
中国科学院微生物研究所,中国微生物学会
文章信息
- 魏漪, 肖云杰, 杨海涛, 王泽方. 2023
- WEI Yi, XIAO Yunjie, YANG Haitao, WANG Zefang.
- 聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶IsPETase及其应用展望
- Polyethylene terephthalate hydrolase IsPETase and its application prospect
- 微生物学报, 63(1): 15-29
- Acta Microbiologica Sinica, 63(1): 15-29
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文章历史
- 收稿日期:2022-04-11
- 网络出版日期:2022-06-30
塑料在现代社会中发挥着重要作用,广泛应用于包装、建筑、纺织、运输、电子设备以及工业机械等方面,也应用在人们日常生活的方方面面,极大地改变了人类的生活方式[1]。但随着塑料产品的大量使用和消费,越来越多的塑料废品在环境中积累,已经对全球的生态环境造成了严重的破坏,给人类健康也带来了严重威胁[2]。近年来,环保意识的提高激发了人们对塑料回收技术和方案的探索,不仅是为了处理越来越多的塑料废物,还为了减少塑料合成对石油资源的依赖。
众多种类塑料之中,聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)是一种以对苯二甲酸(terephthalicacid, TPA)和乙二醇(ethylene glycol, EG)为单体的聚合物。因其重量轻、绝缘性好、强度和透明度高、热性能高、耐化学腐蚀等优良性能,成为应用最广泛的聚酯塑料之一,年消费量超过3亿t,约占世界塑料总产量的13%[3]。并且,PET也是世界上回收最广泛的包装材料。早期的PET回收策略通常包括物理和化学法,但由于性能损失、二次污染和高能耗成本等问题,2类方法都未得到广泛应用[4-6]。
生物法是近年来兴起的一种新型PET降解回收技术,通过生物实体(如微生物,即细菌、真菌和海洋微藻),或酶的作用分解这类有机物质[1-2]。生物法的优点包括温和的工艺条件、相对较低的能量输入、不需要危险化学试剂和昂贵的机械,使其成为一个非常有前景的选择。重要的是,PET主链中具有可水解的化学键——酯键,使其更容易被生物降解;其他塑料如聚乙烯(polyethylene, PE)、聚苯乙烯(polystyrene, PS)、聚丙烯(polypropylene, PP)和聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)主链中高度稳定的C−C键缺乏水解性,因此其生物降解受到阻碍,必须进行预氧化或预热处理才能进一步解聚[7]。
1 PET水解酶——PETase近些年的研究表明,一些微生物已经进化到可以产生多种能够降解和加工PET的水解酶,包括脂肪酶、酯酶、羧酸酯酶和角质酶等[8-12]。然而,大多数PET水解酶对PET的底物特异性太低,转化率也较低[10, 13]。2016年研究人员发现了一种能高效降解PET的细菌菌株Ideonella sakaiensis,同时也报道了该菌分泌的具有PET降解作用的水解酶——PETase,该酶可以将PET水解为双(2-羟基乙基)对苯二甲酸(bis(2-hydroxyethyl) terephthalate, BHET)、单(2-羟乙基)对苯二甲酸[mono(2-hydroxyethyl) terephthalate, MHET]和TPA (图 1)[14]。在常温(30 ℃)和pH 7.0的条件下,IsPETase对PET薄膜和BHET的活性分别是先前已鉴定的酶TfH、LCC和FsC的120.0、5.5和88.0倍;对高度结晶的商用瓶源PET的活性比其他PET水解酶至少提高了约20倍;并且IsPETase只专一性降解PET,而不降解其他聚酯类塑料[14]。
从2016年发现PETase至今,已有多个课题组报道了PETase的三维结构[15-19],国内外也已有较多报道对PETase的结构与功能进行了综述[20-21]。该酶为典型的α/β-水解酶折叠构象,结构中心的β-折叠(β1-9)被α-螺旋(α1-7)包围。催化三联体S160-H237-D206在同源PET水解酶中严格保守,其中Ser160作为亲核试剂,催化酸His237和催化碱Asp206组成电荷中继系统。
