2023, Vol. 63中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 赵文轩, 吴建民, 党苗苗, 汪晶, 朱伟云. 2023
- ZHAO Wenxuan, WU Jianmin, DANG Miaomiao, WANG Jing, ZHU Weiyun.
- 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠肠道形态、抗氧化功能、菌群结构及屏障功能的影响
- Combination of hesperidin and rosmarinic acid affects cecal morphology, antioxidant function, microbiota structure, and barrier function of finishing pigs
- 微生物学报, 63(11): 4356-4371
- Acta Microbiologica Sinica, 63(11): 4356-4371
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文章历史
- 收稿日期：2023-04-04
- 网络出版日期：2023-07-07
引用本文 |
肠道是动物消化吸收营养物质的重要器官，但其经常会受到各种病原体的攻击。在过去的几十年中，养殖业从事者将亚治疗剂量的抗生素添加到饲料中以减少致病菌的定殖、改善肠道健康、提高动物生长性能[1]。然而，长期使用抗生素也导致了致病菌耐药性增加及抗生素残留等一系列问题[2]。因此，世界上越来越多的国家和地区开始限制抗生素在养殖业中的使用[3]。禁止抗生素作为饲料添加剂有助于保障动物产品安全，但也使动物的健康变得难以保障。因此，养殖业从事者迫切需要找到新的能够保障动物机体健康的物质。而近些年来植物提取物因其良好的抗炎、抗菌、抗氧化等特性而在饲料添加剂的行列中受到广泛关注[4]。
植物提取物是指从植物中提取的天然物质，将其作为饲料添加剂使用时能够改善动物的机体健康、提高动物的生长性能[5]。橙皮苷是一种从柑橘类水果中提取出的类黄酮，许多体内外实验均已表明其具备良好的促生长、抗氧化等功能[6]。Park等[7]的研究发现，饲料中添加0.5%橙皮苷提高了生长猪的营养消化率。Goliomytis等[8]的研究发现，饲料中添加750 mg/kg橙皮苷提高了鸡肉的抗氧化能力、降低了鸡肉中丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量。迷迭香酸是一种从唇形科、紫草科和伞形科等植物中提取出的酚酸，研究表明其具有良好的抗氧化、抗炎等功能[9]。Domitrović等[10]的研究表明，连续2 d口服1−5 mg/kg体重的迷迭香酸能够抑制氧化应激与炎症、改善顺铂诱导的小鼠肾损伤。因此，橙皮苷和迷迭香酸作为饲料添加剂在养殖业中有着良好的应用潜力。
提高植物提取物的功效将有利于其在养殖业中的实际应用。多种植物提取物同时使用时可以因其不同的作用机制、不同的作用靶点而发挥更好的效果[11]。本实验室前期的研究发现橙皮苷和迷迭香酸的组合可以缓解脂多糖攻毒大鼠的肠道形态损伤，并通过调节肠道微生物群和缓解炎症反应改善了大鼠的肠道健康[12]。盲肠中宿居了大量微生物，这些微生物能够通过参与营养物质代谢影响育肥猪的肠道健康与营养利用[13]。然而，目前还未见研究报道橙皮苷与迷迭香酸组合使用时对育肥猪盲肠健康及其菌群组成的影响。因此，本研究旨在探究橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪生长性能及盲肠的肠道形态、菌群组成和屏障功能等的影响，从而为橙皮苷与迷迭香酸组合在养殖业中的实际应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验于2021年10月至2022年1月在南京农业大学实验动物房完成。试验选用90日龄杜×长×大三元杂交公猪；试验所用橙皮苷与迷迭香酸(纯度≥98%)均购于山西玉宁生物科技有限公司。
1.2 试验动物和试验设计将24头90日龄初始体重为(40.07±1.93) kg的健康杜×长×大三元杂交公猪随机分为4组，每组6个重复，每个重复1头猪。其中，对照组(control, Con)饲喂基础日粮，橙皮苷组(hesperidin, Hes)在基础日粮中添加600 mg/kg的橙皮苷，迷迭香酸组(rosmarinic acid, RA)在基础日粮中添加40 mg/kg的迷迭香酸，橙迷组(Hes×RA)在基础日粮中添加300 mg/kg的橙皮苷和20 mg/kg的迷迭香酸。试验期共包括90 d，试验日粮为玉米-豆粕型日粮，基础日粮组成及营养成分见表 1。每头育肥猪都被放在1个单独的代谢笼内，猪舍内温度控制在(22±1) ℃，相对湿度始终保持在65%–75%。试验期间，每周对猪舍进行消毒和清洁。每个代谢笼都有单独的料槽和饮水系统以确保育肥猪在试验期间可以自由获得饮水和饲料。
| Item | Body weight (kg) | ||
| 20−50 | 50−80 | 80−120 | |
| Ingredients (%) | |||
| Corn | 68.17 | 71.70 | 75.00 |
| Soybean meal | 21.96 | 18.81 | 16.00 |
| Corn gluten meal | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Soybean oil | 2.06 | 1.89 | 1.50 |
| Limestone | 0.63 | 0.59 | 0.56 |
| Dicalcium phosphate | 1.02 | 0.98 | 0.96 |
| NaCl | 0.31 | 0.26 | 0.26 |
| Premix1 | 4.00 | 4.00 | 4.00 |
| l-lysine | 0.50 | 0.45 | 0.43 |
| Methionine | 0.10 | 0.10 | 0.10 |
| Threonine | 0.20 | 0.18 | 0.16 |
| Tryptophan | 0.05 | 0.04 | 0.03 |
