基因编辑(gene editing)是一种可精确对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术，主要包括基于锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)^[1]、转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)^[2]和规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)等进行的编辑技术^[3-4]。CRISPR/Cas9系统是基于古细菌或者古生菌的获得性免疫系统而发展起来的一种快速、高效和稳定的基因编辑技术^[5-6]。该系统通过设计一条或者多条靶向目的基因的guide RNA引导Cas9对目的基因进行切割^[7]，然后通过同源重组或者非同源末端连接的方式进行修复使基因片段发生缺失、插入或替换，从而使基因发生敲除^[8]。该技术易于设计、周期短、插入效率高、操作灵活便捷且适用于多种细胞类型和生物^[9-10]，已经广泛应用在医学、生命科学等多个领域^[11-12]。

蛋白的翻译后修饰主要是在氨基酸残基上以共价连接的方式加上或者除去修饰基团，从而发挥蛋白调控功能，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化、SUMO化、乳酸化和泛素化等^[13-14]。泛素化修饰是将泛素分子共价连接到蛋白质底物上，形成结构与功能复合体，参与调控细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、修复DNA损伤和免疫炎症等几乎一切生命活动^[15]。泛素化是一个可逆的过程，去泛素化酶能够除去底物蛋白的泛素修饰，从而调节细胞功能。去泛素化酶不仅可以逆转底物蛋白的泛素化过程，而且可以参与信号转导的调节，比如调控基因转录和DNA损伤修复、细胞分裂和细胞凋亡等^[16-18]。

泛素特异性蛋白酶30 (ubiquitin-specific protease 30, USP30)是一种属于USP亚家族的去泛素化酶(deubiquitinase, DUBs)，位于线粒体外膜和过氧化物酶体。USP30可以抑制由泛素连接酶PARK2和蛋白激酶PINK1介导的线粒体自噬，调节线粒体的动态变化；也可以通过抑制PEX2的E3泛素连接酶活性来阻止过氧化物酶体吞噬^[19]，而敲除USP30则会诱导过氧化物酶体吞噬^[20-21]。有研究表明，USP30主要逆转线粒体上Parkin依赖的TOM20泛素化，USP30缺失则会促进去极化诱导的细胞死亡^[22]。在神经元中，过表达USP30阻止Parkin介导的线粒体自噬，而降低USP30的活性则增强了线粒体的降解，敲低USP30能缓解Parkin病理活性突变所引起的线粒体自噬障碍，以及在Parkin或者PINK1缺陷的果蝇中增强线粒体的完整性^[23]。在肺腺癌细胞中，小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)筛选发现USP30是参与肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)诱导的细胞散射反应的因素，表明USP30在癌细胞转移中具有重要作用。USP30的泛素水解活性可以去除K6、K11、K48和K63连接的泛素链，但对以K6连接的泛素链最为有效^{[22, 24]}。USP30的缺失导致K6连接的泛素链丰度明显高于K11、K48和K63连接的泛素链，并促进神经元中线粒体的降解^[24-25]。USP30也可以去泛素化修饰和稳定动力相关蛋白DRP1，促进线粒体形态、脂质代谢和肝癌的发生的调节，抑制甘油磷酸-O-酰基转移酶(glycerone-phosphate O-acyltransferase, GNPAT)和线粒体动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1, DRP1)可显著降低脂质代谢和肝癌的发生^[26]。

塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)是我国在2015年发现的一种新的猪水疱病病原，其感染引发的水疱病与口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)、猪水疱病(swine vesicular disease, SVD)和水疱性口炎(vesicular stomatitis, VS)引起的病变极为类似^[27]，但由于SVA感染与致病机制仍不清楚，仍未有商品化的疫苗或药物问世。为了研究宿主USP30蛋白相关免疫反应和SVA感染过程的作用机制提供了良好的细胞模型，本研究利用CRISPR/Cas9技术建立USP30基因敲除细胞系，为开展宿主USP30蛋白调控病毒复制的机制研究提供了关键工具和一定的理论依据。

1 材料与方法 1.1 细胞、病毒及质粒

HEK-293T细胞[美国模式菌种收集中心(ATCC)]、pcDNA3.1-Myc-vec空载体、pcDNA3.1-Myc-USP30 (融合表达含有Myc标签的USP30蛋白)、SVA-eGFP毒株和SVA-CH-FJ-2017毒株保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队与动物疫病防控全国重点实验室。pSpCas9(BB)- 2A-Puro(pX459)载体由中国农业大学吴森教授惠赠。