相比于其他PET水解酶,PETase的独特之处在于:(1) PETase有高度极化的表面电荷,导致其等电点(pI)为9.6,而同源角质酶的表面分布着大量酸性和碱性残基的小斑块,使其pI更中性[18]。(2) 在活性位点方面,与Thermobifida fusca角质酶相比,在PETase中观察到活性位点的口袋相对加宽,意味着PETase更适合容纳像PET这样的长链大分子聚酯[22-23]。例如PETase口袋附近的Ser238的较小侧链有利于PET大分子进入催化中心,而角质酶的对应位置是空间位阻大得多的Phe残基[17]。(3) PETase中形成2个二硫键(DS1和DS2)。特异性DS1(Cys203-Cys239)位于活性位点附近,连接分别含有催化酸(D206)和催化碱(H237)的β7-α5和β8-α6环,与催化三联体的完整性有关[24-25]。此外,DS1还促进了β8-α6环的灵活性,PETase中的β8-α6环比其他同源酶长3个残基,因此形成了一个扩展的结合位点,为PET的结合提供了改进的柔性和更大的空腔[16, 23]。(4) 催化三联体附近的Ser214是一个关键的氨基酸取代,可以允许Trp185的“摆动”,从而提供了更宽更灵活的底物结合口袋;而在角质酶中,由于His184和Trp155侧链之间的面对面堆积作用,不允许这种灵活的“摆动”[15]。
为了阐明PETase的底物结合模式,Han等[15]解析了PETase与配体2-羟乙基甲基对苯二甲酸酯(2-hydroxyethyl methyl terephthalate, HEMT)和对硝基苯酚(p-nitrophenol, pNP)结合后的复合物结构。其中HEMT的行为类似于底物类似物,结合在催化位点处(图 2A)。HEMT的酯氧原子与H237侧链形成氢键,羰基氧原子与氧阴离子洞残基M161和Y87的主链NH基团形成氢键,苯环与W185形成边对面堆积,其他残基提供疏水相互作用。配体pNP同样位于第一个苯环结合位点,但位置比HEMT离活性位点远约2.3 Å,并且旋转约36°,与W185形成面对面堆叠(图 2B)。配体pNP的结合模式与产物更类似。
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图 2 IsPETaseR132G/S160A与配体的复合物结构[15] Figure 2 The complex structure of IsPETaseR132G/S160A and ligands[15]. Detailed interaction network in complex structures of IsPETaseR132G/S160A with ligands (A) HEMT (PDB: 5XH3) and (B) pNP (PDB: 5XH2). Ligands and amino acid residues are shown in sticks; Distances less than 3.5 Å are indicated by dashed lines. |
在另一项工作中,Joo等[16]通过分子对接预测了PETase与含有4个MHET分子的底物类似物2-HE(MHET)4[(2-hydroxyethyl-(monohydroxyethyl terephthalate)4]的结构模型。三联体残基Ser160作为亲核试剂作用于酯键的羰基碳原子。底物结合位点在酶表面上形成一个长而浅的疏水性“L”形口袋(图 3)。亚位点I和亚位点Ⅱ分别能够结合1个和3个MHET基团。亚位点I中Tyr87和Met161组成氧阴离子洞,负责稳定四面体中间体的氧阴离子[17-18],Trp185残基与第一个苯环形成面对面堆积,Met161和Ile208通过分别在亚位点I的底部和侧面提供疏水表面来帮助第一个MHET的结合。亚位点Ⅱ形成的口袋比亚位点I更长、更浅,进一步分为Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc三部分。亚位点Ⅱ与底物分子之间结合主要由疏水相互作用介导和稳定,在亚位点Ⅱc中也有极性作用的参与。
除了分子对接之外,近些年已经开发出其他计算策略来引导我们提出PET水解酶的催化机制,例如利用分子动力学模拟(molecular dynamics, MD)可以对酶催化反应中原子的运动和热力学进行解释,帮助我们理解PETase的催化机理[26-27]。并且,MD还可以提供由PET的结合诱导的酶结构构象变化的动态信息,以及酶对与位点结合的底物的选择性和亲和力[28-29]。因此,计算和实验研究相结合所带来的重大进步以及尚在开发的计算工具中蕴含的巨大潜力鼓励我们优先考虑这些领域的研究,从而为PET水解酶突变体的合理设计研究提供了依据。
2 PETase的蛋白质工程到目前为止,虽然PET的生物降解具有诸多优势,但由于PET水解酶的催化效率和热稳定性等方面存在明显不足,导致目前PET水解酶的周转率不足以用于工业应用[30]。即使是对高结晶度PET表现出特异性的IsPETase,也被认为具有相对较低的催化活性[31]。随着PET水解酶的晶体结构和催化机制的阐明,许多不同的研究小组一直致力于将酶的结构与功能联系起来,人们总结了大量与PET水解活性相关的关键特征,可作为筛选更多潜在酶的标准[23, 32]。如今,通过蛋白质工程对酶进行修饰,可能会提供更多机会来产生具有高活性、特异性、稳定性、耐热性以及可重复使用性的新型酶,推动PET水解酶的工业应用[33-34]。
