体和胞外基质所形成的固着群体结构[28]。细菌形成生物被膜后，对外界不利环境和宿主免疫系统[29]等比其浮游形式抵抗能力更强[30]。因此，病原体形成生物膜的能力对于提高细菌环境存活率和致病性非常重要。本研究结果表明，副溶血弧菌缺失基因pepT后生物被膜形成能力显著下降。其他细菌中也存在类似现象，例如，缺乏谷氨酸合成酶和细胞质氨基肽酶将会影响枯草芽孢杆菌JH642菌株的生物被膜的形成[31]。在粪肠球菌中，M4金属蛋白酶家族成员的氨肽酶在生物被膜环境中降解胞外化合物，用于细菌营养或信号传递[32]。基于PepT具备影响氨基酸代谢的能力，我们推测PepT可能是通过影响副溶血弧菌部分氨基酸代谢途径进而参与其生物被膜形成过程。
鞭毛介导的运动不仅影响生物被膜的形成，还与细菌快速定殖宿主细胞能力相关[33]，因此，鞭毛系统在细菌致病过程中发挥重要作用。副溶血性弧菌包含2个鞭毛系统：极性鞭毛和侧生鞭毛，前者是由极性鞭毛基因编码负责浮游运动，而后者则由侧生鞭毛基因编码负责群集运动[34]。我们证实，pepT基因缺失导致副溶血弧菌在液体表面的浮游能力极显著减弱，说明PepT能够影响副溶血弧菌的浮游运动。从相关基因的数量和表达、蛋白质合成和鞭毛旋转所需的能量来看，维持细胞运动系统是一项相当大的工程。虽然鞭毛结构复杂，但其组装过程高度有序。研究表明flaA基因编码具有功能的鞭毛丝亚基，从而产生相当多的鞭毛蛋白。FliD是组织鞭毛蛋白的脚手架结构蛋白，它对鞭毛丝的聚合至关重要。鞭毛钩子蛋白FlgE在鞭毛组装过程中发挥精细作用，利用灵活特性可以帮助鞭毛有效运转来驱动菌体[35–36]。细菌鞭毛结构的复杂性和组装的有序性依赖于相对应的基因有序表达和精细调控，因此鞭毛的组装与鞭毛基因表达是联结的。qRT-PCR试验结果发现，ΔpepT中flaA、fliD、flgE、flgM基因转录水平相较于野生株极显著下降。对细菌细胞来说，鞭毛组装是一个复杂的代谢工程，表明pepT缺失株可能通过能量代谢过程影响极性鞭毛基因的表达，调控副溶血弧菌鞭毛蛋白的组装过程，进而降低副溶血弧菌的浮游运动能力。
氨肽酶在多种细菌病原体的发病机制中起关键作用。M17家族亮氨酸氨肽酶和M28家族的精氨酸特异性氨肽酶的活性分别对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的致病性至关重要[37–38]。本研究通过体内体外试验发现，pepT基因的缺失能降低副溶血弧菌对HeLa细胞的毒性，并能够显著降低对小鼠的毒力作用，说明PepT参与副溶血弧菌的致病性。在小鼠毒力实验中，互补菌株的毒力部分回复到野生株水平，但qRT-PCR对目的基因转录分析时结果显示，互补株和野生株中pepT基因的转录水平相当，原因可能是在动物体内感染时互补株和野生株的感染动力学不同，互补质粒的表达或维持与体外存在一定差异。
综上所述，pepT基因缺失后副溶血弧菌的浮游运动性、生物被膜形成能力、细胞毒性、以及对小鼠的毒力作用均显著降低，副溶血弧菌黏附宿主和毒力因子的产生[39]与运动性有关，而且在生物膜形成的早期阶段也与鞭毛运动相关。细菌通过极性鞭毛迅速移动，快速感知外界环境[40]，因此，基因pepT缺失可能由于抑制了极性鞭毛基因的表达，从而减慢了副溶血弧菌与环境表面接触，导致生物被膜形成能力降低。基因pepT在副溶血弧菌鞭毛运动中的调控作用，以及影响生物被膜的形成机理，可能与氨肽酶影响细菌新陈代谢有关，但具体过程机制需要进一步探究。我们今后将对pepT基因具体如何影响鞭毛基因的转录水平，以及生物被膜的形成等机制展开深入研究。
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