1.2 试剂及抗体

大肠杆菌Trans5α感受态细胞、T4 DNA连接酶、LA Taq酶、T-Vector pMD^TM 19载体、DNA Ligation Kit (Mighty Mix)、Trizol试剂购自宝日医生物(北京)有限公司；ChamQ Universal SYBR^® qPCR Master Mix购自诺唯赞生物科技股份有限公司；预染蛋白Marker购自雅酶生物；jetPRIME^® (Polyplus transfection reagent)转染试剂购自Polyplus-transfection公司；DMEM细胞培养基、PBS溶液、0.25% EDTA胰酶和新生牛血清(FBS)均购自BI公司；胶回收试剂盒、微量DNA提取试剂盒购自OMEGA公司；嘌呤霉素购自北京索莱宝科技有限公司；大提质粒试剂盒购自MACHEREY-NAGEL公司；USP30抗体(TD4590S)购自Abmart公司；HRP-山羊抗小鼠IgG (H+L) (BF03001)、HRP-山羊抗兔IgG (H+L) (BF03008)购自北京博奥龙公司；小鼠抗β-actin单克隆抗体(ARM2001)购自上海诺莱生物。塞内卡病毒VP2兔多抗由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队制备保存。

1.3 sgRNA靶点设计

利用Ensemble数据库查询USP30基因序列，在USP30基因不同转录本第一个外显子区段的重叠区设计靶点。

根据CRISPR/Cas9设计原则，登录CRISPR在线设计网站http://crispor.tefor.net/进行sgRNA的设计，分别命名为USP30-sgRNA1、USP30-sgRNA2；在sgRNA片段正向序列的5ʹ端加入CACC粘性末端，在反向序列的5ʹ端加入AAAC粘性末端，作为靶向USP30基因的sgRNA寡聚核苷酸(sgRNA1-oligo)。所述sgRNA-oligo由金唯智生物科技有限公司合成，详细序列见表 1。

1.4 pX459-sgRNA重组质粒的构建

pX459-sgRNA重组质粒的构建：(1) 退火。将合成的sgRNA稀释至100 μmol/L，配制共10 μL反应体系：上游引物(10 μmol/L)4.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 4.5 μL，10×LA PCR Buffer 1 μL，轻柔混匀。退火程序：95 ℃，10 min；退火完成后自然放凉反应体系，使上下游引物形成双链。(2) pX459载体质粒的酶切：利用Bbs Ⅰ限制性内切酶酶切pX459载体，共配制20 μL酶切体系如下：pX459载体5 μL，Bbs Ⅰ 1 μL，10×Buffer 2 μL，ddH₂O 12 μL。37 ℃酶切3 h，核酸电泳纯化回收线性化片段。(3) pX459- sgRNA重组质粒的构建：将纯化回收pX459线性化片段产物与双链sgRNA-oligo进行连接反应，反应体系：T4 Ligase 0.5μL，10×T4 Ligase Buffer 0.5 μL，pX459酶切纯化片段0.5 μL，双链sgRNA-oligo 3.5 μL，共5 μL体系。16 ℃过夜连接后转化至Trans5α感受态细胞，克隆扩增重组质粒。转化程序：将50 μL的Trans5α感受态细胞与500 ng连接产物混合，冰上放置30 min。42 ℃水浴热激45 s，取出冰浴2 min。加入无抗性LB培养液500 mL，37 ℃、220 r/min摇菌60 min。将复苏好的菌液4 000 r/min室温离心5 min。吸去400 μL上清后，将剩余的上清与沉淀的菌体充分悬浮，利用涂菌棒将转化的大肠杆菌涂布在具有氨苄抗生素抗性的LB平板上，37 ℃温箱培养12 h，观察生长状况。挑取单克隆菌落，利用含有氨苄抗生素抗性的LB液体培养基摇菌12 h，提取质粒并测序验证。

1.5 细胞的转染

将细胞铺至培养皿中，待细胞生长到70%–80%时，可以进行转染实验；取实验所需数量的高压灭菌的EP管，每管加入200 μL配套提供的专用缓冲液，每管加入转染所需真核表达质粒DNA，涡旋均匀；按照DNA: jetPRIME^®转染试剂=1:2 (体积比)的比例将jetPRIME^®转染试剂加入到DNA溶液中，涡旋10 s，然后快速减速，室温孵育10 min使形成DNA-jetPRIME^®复合物；细胞培养液更换为新鲜的完全培养液，并将DNA-jetPRIME^®复合物逐滴添加到培养皿中，轻轻地摇动培养皿，使其均匀分布；在37 ℃、5% CO₂培养箱中继续培养，12 h后将转染的细胞均分为3份铺至新的培养皿中，并加入嘌呤霉素筛选。

