噬菌体作为众所周知的侵袭细菌的专一性病毒，其主要侵染细菌的过程包括：噬菌体吸附到细胞表面，将噬菌体的遗传物质注入细胞内，噬菌体的DNA进行繁殖，组装蛋白质外壳，进而进行噬菌体的释放过程以裂解细胞。由于其存在具有广泛性，且在工业生产中难以根除，在发酵工业中给工业生产带来严重危害，引起学者们的重视。工业发酵涉及到医药、食品、化妆品以及其他相关科研领域，是微生物在适宜的温度、pH以及其他环境条件下进行有氧或者无氧，将发酵原料转化为人类所需要工业产品的过程^[1]。工业发酵常用的发酵菌种有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等多种细菌，而噬菌体病毒是一种依附于细菌存在的特异性病毒，由于其对工业发酵生产造成极大的经济损失，因此是一直被致力于解决的问题^[1]。在工业发酵中，噬菌体对工业发酵有着巨大的生产影响，噬菌体的污染可能会造成“倒罐” “废罐”等现象，在工业中会造成严重的经济损失^[2]。

防治噬菌体污染的传统措施包括生产环境的净化、菌种轮换、噬菌体抑制剂的使用等方法^[3]，由于其存在成本高、污染大以及噬菌体无法根除的特点，21世纪以来，随着生物技术以及合成生物学的发展，噬菌体的防治手段逐渐从传统的物理化学防治转至生物防治，在生物防治方向，抗噬菌体菌株的选育成为研究的重点。2018年刘颖以乳杆菌烈性噬菌体P1及其宿主菌植物乳杆菌(Lactobacilus plantarum)为研究对象，采用次级感染的方法筛选抗噬菌体植物乳杆菌自发突变的驯化菌株，该菌株对噬菌体P1具有耐受能力^[4]；2019年Li等构建噬菌体受体缺失突变体，通过混合噬菌体培养进行抗性驯化菌株的筛选，实验构建的多价噬菌体抗性驯化菌株被证明对23种测试的噬菌体体现抗性^[5]；2022年齐蕊名等通过共进化手段，筛选出6株对噬菌体Lpla具有稳定抗性的植物乳杆菌(自发突变株)^[6]。

本研究从基本的工业菌株大肠杆菌BL21出发，进行抗噬菌体菌株的进化筛选，获得遗传稳定性较高的驯化菌株BL21 A1–A7。通过基因组重测序以及基因功能分析，挖掘具有噬菌体抗性的基因，进行过表达菌株BC1、BC2、BC3和位点突变菌株BC4、BC5、BC6、BC7的构建，以及利用CRISPR/Cas9手段进行BC10敲除菌株的构建，在噬菌体侵染实验中以BL21为对照，发现过表达菌株与敲除菌株分别对测试的6株噬菌体表现不同范围的抗性。同时，基于吸附率以及逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription- polymerase chain reaction, RT-PCR)的实验验证，推测dnaE、yhjH的表达影响噬菌体的复制过程，rzoD的表达影响噬菌体的吸附以及其他过程。同时对抗噬菌体的关键基因进行了进一步的表征与验证，构建具有较广范围的含有dnaE_I171L、yhjH_A151V、rzoD_A2V位点突变基因的过表达工程菌株BC11，经实验验证，其具有较为广泛的噬菌体抗性。本研究挖掘的抗性基因为抗性噬菌体菌株的开发提供基础，同时抗性噬菌体菌株作为工业中的底盘细胞，在发酵工业中具有潜在的应用价值，RT-PCR的实验验证以及结论推测为解析基因抗性机制提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 主要实验材料、菌株以及培养基成分 1.1.1 实验所需菌株

本研究所用到的菌株如表 1所示。

1.1.2 实验所需噬菌体

实验所使用模式噬菌体：噬菌体T1、T7 (来自American Type Culture Collection, ATCC)；通过实验纯化获得单一噬菌体：BL21 Virus 01、BL21 Virus 02、BL21 Virus 03和BL21 Virus 06 4株噬菌体。