2.1 底物结合口袋改造酶和底物之间的识别和结合是发挥水解活性的关键步骤。PET水解酶的活性口袋必须有足够的空间来容纳大分子底物。Liu等[24]提出,PETase的宽底物结合口袋对于其出色的降解高结晶度PET的能力至关重要。有趣的是,Austin等[18]将PETase中2个活性位点残基突变为角质酶中的保守氨基酸(S238F/W159H)后,尽管观察到结合口袋的缩小,但因突变后的Phe238与底物之间增强的芳香族相互作用,PET降解活性反而得到提高。这表明虽然PETase已在富含PET的环境中得到进化,但其底物结合口袋并没有完全优化,仍具有提升的潜力。许多课题组已经开展了对PETase的定点突变研究,以发现对其催化起重要作用的氨基酸残基(表 1)。
Mutation | PET substrate | Degradation activitya | Assay conditions | Reference |
Y87A | Drinking bottle | 3.1 | 30 ℃, pH 9, 48 h | [24] |
Commercial PET film | 0.4 (18 h); 0.5 (36 h) | 30 ℃, pH 9, 18/36 h | [16] | |
PET film | 0.1 (TPA); 0.8 (MHET) | 30 ℃, pH 9, 42 h | [15] | |
R90A | Biaxially oriented PET film | 1.4 | 30 ℃, pH 8.5, 48 h | [35] |
L117F | Biaxially oriented PET film | 2.1 | 30 ℃, pH 8.5, 48 h | [35] |
W159A | Drinking bottle | 1.3 | 30 ℃, pH 9, 48 h | [24] |
Commercial PET film | 0.2 (18 h); 0.2 (36 h) | 30 ℃, pH 9, 18/36 h | [16] | |
PET film | 0.1 (TPA); 0.2 (MHET) | 30 ℃, pH 9, 42 h | [15] | |
W159H | Drinking bottle | 2.4 | 30 ℃, pH 9, 48 h | [24] |
Commercial PET film | 0.5 (18 h); 0.6 (36 h) | 30 ℃, pH 9, 18/36 h | [16] | |
PET film | 0.1 (TPA); 0.1 (MHET) | 30 ℃, pH 9, 42 h | [15] | |
I208F | Biaxially oriented PET film | 2.5 | 30 ℃, pH 8.5, 48 h | [35] |
A209I | Drinking bottle | 1.3 | 30 ℃, pH 9, 48 h | [24] |
S214H | Drinking bottle | 1.9 | 30 ℃, pH 9, 48 h | [24] |
S238F/W159H | PET film | 2.7 | 30 ℃, pH 7.2, 96 h | [18] |
R280A | Commercial PET film | 1.2 (18 h); 1.3 (36 h) | 30 ℃, pH 9, 18/36 h | [16] |
a: Ratio of value of the PET degradation activity of the PETase mutant to that of the wild type. |
Joo等[16]发现,Arg280由于其正电荷和略微突出的结构,似乎阻碍了底物结合位点的延伸。当Arg280突变为侧链较小的Ala后,突变体IsPETaseR280A的活性在18 h内增加了1.2倍,在36 h内增加了1.3倍。Ma等[35]针对IsPETase底物结合口袋周围6个关键残基,使用侧链较小或更疏水的氨基酸进行替换,以提高酶对底物的结合能力。结果显示,与野生型相比,R61A、L88F和I179F突变体的活性分别增加了1.4、2.1和2.5倍。Liu等[24]利用定点诱变设计了一系列IsPETase突变体,将位于底物结合口袋中的Trp159突变为丙氨酸或组氨酸时有效提高了酶活性;以及用丙氨酸取代Tyr87残基(氧阴离子洞残基),使活性提高了3.1倍。Chen等[36]通过PETase的结构分析鉴定了独特的氨基酸S214和I218,并指出它们与W185摆动和β6-β7环柔性有关,有助于增加底物结合口袋灵活性。综上所述,合理设计已被证明是有利的工具以提高酶的活性,但其效果还远远达不到实际应用中对酶活的要求。