1.6 T7EI实验

使用微量DNA提取试剂盒提取细胞DNA后，对目的片段进行扩增并胶回收，将胶回收的目的片段进行变性后再退火。将再退火的产物使用T7核酸内切酶酶切，反应体系：再退火产物8 μL，T7核酸内切酶1 μL，buffer 1 μL。37 ℃酶切1 h后加入10×Loading Buffer终止反应。核酸电泳检测酶切是否成功。check引物序列F：5′-GTAGGGTGTCTGCCCGAGGTGGGTAGTT- 3′；R：5′-TATCAAGTGTTGGTATTGTATTTACCT G-3′。

1.7 连接产物转化

将连接至T-Vector pMD^TM 19载体的混合物加入100 μL Trans5α感受态细胞中，轻轻混合并置于冰上30 min；42 ℃水浴45 s后迅速转入冰中放置2 min；加入800 μL无抗LB液体培养基，37 ℃振荡培养60 min；取100 μL涂在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上，37 ℃过夜培养；挑选白色阳性菌落进行扩大培养。

1.8 有限稀释法

将嘌呤霉素筛选的阳性细胞消化后，稀释细胞浓度至10个细胞/mL，将稀释的细胞加入96孔板(每孔加入0.1 mL培养基)中，于37 ℃、5% CO₂培养箱中继续培养；7 d后，标记细胞形态正常且单一的细胞孔；继续培养7 d后，选取状态良好的标记细胞进行传代扩大培养。

1.9 Western blotting蛋白检测

收取细胞样品，培养皿中加入适量的细胞裂解液充分裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min离心10 min后吸取80 μL上清，并加入20 μL 5×SDS上样缓冲液，金属浴10 min使蛋白变性，–40 ℃保存。SDS-PAGE凝胶电泳后通过湿转法进行转印，转印结束后5%脱脂奶粉封闭2 h；1×TBST清洗NC膜2次，一抗(USP30兔抗) 4 ℃过夜孵育后，1×TBST清洗NC膜3次，羊抗兔IgG (IgG-HRP)为二抗，室温孵育2 h。使用凝胶成像仪成像，分析结果。

1.10 回补实验

将正常传代的野生型HEK-293T细胞和USP30基因敲除细胞分别铺于培养板中，待其密度长至80%左右时，野生型HEK-293T细胞、USP30基因敲除细胞和USP30基因敲除细胞分别转染pcDNA3.1-Myc-vec、pcDNA3.1- Myc-vec和pcDNA3.1-Myc-USP30质粒，24 h后进行接毒感染。

1.11 细胞接毒感染

将细胞状态良好的野生型HEK-293T细胞和USP30基因敲除细胞分别铺于6孔板中，待细胞密度长至90%时，使用PBS清洗细胞以去除残留血清；随后用SVA病毒感染细胞于37 ℃、5% CO₂培养箱中吸附1 h后，更换含有1% FBS的DMEM维持液，放置于培养箱中继续培养。

1.12 实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, RT-qPCR)

SVA病毒感染12 h后，收取细胞，使用Trizol法提取RNA并反转录成cDNA进行实时荧光定量PCR，以GAPDH基因为内参，检测SVA的转录水平。实时荧光定量PCR反应体系：ChamQ Universal SYBR^® qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ddH₂O 8.2 μL，cDNA 1 μL。反应程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火34 s，循环扩增40次。

1.13 统计学分析

实验数据均使用GraphPad 9.0软件进行分析，实验的组间比较利用t-test进行统计学分析，**：P<0.01代表具有极显著性差异。

2 结果与分析 2.1 sgRNA重组质粒的鉴定

将构建的pX459-sgRNA质粒进行PCR扩增，并测序鉴定。测序结果表明pX459-sgRNA质粒构建成功，分别命名为pX459-USP30- sgRNA1、pX459-USP30-sgRNA2。载体信息和克隆位置如图 1A所示。重组质粒测序结果如图 1B、1C所示，利用通用引物检测所构建质粒得到的序列与pX459载体进行比对，与预期结果相符。表明表达sgRNA的质粒pX459-USP30- sgRNA1、pX459-USP30-sgRNA2构建成功。

2.2 USP30基因缺失细胞株的筛选和鉴定 2.2.1 sgRNA酶切鉴定

将构建成功的pX459-sgRNA重组质粒共转染至HEK-293T细胞并设置3个重复，分别标记为#1、#2、#3，将细胞重新置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h后，用含有嘌呤霉素(浓度8 μg/mL)的完全培养基处理细胞2–3 d，筛选阳性细胞，收取小部分细胞样品提取细胞基因组DNA，使用sgRNA check引物进行PCR扩增，将野生型HEK-293T细胞设为对照，阳性筛选组细胞扩增到约2 000 bp大小的片段，与预期设计片段大小相符(图 2A)。胶回收目的条带，变性再退火后，使用T7核酸内切酶切割，结果如图 2B所示，均有酶切条带，说明均发生了有效的酶切。将PCR扩增产物测序，峰图中出现套峰，表明扩增产物中发生了基因编辑。