1.1.3 实验所需引物

本研究所需引物如表 2所示。

1.1.4 培养基及配方

实验所用培养基为LB培养基(g/L)：蛋白胨(tryptone) 10，酵母提取物(yeast extract) 5，氯化钠(NaCl) 10。

1.2 主要仪器设备及试剂

本研究用到的主要仪器设备与试剂及生产厂家如表 3所示。

1.3 噬菌体的分离及纯化

本研究从发酵污水厂分离筛选裂解性噬菌体。将含有噬菌体的发酵液在转速10 000 r/min下离心10 min去杂质，使用0.22 μm无菌滤膜过滤上清除菌，吸取500 μL澄清滤液与等体积对数期大肠杆菌BL21混合，转接10 mL LB培养基，37 ℃、220 r/min培养4−6 h^[7]。

实验采用双层平板法分离纯化噬菌体^[8]，对噬菌体液体进行10倍梯度稀释，将100 μL噬菌体与等体积对数期大肠杆菌混合，加入5 mL上层培养基混匀后倒入下层平板中^[9]。37 ℃、220 r/min培养，3−4 h后选取4个大小不同、单一透明的噬菌斑，挑取至LB培养基中进行培养，获得浓度较高的4种单一噬菌体溶液，将其命名为BL21 Virus 01、BL21 Virus 02、BL21 Virus 03、BL21 Virus 06，保存于−80 ℃用于后续实验研究^[9]。

1.4 驯化菌株的筛选

根据先前报道的方法^[10]，对大肠杆菌进行共进化培养。将大肠杆菌BL21培养至对数生长期，吸取200 μL的混合噬菌体溶液(BL21 Virus01、BL21 Virus 03、T1、T7)与等体积对数期菌液混合，接种至新鲜LB培养基，37 ℃、220 r/min摇床过夜培养，通过噬菌体侵染实验验证驯化菌株敏感性，获得具有抗性的驯化菌株。

1.5 驯化菌株基因组重测序

将驯化菌株进行活化，37 ℃、220 r/min摇床培养12 h后进行样品保存，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行全基因组重测序^[11]。实验对测序结果进行初步分析，并对原始图像数据利用软件Bcl2fastq (v2.17.1.14)进行图像碱基识别(base calling)。

1.6 过表达菌株的构建

分别利用引物dnaE-F、dnaE-R、yhjH-F、yhjH-R、rzoD-F、rzoD-R扩增目的基因dnaE、yhjH、rzoD，利用引物dnaE_I171L-F、dnaE_I171L-R、yhjH_A151V-F、yhjH_A151V-R、rzoD_A2V-F、rzoD_A2V-R在目的基因dnaE、yhjH、rzoD的基础上分别扩增目的基因dnaE_I171L、yhjH_A151V、rzoD_A2V，利用pET28a-F、pET28a-R采用反向PCR技术进行线性化质粒pET28a的构建，根据南京诺唯赞生物科技股份有限公司胶回收试剂盒进行目的基因以及线性化质粒pET28a的回收，以及根据同源重组酶试剂盒说明书进行体系的计算与添加。同源重组体系置于37 ℃金属浴连接0.5−1.0 h，获得重组质粒pET28a-dnaE、pET28a-yhjH、pET28a-rzoD、pET28a-dnaE_I171L、pET28a-yhjH_A151V和pET28a-rzoD_A2V。将获得的重组质粒采用化学转化法导入大肠杆菌BL21感受态。含有Kan抗生素的平板涂布后PCR验证筛选阳性单菌落^[12]，获得菌株BC4-BC9。同时将获取的目的基因dnaE_I171L、yhjH_A151V、rzoD_A2V利用引物BC11-F1、BC11-R1、BC11-F2、BC11-R2、BC11-F3、BC11-R3进行序列的进一步扩增，获得目的基因BC11-dnaE_I171L、BC11-yhjH_A151V、BC11-rzoD_A2V，以同样的同源重组方式与线性化28a质粒进行连接，获得重组质粒pET28a-dnaE_I171LyhjH_A151VrzoD_A2V，将获得的重组质粒采用化学转化法导入大肠杆菌BL21感受态。于含有Kan抗生素的平板涂布，PCR验证筛选阳性单菌落^[13]，获得菌株BC11。