除了用以改善催化效率,修饰底物口袋以扩大其底物范围也是具有前景的工作[32]。通常认为IsPETase只能专一性水解PET底物。然而,在对酶催化中心的改造工作中发现了3个突变体(S93M、W159F和N241F),它们具有很强的水解萘酯的能力[19]。IsPETaseS238F/W159H能够高效降解聚(乙烯-2, 5-呋喃二甲酸酯) [poly(ethylene 2, 5-furandicarboxylate), PEF][18]。此外,一种热稳定突变体不仅能有效降解PET膜,而且对聚对苯二甲酸丁二醇酯(polybutylene terephthalate, PBT)和聚2, 6-萘二甲酸乙二醇酯[poly(ethylene 2, 6-naphthalate), PEN]具有广泛的水解能力[37]。这些结果表明,IsPETase在塑料替代品的降解方面也有着巨大的发展潜力。
2.2 热稳定性改造高结晶度PET的结构紧密、链迁移率低,导致骨架酯键的水解性极低,是限制其生物降解的最大阻碍之一。随着反应温度的增加,聚合物链会在高温下波动,使得PET链的柔性增加,能够增加它们对酶的可及性,从而增加PET底物和酶活性中心结合的概率[38-39]。2020年,Tournier等[40]发表了一项关于工程LCC突变体的突破性研究,他们通过将结合位点进行饱和突变并叠加组合,得到4种变体(ICCG、ICCM、WCCG和WCCM)将Tm提高了13.4 ℃。最终突变体能够在72 ℃、10 h内以工业相关规模将90%以上的非晶化PET解聚成单体。受此启发,越来越多的具有高热稳定性的PETase突变体被筛选或者改造出来(表 2)。
Mutation | Molecular mechanism | ΔTm/℃ | Reference |
P181A | Hydrogen bond | 0.5 | [41] |
S121E | Hydrogen bond | 7.21 | [41] |
D186H | Hydrophobic interaction | ||
N246D | Salt bridge | (S121E/D186H/N246D) 11 | [42] |
N233C/S282C | Disulfide bond | 14.1±1.3 | [43] |
W159H | Hydrogen bond | 31 | [37] |
T140D | Hydrogen bond | ||
I168R/S188Q | Hydrogen bond, salt bridge | ||
A180I | Hydrophobic interaction | ||
R280A | Hydrophobic interaction | ||
S214H/L117F/Q119Y | π−π interaction | ||
G165A | Conformational entropy | ||
W159H/F229Y | Hydrogen bond, salt bridge | 10.4 | [44] |
K95N/F201I | – | 5.1 | [45] |
P181V | Hydrogen bond | (HotPETase) 34.4 | [46] |
S214Y | π−π interaction | ||
N233C/S282C | Disulfide bond | ||
–: None. |
Son等[41]基于结构发现IsPETase的β6-β7连接环的B因子值相对较高,是结构中最灵活的区域之一,而同源酶TfCut2中的对应区域形成了相当稳定的结构,位于环上的His156残基与α2螺旋上的Asp94残基之间形成氢键(图 4)。因此,Son等[41]设计生成了IsPETaseS121E/D186H突变体,通过引入氢键来增加β6-β7连接环的稳定性,结果证明形成水介导的氢键,使突变体的Tm值比IsPETaseWT高了7.21 ℃。
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图 4 与TfCut2 (A)和IsPETaseS121E/D186H (B)的β6-β7连接环稳定性相关的残基[41] Figure 4 Residues associated with the stability of the β6-β7 loop of TfCut2 (A) and IsPETaseS121E/D186H (B)[41]. TfCut2 (PDB: 4CG1) and IsPETaseS121E/D186H (PDB: 6IJ4) are shown with blue and pink colored cartoon models, respectively; Amino acids at the mutated site are shown with sticks; Hydrogen bonds are shown in black dashed lines represent; Black sphere represents the water molecule. |