| Calculated nutrient value | |||
| Digestive energy (MJ/kg) | 14.57 | 14.52 | 14.41 |
| Crude protein (%) | 16.36 | 15.19 | 14.18 |
| Ca (%) | 0.63 | 0.59 | 0.56 |
| AP (%) | 0.35 | 0.33 | 0.32 |
| Lysine (%) | 1.08 | 0.96 | 0.88 |
| Methionine (%) | 1.21 | 1.19 | 1.18 |
| Threonine (%) | 0.67 | 0.61 | 0.55 |
| Tryptophan (%) | 0.18 | 0.15 | 0.13 |
| 1: Premix provided per kg of diet. Vitamin A, 1 280 IU; Vitamin D3, 3 140 IU; Vitamin E, 10.8 IU; Vitamin K3, 0.48 mg; Vitamin B1, 1 mg; Vitamin B2, 2 mg; Vitamin B6, 1 mg; Vitamin B12, 0.004 8 mg; Niacin, 20 mg; Pantothenic acid, 10 mg; Folic acid, 0.3 mg; Biotin, 0.2 mg; Choline chloride, 200 mg; Fe, 40 mg; Cu, 3 mg; Zn, 40 mg; Mn, 2 mg; I, 0.14 mg; Se, 0.1 mg. | |||
1.3 样品采集
在试验第90天时，将育肥猪禁食12 h后称重并屠宰取样。采集盲肠食糜及黏膜并保存于液氮中，切取2 cm盲肠中段组织储存于4%多聚甲醛中，以便进行后续试验。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生长性能在试验第1、40、90天时将育肥猪禁食12 h后称重并记录，用以计算平均日增重。此外，统计育肥猪在试验第1−40天及第40−90天的采食量，用以计算平均日采食量及料重比(F/G)。
1.4.2 肠道形态将4%多聚甲醛中固定的盲肠肠段用手术刀切去多余组织，使用乙醇作为脱水剂进行梯度脱水后用石蜡进行包埋。将每个样品进行切片、脱蜡，最后使用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色后封片。切片通过虚拟显微镜(Simon-01)拍照，并通过Image-Pro Plus6.0测量肠道黏膜厚度、隐窝深度，每个样品选取6个值后计算其平均值用以统计分析。
1.4.3 盲肠黏膜抗氧化能力及细胞因子的测定从液氮中取出盲肠黏膜样品并称取0.1 g，加入9倍的生理盐水后进行匀浆。以3 500 r/min的速度离心10 min后收集上清液。用相应试剂盒检测盲肠黏膜中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性、总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)和MDA含量，试剂盒均购于南京建成生物工程研究所有限公司，试验操作严格按照试剂盒说明书进行。分泌型免疫球蛋白A (secretory immunoglobulin A, SIgA)、白介素-1β (interleukin-1 beta, IL-1β)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-10 (interleukin-10, IL-10)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)采用酶联免疫吸附测定法进行测定，试剂盒均购于上海酶联生物科技有限公司，操作步骤严格按照说明书进行。
1.4.4 盲肠黏膜抗氧化及屏障相关基因mRNA表达从液氮中取出盲肠黏膜样品，用TRIzol溶液(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)提取样品RNA，通过微量分光光度计检测RNA浓度和纯度。使用HiScript Ⅲ All-in-one RT Super Mix Perfect for qPCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)按照说明书将1 μg总RNA逆转录成cDNA并置于−80 ℃中保存。使用特异性引物(表 2)通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)检测核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2)、Kelch样ECH相关蛋白1 (kelch-like ECH-associated protein 1, KEAP1)、血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)、醌氧化还原酶1 (NADPH: quinine oxidoreductase 1, NQO1)、闭锁小带蛋白-1 (zonula occludens 1, ZO-1)、闭锁蛋白(Occludin)、闭合蛋白-1 (Claudin-1)、黏蛋白2 (mucin 2, MUC2)的转录水平。以β-肌动蛋白(beta actin, β-actin)作为内参基因，采用2−ΔΔCt方法进行分析。
| Gene | Primer sequence (5′→3′) | GenBank |
| β-actin | F: ATGCTTCTAGACGGACTGCG | XM_003357928.4 |
| R: GTTTCAGGAGGCTGGCATGA | ||
| NRF2 | F: TTGTCTGTGATGCCAACGTG | XM_021075133.1 |
| R: TTGGAACCGTGCTAGTCTCA | ||
| KEAP1 | F: CGTGGAGACAGAAACGTGGA | XM_021076667.1 |
| R: CAATCTGCTTCCGACAGGGT | ||