1.7 过表达菌株SDS-PAGE分析

挑取过表达菌株阳性单菌落接种于10 mL LB液体培养基，37 ℃过夜培养，按照1%的接种量转接至50 mL LB液体培养基中，37 ℃培养1−2 h，待菌液OD₆₀₀增至0.8左右，加入25 μL 1 mmol/mL异丙基-1硫代-β-d-半乳糖苷(isopropyl-1 thio-β-d-galactoside, IPTG)，16 ℃培养10−12 h，诱导蛋白表达。

1.8 CRISPR/CAS9技术构建敲除菌株及位点突变菌株

研究采用CRISPR/CAS9技术进行大肠杆菌敲除菌株与位点突变菌株的构建。采用引物BC10-F1、BC10-R1、BC10-F2、BCF0-R2分别构建rzoD基因的上下游同源臂，利用引物BC10-F1、BCF0-R2构建同源臂的融合片段BC10-F1R2，采用引物BC10-sgRNA搭建双链sgRNA，同时构建重组质粒PGRB-sgRNA^[14]。制备大肠杆菌BL21/Cas9的感受态，将重组质粒PGRB-sgRNA、融合片段BC10-F1R2利用电化学转化法(1.8 kV-5 ms)导入感受态细胞。30 ℃、220 r/min摇床培养2 h，吸取混合溶液100 μL，进行平板涂布(终浓度100 μg/mL氨苄霉素、50 μg/mL壮观霉素)，30 ℃培养箱过夜培养，采用引物BC10-F1、BC10-R2进行PCR验证筛选阳性单菌落，获得菌株BC10。

在目的基因dnaE、yhjH、rzoD的上游分别根据引物BC7-F2、BC7-R2、BC8-F2、BC8-R2、BC9-F2、BC9-R2添加Kan抗性基因获得片段BC7-F2R2、BC8-F2R2、BC9-F2R2，同时根据引物BC7-F1、BC7-R1、BC8-F1、BC8-R1、BC9-F1、BC9-R1，在添加Kan抗性基因的上游扩增一定长度的同源臂BC7-F1R1、BC8-F1R1、BC9-F1R1。分别根据BC7-F1、BC7-R2、BC8-F1、BC8-R2、BC9-F1、BC9-R2将对应的BC7-F1R1/BC7-F2R2、BC8-F1R1/BC8-F2R2、BC9-F1R1/BC9-F2R2片段进行融合，获得融合片段BC7-Kan1、BC6-Kan1、BC9-Kan1。根据引物BC7-F3、BC7-R3、BC8-F3、BC8-R3、BC9-F3、BC9-R3分别扩增位点突变基因BC7-dnaE_I171L、BC8-yhjH_A151V和BC9-rzoD_A2V，根据引物BC7-F1、BC7-R3、BC8-F1、BC8-R3、BC9-F1、BC9-R3将片段BC7-Kan1、BC8-Kan1、BC9-Kan1与片段BC7-dnaE_I171L、BC8-yhjH_A151V、BC9-rzoD_A2V分别进行融合，获得融合片段BC7-Kan1-dnaE_I171L、BC8-Kan1-yhjH_A151V、BC9-Kan1-rzoD_A2V。将BC7-sgRNA、BC8-sgRNA、BC9-sgRNA与线性化PGRB进行同源重组连接，构建PGRB重组质粒BC7PGRB-sgRNA、BC8PGRB-sgRNA、BC9PGRB-sgRNA，将重组质粒BC7PGRB-sgRNA、BC8PGRB-sgRNA、BC9PGRB-sgRNA分别与融合片段BC7-Kan1-dnaE_I171L、BC8-Kan1-yhjH_A151V、BC9-Kan1-rzoD_A2V利用电化学转化法(1.8 kV-5 ms)导入大肠杆菌BL21/Cas9感受态细胞。在含有Kan抗生素的平板涂布后采用引物BC7-F1、BC7-R3、BC8-F1、BC8-R3、BC9-F1、BC9-R3分别验证dnaE、yhjH、rzoD位点突变基因，PCR验证筛选阳性单菌落^[12]，获得菌株BC7−BC9。

1.9 生长曲线测定

将构建的过表达菌株BC4−BC6进行活化培养，挑取单菌落菌株至10 mL LB培养基，37 ℃过夜培养。按1%量转接量接种至含50 mL LB培养基中，进行37 ℃摇床培养12 h，培养期间每隔1 h测定OD₆₀₀^[15]。