Son等[42]在以上突变的基础上又进一步设计,其中IsPETaseN246D变体表现出活性增加了2.6倍,并且热稳定性增强。晶体结构证明,带负电荷的N246D残基和带正电荷的Arg280残基形成强烈结合的盐桥,使得热稳定性增加,并且盐桥改变了Arg280的构象,显示了一个扩展的亚位点Ⅱc,进一步增加了底物的结合空间以及结合能力,从而提升了降解活性(图 5)。
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图 5 IsPETaseWT (A)和IsPETaseN246D (B)的局部结构比较[42] Figure 5 Comparison of local structures of IsPETaseWT (A) and IsPETaseN246D (B)[42]. IsPETaseWT (PDB: 5XJH) and IsPETaseN246D (PDB: 6KUO) are shown with green and slate colored cartoon models, respectively; Arg280, Asn246 residues are shown as sticks; Salt bridges between residues are indicated by black dashed lines. |
Zhong-Johnson等[43]根据Oda等[38]的研究,将IsPETase中与角质酶突变体Cut190* (Cut190S226P/R228S)的Asp250和Glu296对应的残基N233和S282突变为半胱氨酸,预测能够在β8和β9之间形成一个二硫键。实验结果表明这一突变体的热稳定性提高了(14.1±1.3) ℃。最终突变体IsPETaseR280A/S121E/D186H/N233C/S282C的Tm值比野生型高21.3 ℃,催化速率提高了5–7倍。
算法的高速发展提高了人们对生物分子结构和功能的操纵能力。Cui等[37]引入了一种蛋白质工程的贪婪累积策略(GRAPE),以最大限度地减少实验工作,同时最大限度地探索基因突变集之间的可加性和协同效应。通过筛选获得最佳命中(DuraPETase,M10),其热稳定性显著增强(Tm值为77 ℃;ΔTm=31 ℃),对半结晶PET具有良好的降解性能,并在温和条件下大大提高了长期存活率,酶促反应可以在37 ℃条件下持续10 d,降解量超过300倍。
Meng等[44]开发了一个网络工具Premuse,将两两比对、序列加权、位置特异性氨基酸概率(PSAP)计算和首选突变选择相结合,根据序列进化预测突变。最终得到突变W159H和F229Y的Tm值分别比野生型高6.8 ℃和3.6 ℃。IsPETaseW159H/F229Y的Tm值为61.2 ℃,提高了10.4 ℃。在40 ℃孵育24 h后,IsPETaseW159H/F229Y释放的化合物总浓度比野生型释放的增加了40倍。
Brott等[45]使用易错PCR技术,基于IsPETase的耐热三重突变体(IsPETaseR280A/S121E/D186H,TM)生成了一个突变体库,通过筛选获得4种Tm值更高的变体。最有希望的IsPETaseTMK95N\/F201I突变体Tm值比原突变体高5 ℃。尽管这种突变体在较低的温度下对PET的活性略低,但其热稳定性的提高使其在高达60 ℃的反应温度下成为更活跃的PET水解酶。他们还将其与之前报道的优秀IsPETase突变体结合,实现了更高的热稳定性与降解活性。
最近,曼彻斯特大学Bell等[46]建立了一个自动化的高通量定向进化平台,他们以耐热突变体IsPETaseS121E/D186H/R280A(IsPETaseTS)[41]作为工程的起点,通过提高反应温度和延长反应时间在各轮中逐渐增加进化压力。在6轮进化后得到了最耐热和最活跃的变体HotPETase,包含了21个突变:3个来自起始蛋白质模板,2个来自二硫键(N233C-S282C)的合理引入,以及定向进化发现的16个。HotPETase的Tm为82.5 ℃,可在PET的玻璃化转变温度下工作,是迄今为止IsPETase衍生物中最高的。
3 PETase的高效表达系统由于在野生菌株中,PETase的表达水平不足以满足大规模生物降解的需求。因此,有必要开发利用模式微生物的重组表达系统,以使酶蛋白高水平表达且易于使用。此外,PET作为高分子聚合物,不能进入细胞,因此将PET水解酶高效表达到细胞外以用于实际应用得到了广泛的研究[6, 34]。目前,一些微生物如细菌、真菌和海洋微藻已被应用于PETase的重组表达[3]。