2.2.2 USP30基因敲除细胞筛选

利用有限稀释法将嘌呤霉素筛选阳性的细胞加入96孔板中，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养7 d，标记细胞形态正常且单一的细胞孔并进行扩大培养，培养7 d的部分单克隆细胞团如图 3所示。

2.2.3 不同单克隆细胞株USP30蛋白表达水平的检测

将扩大培养后的单克隆细胞进行Western blotting检测，结果如图 4所示，与野生型HEK-293T细胞相比，有3株候选细胞株未检测到USP30条带(分别重新编码为#1、#2、#3)，其中USP30蛋白的表达发生了缺失，表明USP30基因敲除细胞系构建成功。

2.2.4 不同单克隆细胞株USP30基因编辑方式测序分析

提取扩大培养后的单克隆细胞DNA，利用check引物对目的片段扩增并将扩增的目的片段连接T载体，转化后随机挑取5个阳性单克隆菌落扩大培养并提取质粒测序鉴定，结果显示#1、#2、#3候选细胞株的基因分别发生了134、134、131个碱基的缺失突变。结合蛋白水平检测结果，表明成功筛选出USP30基因敲除的细胞株，并命名为USP30^−/−细胞。

2.3 敲除USP30抑制SVA病毒的复制

在获得USP30基因敲除细胞系后，开展了USP30蛋白对SVA病毒复制调控的研究。SVA-eGFP分别感染野生型HEK-293T细胞和USP30^−/−细胞，结果显示USP30^−/−细胞中SVA的复制显著降低(图 5A)。Western blotting检测结果表明，USP30^−/−细胞中SVA VP2蛋白的表达水平显著低于野生型细胞，但回补USP30后，SVA VP2蛋白的表达量显著上升(图 5B)。实时荧光定量PCR结果显示，USP30^−/−细胞感染SVA后，病毒的mRNA水平相比野生型细胞显著下调(图 5C)。表明USP30在SVA病毒复制过程中发挥重要作用，USP30基因敲除后，显著抑制SVA的复制。

3 讨论与结论

CRISPR/Cas9基因编辑技术与ZNFs、TALENs相比，具有编辑效率高、成本低、操作方便等诸多优点，已经成为应用最广泛的基因编辑技术。本研究采用CRISPR/Cas9技术成功构建了USP30基因敲除的HEK-293T细胞系。首先成功构建了pX459-sgRNA重组质粒，共转染HEK-293T细胞后，利用嘌呤霉素筛选出阳性细胞通过有限稀释法获得了备选单克隆细胞株，筛选出USP30基因发生了碱基缺失突变，Western blotting也未检测到USP30蛋白表达的细胞株，成功获得了USP30基因敲除细胞系，为下一步研究USP30功能建立了稳定的细胞模型和工具。

USP30作为USP去泛素化酶家族成员，是位于线粒体外膜上的跨膜DUB，其功能研究主要集中在其对线粒体自噬的调节^{[24-25, 28]}。作为去泛素化酶，USP30在癌症中也发挥着重要作用。在HCCs小鼠中，USP30含量丰富，而USP30缺失小鼠肿瘤结节减少，肿瘤负担降低，会减弱脂肪的生成与炎症和肿瘤的发生^[29]。USP30还可以调节BAX/BAK依赖的细胞凋亡，USP30的缺失可使癌细胞对BH3类似物敏感。USP30可能不仅是治疗帕金森综合症的靶点，而且也是联合抗癌治疗的潜在靶点^[30]。但USP30对病毒复制的影响未曾有报道。本研究利用构建的USP30基因敲除细胞系对USP30基因在SVA感染过程中的作用进行探究。结果表明，与正常野生型HEK-293T细胞相比，USP30^−/−细胞中SVA表达量显著降低，表明敲除USP30基因能够显著抑制SVA在HEK-293T细胞中的复制，但在回补USP30后，SVA VP2蛋白的表达量显著上升，说明其是抑制SVA感染复制的一个重要靶点。USP30在调控SVA病毒复制过程中发挥重要作用，但其在宿主抗病毒免疫应答中的机制仍不清楚，将利用构建的USP30基因敲除细胞系继续深入探究USP30促进SVA复制的分子机制。

综上所述，本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了USP30基因敲除的HEK-293T细胞系，为进一步揭示USP30相关免疫反应和SVA感染过程的作用机制提供了良好的细胞模型，也为开展宿主USP30蛋白调控病毒复制的机制研究提供了关键工具和一定的理论依据。