1.10 噬菌体滴度的测定

采用双层平板法测定噬菌体滴度。将活化后的噬菌体进行10倍梯度稀释，取不同梯度的噬菌体稀释液与等体积对数期的BL21菌液相混合，加入5 mL半固体培养基，混合均匀后倾倒于下层平板上，凝固后于37 ℃培养3−4 h。通过平板上形成的噬菌斑数量计算噬菌体的滴度(PFU/mL)^[16]。噬菌体滴度计算公式为：

1.11 噬菌体吸附率的测定

双层平板法测定噬菌体吸附率，根据吸附前后噬菌体的滴度测定吸附率的大小^[16]。噬菌体吸附率计算公式如下：

1.12 噬菌体的电镜观察

本研究采用H-7650透射电子显微镜观察噬菌体的形态。选取纯化后PFU在10⁷左右的噬菌体，取20 μL滴于铜网上，等待其自然晾干。大概15 min后，用滤纸从侧面吸收多余液体，加入1滴2%磷钨酸(phosphotungstic acid, PTA)，染色10 min。用滤纸从侧面吸去染液，干燥后于透射电子显微镜下进行观察^[16]。

1.13 噬菌体侵染实验

在菌体生长的对数期吸取一定的菌液进行噬菌体侵染实验验证敏感性，噬菌体滴度范围在10⁹左右，同时在板中添加1 μL 1 mmol/mL IPTG诱导蛋白表达。3−4 h后观察噬菌斑的形成状态。

1.14 RT-PCR实验

提取噬菌体BL21 Virus 01 DNA，将其用Sam Ⅰ内切酶进行酶切，同时将质粒pET28a也进行Sam Ⅰ内切酶的酶切处理，将酶切后的噬菌体DNA与线性化pET28a进行同源重组的连接。送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序处理。根据测序的序列设计定量PCR引物RT-PCR-F、RT-PCR-R，用于分析噬菌体BL21 Virus 01 DNA的含量。具体实验方法为：以菌株BL21、BC7和BC8为宿主，加入原液感染复数(multiplicity of infection, MOI)=0.1的噬菌体BL21 Virus 01，37 ℃振荡培养，以刚加入噬菌体为0 min，每5 min取1 mL样品离心收集菌体，使用RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa)对收集的细胞进行总RNA提取，使用GoScript逆转录系统对总RNA (每次反应1 μg)进行逆转录，并使用GoTaq™对互补DNA (cDNA)进行实时定量PCR分析。以吸附前0时刻细胞内DNA含量为标准，在加入噬菌体后5、10、15、20 min分别获取数据后进行倍数比较^[17]。

1.15 抑菌曲线的测定

将过夜培养的大肠杆菌按1%接种量转接于50 mL LB培养基中，培养1.5 h后加入10 μL 1 mmol/mL的IPTG。2 h时按照3个感染复数(MOI=0.1、1、10)加入不同浓度的噬菌体，37 ℃、220 r/min摇床培养10 h左右，每隔1 h测定OD₆₀₀^[18-19]。原液感染复数(multiplicity of infection, MOI)计算公式如下：

2 结果与分析 2.1 噬菌体的筛选及鉴定

为了鉴定噬菌体的形态与种类，使用电子透射显微镜观察噬菌体形态特征。如图 1A所示，BL21 Virus 01头部为二十面体，直径在40−50 nm，具有非收缩性细长尾部；BL21 Virus 02头部为二十面体，直径在30−40 nm，具有非收缩性细长尾部；BL21 Virus 03头部为二十面体，直径在30−40 nm，具有非收缩性细长尾部；BL21 Virus 06头部为典型的二十面体，直径在20−30 nm，具有非收缩性细长尾部。根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)的最新标准，BL21 Virus 01、02、03、06属于长尾噬菌体^[20]。实验测得6株噬菌体的滴度，滴度数据如图 1B所示，BL21 Virus 01：2.2×10¹³ PFU；BL21 Virus 02：9.6×10¹³ PFU；BL21 Virus 03：4.2×10¹³ PFU；BL21 Virus 06：6.0×10¹³ PFU；T1：5.2×10¹³ PFU；T7：2.0×10¹³ PFU。