| NQO1 | F: GATCATACTGGCCCACTCCG | NM_001159613.1 |
| R: GAGCAGTCTCGGCAGGATAC | ||
| HO-1 | F: CAAGCAGAAAATCCTCGAAG | NM_001004027.1 |
| R: GCTGAGTGTCAGGACCCATC | ||
| ZO-1 | F: GAGGATGGTCACACCGTGGT | XM_021098896.1 |
| R: GGAGGATGCTGTTGTCTCGG | ||
| Occludin | F: ATGCTTTCTCAGCCAGCGTA | NM_001163647.2 |
| R: AAGGTTCCATAGCCTC | ||
| Claudin-1 | F: GCCACAGCAAGGTATGGTAAC | NM_001244539.1 |
| R: AGTAGGGCACCTCCCAGAAG | ||
| MUC-2 | F: GGTCATGCTGGAGCTGGACAG | XM_021082584.1 |
| R: TGCCTCCTCGGGGTCGTCAC |
1.4.5 盲肠食糜微生物16S rRNA基因测序及分析
参考Wang等[14]描述的方法提取盲肠食糜总DNA，使用微量分光光度计对DNA的浓度与纯度进行检测。使用319F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物通过PCR从DNA样品中扩增V3−V4区域的细菌16S rRNA基因。通过2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并通过Qubit 2.0荧光计测定其浓度。使用Illumina MiSeq进行测序和文库构建。采用UCLUST算法对97%相似水平的分类操作单元(operational taxonomic unit, OTU)代表序列进行分类学分析，对比Silva数据库(Release138.1 http://www.arb-silva.de)进行物种注释。基于Mothur v.1.21.1计算Chao1、ACE、Shannon、Simpson多样性指数以评估盲肠食糜菌群的多样性与丰富度。利用Mothur v.1.21.1基于每个样本的OTU情况和Bray-Curtis算法对各组样品进行主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)分析。各组样品间物种的相对丰度比较采用Kruskal-Wallis检验。测序原始数据提交至NCBI数据库，登录号为PRJNA949549。
1.4.6 盲肠食糜中短链脂肪酸浓度的测定在离心管中用0.8 mL双蒸水稀释0.2 g盲肠食糜后进行匀浆，之后以12 000 r/min的速度离心10 min。然后将0.6 mL上清液转移到新的离心管中，并与0.12 mL 25% (质量体积分数)的偏磷酸溶液混合。随后，将该溶液置于−20 ℃过夜，之后取出并解冻后以12 000 r/min的速度离心10 min。使用0.22 μm微孔滤膜进行过滤取得上清液，之后使用注射器抽取1 μL上清液，并将其注射到气相色谱仪(Shimadzu)中，该色谱仪配备有30 m×0.32 mm×0.25 μm的毛细管色谱柱(Sigma-Aldrich)，用于测定短链脂肪酸的浓度。柱温为135 ℃，检测器温度为200 ℃，载气为氮气，压力为60 kPa，氧气和氢气压力均为50 kPa。
1.5 数据统计分析使用Excel 2016对试验数据进行初步整理，利用SPSS 26.0中的单因素方差分析与Duncan’s检验进行数据分析。最终结果用平均值±标准误表示，P < 0.05时认为差异显著，P≥0.05表示无差异。
2 结果与分析 2.1 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪生长性能的影响橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪生长性能的影响如表 3所示。结果表明，与Con组相比，橙皮苷与迷迭香酸组合显著提高了育肥猪前期的平均日增重与平均日采食量，同时显著提高了后期的平均日采食量，并显著改善了全期的平均日增重、平均日采食量和料重比(P < 0.05)。此外，与Hes组相比，橙皮苷与迷迭香酸组合显著提高了育肥猪前期的平均日增重与平均日采食量，同时显著提高了后期的平均日采食量，并显著改善了全期的平均日增重、平均日采食量和料重比(P < 0.05)。与RA组相比，橙皮苷与迷迭香酸组合显著提高了育肥猪3个时期的平均日采食量及全期的平均日增重(P < 0.05)。
| Items | Con | Hes | RA | Hes×RA | SEM | P-value |
| 1−40 d | ||||||
| Average daily gain (g/d) | 665.42c | 724.58bc | 825.00ab | 856.25a | 23.86 | 0.007 |
| Average daily feed intake (kg/d) | 2.02d | 2.06c | 2.13b | 2.18a | 0.01 | < 0.001 |
| F/G | 3.06 | 2.86 | 2.62 | 2.59 | 0.07 | 0.057 |
| 41−90 d | ||||||
| Average daily gain (g/d) | 998.00 | 1 007.00 | 944.67 | 1 070.33 | 17.88 | 0.091 |
| Average daily feed intake (kg/d) | 3.40bc | 3.43b | 3.36c | 3.56a | 0.02 | < 0.001 |
| F/G | 3.41 | 3.42 | 3.60 | 3.35 | 0.06 | 0.505 |
| 1−90 d | ||||||
| Average daily gain (g/d) | 850.19c | 881.48b | 891.48b | 975.19a | 12.01 | < 0.001 |
| Average daily feed intake (kg/d) | 2.79c | 2.82b | 2.82b | 2.95a | 0.01 | < 0.001 |