3.1 分泌表达系统选择最佳信号肽是一种常用的改进异源PET水解酶分泌的策略。一项研究将来自大肠杆菌的Sec依赖性和SRP依赖性信号肽分别与PETase相融合,其中SP LamB和PETase成功产生了6.2 mg/L的PETase[47]。另一项研究则通过随机诱变获得了进化的信号肽PelB (G58A),在大肠杆菌中使PETase的分泌量提高了1.7倍[48]。Cui等[49]通过将SP信号肽增强子B1融合到常用SP(PelB)的N端,使IsPETase的分泌效率大幅度提高了62倍。一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168在其天然信号肽双精氨酸信号肽(signal peptide, SP)的指导下能够将PETase分泌到培养基中,而双精氨酸易位(Tat)复合物的失活使PETase的分泌量提高了3.8倍[50]。
此外,有研究人员分别在巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌中表达了PETase,发现由于毕赤酵母的蛋白质半衰期保护机制,从酵母中生产的酶的活性高于在大肠杆菌中表达的酶[36]。另有报道发现,一种光合微藻Phaeodactylum tricornutum经改造后能够分泌PETase,并且这种PETase能够有效降解不同的底物,在30 ℃甚至中温温度(21 ℃)发挥活性[51]。Kim等[52]改造了一种绿藻Chlamydomonas reinhardtii能够生产PETase,它可以在4周内在30 ℃下完全降解PET。
3.2 细胞表面展示酶的细胞表面展示是设计全细胞催化剂的一种有前途的策略,可以克服酶分泌效率低下和细胞质毒性的瓶颈,从而简化生产程序和下游工艺。与游离酶相比,表面展示技术不仅能够避免复杂的纯化步骤,而且可以重复使用,解决了环境因素影响下酶活性降低,甚至酶失活的难题[53]。
本课题组开发了一种酵母表面展示PETase的全细胞生物催化剂,以克服天然IsPETase对高结晶度PET的低酶活性[54-55]。我们将IsPETase基因序列构建入工程毕赤酵母细胞,使用酵母细胞壁内的内源性糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)蛋白为锚定蛋白,通过灵活的连接序列将酶锚定在细胞表面(图 6)。实验证明,这种全细胞生物催化剂对高结晶度PET的转化率较野生型PETase提高了约36倍,并且验证了pH稳定性和热稳定性的提高,体系可以重复使用7次而没有明显的活性损失,这种方法为高效的生物循环提供了一种有前途的途径。
此外,Heyde等[56]最近提出了一种使用大肠杆菌BL21(DE3)对PETase变体进行表面展示表达的方法,他们通过LppOmpA跨膜锚定蛋白与PETase相连,以与细胞表面暴露的纳米抗体结合的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)信号来测量总表面展示的蛋白质。该程序提供了一个便利的筛选平台,可以整合到高通量筛选系统中实现快速和简单的活性读数,从而快速筛选新型PETase变体。然而,目前的这些全细胞催化剂策略与一些仅在高温下起作用的PET水解酶不兼容。因此,目前也有一些研究开发用于展示耐热酶的嗜热表达系统[57]。
4 提高PETase的底物可及性PET本质上是一种疏水性材料,表面润湿性差。而酶促PET水解是一种表面侵蚀过程,水(作为溶剂和反应物)和生物催化剂都不能渗透进入聚合物的内部,所以只能获得有限数量的表面酯键[26]。这意味着酶对PET表面的亲和力非常重要,因此吸附成为水解PET的关键过程。
为了克服这个过程中的局限性,常常添加一些辅助分子来介导PET水解酶与底物的结合。表面活性剂是一种两亲分子,能够与PET表面相互作用,带负电的头部基团将朝向水相,并将PET表面转化为带电表面。Furukawa等[58]通过研究表明,用阴离子表面活性剂预孵育PET膜,可将PETase活性提高120倍。疏水蛋白是一种两亲性蛋白质,可以在亲水-疏水界面上自组装后逆转表面的性质。Puspitasari等[59-60]分别用疏水蛋白RolA和HGFI预处理PET表面,从而使酶更容易接触和攻击表面,从而使水解PET的重量损失从大约18%增加到34%。本课题组同样尝试将吸附和酶解的过程有机统一起来。我们在酵母细胞表面展示PETase的基础上实现了疏水蛋白HFBI和PETase的共展示,实验结果表明疏水蛋白的自组装可以控制PETase在PET表面的吸附行为,并为PETase提供良好的亲水环境,可极大提高酶的催化效率[61]。