2.2 驯化菌株的分离及鉴定

如图 2A所示，进行混合噬菌体与大肠杆菌的共进化培养实验。如图 2B所示，平板涂布后获得7株驯化菌株，将其命名为Escherichia coli BL21 A1−A7。对驯化菌株E. coli BL21 A1−A7进行噬菌体侵染实验验证菌株敏感性，如图 2C所示，噬菌体侵染实验发现驯化菌株E. coli BL21 A1−A7具有不同范围的抗噬菌体能力。

2.3 驯化菌株基因组重测序及基因功能分析

为了进一步筛选驯化菌株中的抗性基因，对E. coli BL21 A1−A7 7株驯化菌株进行基因组重测序。如表 4所示，测序平均深度≥200X，Q20 (%)平均值在97%以上，Q30 (%)平均值在94%左右。对照大肠杆菌BL21，参考基因组的覆盖度达到100%，GC含量达到50%，这与已报道的大肠杆菌基因组几乎无异^[21]。将驯化菌株的测序结果与对照大肠杆菌BL21基因组进行比对，使用Samtools (version 1.1)软件以及GATK的Unified Genotyper模块进行单碱基突变(single-base mutations, SNV)/插入或缺失突变(insertion or deletion of mutations, InDel)的检测，对参考基因组每个位点进行检测，并用Annovar软件对检测到的突变位点进行功能注释，发现基因位点突变的种类共有6种，位点突变类型中转换数目小于颠换数目(图 3A)。

如图 3B所示，重测序发现E. coli BL21 A1–A7这7株驯化菌株中有多个相同的位点突变基因，如图 3C所示，它们在基因组上的功能区共有16种，在16种功能区中，发生位点突变的类型占下游功能区与编码功能区的比重大于其他功能区。

如表 4所示，重测序菌株单核酸位点变异在变异菌株平均值达到23−28个，位于编码区的突变基因达到11个。在7个驯化菌株中，共鉴定出175处单核酸位点差异(SNV)，其中31处变异为非同义突变，44处为同义突变。对突变基因进行功能分析，在16个不同的基因中发现了74处无义突变，其中无义突变的基因包括谷氨酸脱羧酶、转座酶、延伸因子以及Ⅵ型分泌系统分泌蛋白等。同时在所有位点突变的基因中发现dnaE、yhjH、rzoD这3个基因出现的频率较高，推测这3个基因很有可能为抗噬菌体的关键基因。

dnaE负责复制和修复所有基于生物体中发现的外源DNA，dnaE的远端突变会破坏DNA链定向合成，并影响外切酶活性^[22]，先前已有的文献指出dnaE与多个噬菌体的复制相关联，研究者们对此进行了实验论证^[23]；基因yhjH (编码磷酸二酯酶)环磷酸二酯酶，yhjH与细菌生物膜的形成有关^[24]，生物膜中存在各种生物大分子如脂多糖、脂蛋白，它们是噬菌体的主要受体蛋白^[21]；rzoD与少数大肠杆菌生物膜的形成有关^[25]。发生位点突变的基因名称、基因功能以及氨基酸突变位点信息如表 5所示。

2.4 菌株构建及生长曲线的测定

为了验证突变基因的功能，构建过表达菌株、位点突变菌株及敲除菌株。如图 4所示，根据引物的设计以及基因的长度，表明BC1−BC11菌株的成功构建。同时对过表达菌株进行SDS-PAGE分析，如图 5所示，不同分子量的蛋白表明过表达菌株BC1−BC6以及BC11的成功表达。

对过表达菌株BC4−BC6进行生长曲线的测定，结果如图 6所示，过表达菌株与对照菌株BL21的生长曲线大致相似，表明突变基因的表达并不影响大肠杆菌的生长状态。与对照菌株相比，过表达菌株BC4−BC6的延迟期、对数期、稳定期在时间上相差无异，BC5生长速度较快于BC4、BC6，猜测由于yhjH基因参与调节细菌运动与生物膜的形成有关^[26]。过表达菌株在6−8 h后进入稳定期生长。但敲除基因rzoD的菌株BC10的生长速度迟滞于对照菌株，可能是rzoD基因缺失影响细胞生物膜活性，进而降低细胞的生长速度^[27]。

2.5 抗噬菌体关键基因的验证

为了验证突变的基因是否具有抗性功能，研究通过原核基因的克隆表达以及构建位点突变菌株，在菌体生长的对数期进行噬菌体侵染实验验证菌株敏感性。如图 7噬菌体侵染实验结果所示，对照菌株大肠杆菌BL21、BC1、BC2、BC3形成清晰透明的噬菌斑，BL21 Virus 01侵染BC4−BC9无清晰透明噬菌斑的出现，表明dnaE_I171L、yhjH_A151V、rzoD_A2V基因的突变能抵御噬菌体BL21 Virus 01的侵染。BL21 Virus 02侵染BC1−BC9形成清晰可见的噬菌斑，表明dnaE_I171L、yhjH_A151V、rzoD_A2V基因的突变不能抵御噬菌体BL21 Virus 02的侵染。BL21 Virus 03侵染BC6、BC9形成清晰可见噬菌斑，表明rzoD_A2V基因的突变不能抵御噬菌体BL21 Virus 03的侵染。BL21 Virus 06侵染BC6形成模糊透明圈，推测模糊噬菌斑的形成与噬菌体的浓度/裂解能力有关。T1侵染菌株BC4、BC7未形成清晰可见的噬菌斑，表明yhjH基因的突变可以抵御噬菌体T1的侵染，T7侵染BC5、BC8未形成清晰可见的噬菌斑，表明dnaE基因的突变可以抵御噬菌体T7的侵染。综上所述，BC4、BC7对BL21 Virus 01、BL21 Virus 03、T7噬菌体具有一定抗性，BC5、BC8对BL21 Virus 01、BL21 Virus 03、T1具有一定抗性，而敲除菌株BC10同时对检测的多株噬菌体具有相应抗性，无明显透明圈的出现，抗性范围较为明显。图 7为抗噬菌体关键基因的噬菌体侵染实验结果图。

2.6 突变基因影响噬菌体感染的机理分析

由于构建的过表达菌株BC4−BC6以及基因位点突变菌株BC7−BC9对BL21 Virus 01均具有抗性，因此研究测定了噬菌体BL21 Virus 01对于BC4−BC9菌株的吸附率。结果如图 8A所示，噬菌体BL21 Virus 01对大肠杆菌BL21吸附率达到85%，对大肠杆菌BL21/pET28a吸附率达到80%。BC4、BC5、BC7、BC8与大肠杆菌BL21/pET28a相比，吸附率无明显变化，表明dnaE和yhjH的位点突变不影响噬菌体BL21 Virus 01的吸附。而菌株BC6、BC9、BC10吸附率分别为45%、43%、41%，与对照组相比，吸附率显著下降，表明rzoD基因的突变影响噬菌体的吸附，进而影响噬菌体的侵染。

为了进一步确定基因dnaE和yhjH突变对噬菌体侵染的影响，使用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)实验验证噬菌体BL21 Virus 01基因组的复制。对照组结果如图 8A显示，与0时相比，噬菌体BL21 Virus 01侵染大肠杆菌BL21在10、15和20 min时DNA的含量显著上升。实验组结果如图 8C、8D显示，与0时相比，噬菌体BL21 Virus 01侵染菌株BC7、BC8在5、10、15和20 min时间点DNA的含量几乎无明显差异，表明dnaE和yhjH位点突变影响噬菌体BL21 Virus 01 DNA的复制过程，进而影响噬菌体的侵染。Guinta D和Hay N的研究结果表明，大肠杆菌噬菌体N4和P1的复制过程需要宿主细胞的dnaE参与^[23-28]，与dnaE位点突变菌株影响噬菌体BL21 Virus 01复制结果一致。因此推测dnaE位点突变使其丧失了复制噬菌体DNA的功能，进而影响噬菌体的DNA复制过程。