此外,与添加辅助分子不同,将两亲模块与PET水解酶进行融合表达是一种更具成本效益和前景的方法。Dai等[62]在PETase的C末端添加了几个可以粘附到疏水性聚合物表面的聚合物结合结构域,例如纤维素结合结构域(carbohydrate binding modules, CBM)、聚(3-羟基丁酸酯)结合结构域(polyhydroxyalkanoate depolymerase binding modules, PBM)和疏水蛋白(HFB4)。这些结构域的存在可以改善酶与PET表面的结合,并使得酶的水解活性提高了约86%。值得注意的是,空间分布在融合结构中十分重要,当结合结构域连接到PETase的N端时,这种效应消失。
5 PETase与MHETase双酶系统MHET和BHET是众所周知的PET降解中间体,它们会抑制PET水解酶催化的解聚效率。其中MHET作为PETase降解PET的主要产物,对PETase的活性具有较强的抑制作用。因此,I. sakaiensis产生了独特的MHETase以减少产物抑制,它可以与PETase高度协同将PET薄膜有效转化为单体。Knott等[63]建立了一种嵌合双酶系统,其中MHETase通过不同长度的甘氨酸-丝氨酸接头(8、12或20个氨基酸残基)与PETase相连,从而使PET降解效率至少提高了2.8倍。而连接PETase的C端和MHETase的N端的嵌合结构则不能表达蛋白。另一项工作中,Qi等[64]用2种可以分别分泌PET水解酶(PETase)和对苯二甲酸单羟乙酯水解酶(MHETase)的工程化枯草芽孢杆菌构建了2种微生物联合体。微生物联合体的降解效率显著提高,可在24 h内完全降解2 g/L BHET,并可以在7 d内降解13.6% (重量损失)的PET薄膜。
6 应用展望随着塑料行业的持续快速发展,巨大的生产能力和低效的回收导致了一个全球性的挑战,大多数塑料制品无法进入到闭环回收利用。生物回收和生物升级循环是当前塑料回收最有希望的解决方案,其中要克服的一个挑战是处理不同塑料的组合,因为任何酶并不对所有塑料底物都具有活性[65]。多酶系统的设计将是一个有前途的领域,目前中国已经与欧洲合作开发使用酶混合物进行塑料降解的项目[66]。另一种方法是通过微生物联合体对塑料进行工业降解[64, 67]。目前,微生物群落已被证明可降解聚氨酯(polyurethane, PU)、聚乙烯(polyethylene, PE)、聚丙烯(polypropylene, PP)和聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)等材料[68-70]。这些结果突出了人工微生物菌群在塑料生物降解中的潜力。
同时,新型微生物聚酯水解酶的发现和高活性变体的构建仍然是开发塑料废物生物催化回收工艺的关键挑战。随着基因组测序和转录组工具的发展,越来越多的遗传资源被上传到公共数据库中。为了克服功能性微生物或酶筛选的瓶颈,目前已经开发了各种高通量筛选技术,其中一种微流控荧光激活液滴分选技术(fluorescence-activated droplet sorting, FADS),开辟了快速获得用于生物降解的新型微生物和酶的可能性,还允许筛选随机诱变和定向进化的突变体,具有出色的通量、灵敏度和特异性,具有广泛的应用前景[71]。
另一个挑战也应该包括在讨论中,即聚合物降解产物的再利用可能性,特别是对于各种增值产品的转化和生产[72]。Kim等[73]发明了一种One-Pot工艺,他们利用甜菜碱催化剂将聚合物的酶解与糖酵解过程结合起来,将产物TPA和EG分别生物转化为高价值产品原儿茶酸(protocatechuic acid, PCA)和乙醇酸(glycolic acid, GLA)。Werner等[74]在恶臭假单胞菌KT2440中进行了4次连续的代谢工程工作,将PET和BHET串联化学解构和生物降解升级为一种具有性能优势的产品β-酮己二酸(β-ketoadipic acid, βKA)。这些研究有望在未来改善废弃塑料的循环利用、升级和价值化。
最后,我们迫切需要安全无毒的化石燃料塑料替代品。据估计,全球化石燃料总产量的近8%被用作原材料或为塑料制造提供能源,导致了大量温室气体排放[7]。可生物降解塑料和生物塑料(包括由可生物降解聚合物组成的塑料)是化石燃料塑料的有希望的替代品,前者更容易被微生物降解,例如聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoates, PHA)、聚丙内酯(polypropiolactone, PPL)、聚(ε-己内酯) (polycaprolactone, PCL)、聚(l-乳酸) (polylactic acid, PLA)等[75];而后者可以通过酶催化反应轻松生产,包括2, 5-呋喃二甲酸二乙酯(diethyl furan 2, 5-dicarboxylate)和间苯二甲酸二乙酯(diethyl isophthalate, DEIP)等[72]。这些替代方案将有效减少塑料合成对化石燃料的需求,可以为人类和其他生物实现安全和可持续的环境。
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