2.7 抗性基因的表征

通过测定分析不同感染复数下噬菌体对菌株生长的影响，实验进行了抑菌曲线的测定。菌株转接后培养2 h时加入噬菌体BL21 Virus 01。如图 9A、9B所示，对照组生物量下降，摇瓶中出现细胞碎片。如图 9C所示，菌株BC4在MOI为0.1、1、10的3个条件下，生长曲线整体缓慢上升，生长速度整体低于对照BL21，菌体未出现裂解状态，表明菌株BC4在不同感染复数下对噬菌体BL21 Virus 01具有一定的抗性效果。如图 9D所示，在3个不同的感染复数下，菌株BC5生长变化未受到明显抑制，表明BC5对噬菌体BL21 Virus 01具有抗性。如图 9E所示，在3个不同条件的感染复数下，菌株BC6与对照组相比，在加入噬菌体后，生物量呈缓慢上升的趋势，一段时间后趋于平稳且不再增长，表明菌株BC6对不同浓度的噬菌体BL21 Virus 01具有一定的抗性效果。如图 9F所示，BC10菌株在噬菌体BL21 Virus 01加入后，其生长并未受到噬菌体的抑制，表明BC10能在噬菌体BL21 Virus 01的感染下正常生长，同时对低感染复数的噬菌体BL21 Virus 01具有抗性。

基于上述实验基础，研究进一步构建含有3个位点突变基因的过表达工程菌株BC11，为了测试其对4株噬菌体BL21 Virus 01−06的抗性能力，选取感染复数为10 (MOI=10)的条件进行抑菌曲线的测定。如图 10所示，在菌株转接2 h时分别加入BL21 Virus 01-06四种噬菌体，2−8 h内对照组BL21出现裂解状态，生物量下降，工程菌株BC11在噬菌体BL21 Virus 01 (MOI=10)、BL21 Virus 03 (MOI=10)的感染下生长状态并未受到抑制，生物量呈上升趋势，表明含有3个位点突变基因的过表达工程菌株BC11对BL21 Virus 01、BL21 Virus 03具有抗性作用，且抗性效果显著；加入BL21 Virus 02、BL21 Virus 06两种噬菌体的条件下，2−4 h培养后呈现出不同程度的裂解状态，OD值呈先上升再下降的趋势，证明BC11对BL21 Virus 02、BL21 Virus 06没有抗性作用，这与噬菌体侵染实验结果相一致。

综上所述，本研究构建的菌株经实验鉴定，BC4−BC6、BC7−BC10以及研究后续构建的工程菌株BC11，具有一定范围的抗噬菌体的能力，经抗性实验表征，BC11具有抗噬菌体底盘细胞的应用价值，可用于发酵工业中工程菌株的应用。

3 讨论与结论

本研究从基本工业菌株大肠杆菌BL21出发，通过共进化筛选获驯化菌株A1−A7。采用基因组的重测序，基因功能的分析等方法，挖掘了dnaE、yhjH、rzoD这3个基因作为抗性功能鉴定的基因，构建过表达菌株、位点突变菌株与敲除菌株用于功能鉴定；dnaE在以往的研究中被指出与噬菌体N4、P1复制有关^{[23, 28]}；yhjH基因被指出与细菌生物膜的形成有关^{[24, 29]}，而生物膜中存在的脂多糖、脂蛋白等物质，是噬菌体的主要受体蛋白^[21]；rzoD基因的表达被证实与生物膜的活性有关^[27]，同时，敲除rzoD基因的细菌在培养状态下可能会影响自身的生长。

研究证明构建的菌株具有较广范围的抗噬菌体效果。菌株BC4、BC5、BC6和BC10对BL21 Virus 01具有完全抗性；菌株BC4、BC7对T7噬菌体、BL21 Virus 03，BC5、BC8对T1噬菌体、BL21 Virus 03具有完全抗性。BC10对测试的多株噬菌体具有抗性效果。BC10敲除菌株对不同范围内的噬菌体均有一定抗性，表明rzoD基因的敲除对噬菌体的抗性范围较广；通过吸附率实验以及RT-PCR推测菌株BC4、BC5、BC6和BC7干扰噬菌体的复制过程，从而抵御噬菌体的感染，发现菌株BC9、BC10干扰噬菌体吸附过程，同时构建的工程菌株BC11具有较为广泛的噬菌体抗性，达到抗噬菌体的目的。本研究为抗噬菌体底盘细胞构建提供借鉴，在发酵工业中具有潜在的应用前景。