| F/G | 3.28a | 3.27a | 3.16ab | 3.02b | 0.03 | 0.032 |
| Different lowercase letters in the same line indicate significant differences in the different groups (P < 0.05). The same below. | ||||||
2.2 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠肠道形态的影响
橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠肠道形态的影响如图 1和表 4所示。结果表明，与Con组相比，Hes×RA组盲肠黏膜厚度显著提高(P < 0.05)。此外，Hes×RA组盲肠黏膜厚度显著高于Hes组(P < 0.05)。隐窝深度在4组之间并未发现显著差异(P≥0.05)。
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| 图 1 橙皮苷与迷迭香酸组合对生长育肥猪盲肠肠道形态的影响 Figure 1 Effects of hesperidin and rosmarinic acid combination on caecum morphology of growing-finishing pigs. The length of the yellow line indicates the mucosal thickness. The length of the black line indicates the crypt depth. Con: The control group pigs; Hes: The pigs supplemented with 600 mg/kg hesperidin; RA: The pigs supplemented with 40 mg/kg rosmarinic acid; Hes×RA: The pigs supplemented with 300 mg/kg hesperidin and 20 mg/kg rosmarinic acid. The same below. |
| Items | Con | Hes | RA | Hes×RA | SEM | P-value |
| Mucosal thickness (μm) | 497.17b | 500.72b | 514.36ab | 554.45a | 11.33 | 0.046 |
| Crypt depth (μm) | 175.97 | 152.28 | 168.00 | 156.11 | 4.10 | 0.226 |
2.3 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠抗氧化功能的影响 2.3.1 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠抗氧化能力的影响
橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠抗氧化能力的影响如图 2所示。结果表明，与Con组相比，Hes×RA组育肥猪盲肠黏膜中T-AOC、SOD活性显著提高(P < 0.05)。此外，Hes×RA组育肥猪盲肠黏膜中总抗氧化能力显著高于RA组(P < 0.05)。GSH-Px活性与MDA含量在4组之间并未发现显著差异(P≥0.05)。
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| 图 2 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠抗氧化功能的影响 Figure 2 Effects of hesperidin and rosmarinic acid combination on cecal antioxidant capacity of finishing pigs. Different letters in different treatment groups indicate significant differences (P < 0.05). The error bar indicated mean±SE Different letters in different treatment groups indicate significant differences (P < 0.05). The same below. |
2.3.2 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠NRF2通路相关基因mRNA表达的影响
如图 3所示，利用实时荧光定量PCR技术对育肥猪盲肠NRF2通路相关基因的mRNA表达进行了检测。结果表明，与Con组相比，Hes×RA组育肥猪盲肠中NRF2、HO-1的相对mRNA表达量显著提高(P < 0.05)。4组之间盲肠中KEAP1、NQO1的相对mRNA表达量并未发现显著差异(P≥0.05)。
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| 图 3 橙皮苷与迷迭香酸组合对盲肠抗氧化相关基因表达的影响 Figure 3 Effects of hesperidin and rosmarinic acid combination on antioxidation-related gene expression in cecum. |
2.4 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠食糜菌群结构及其代谢产物的影响 2.4.1 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠食糜菌群多样性的影响
育肥猪盲肠食糜菌群的多样性指数如图 4所示。结果表明，与Con组相比，Hes×RA组Chao 1、ACE、Shannon、Simpson指数无显著变化。而与RA组相比，Hes×RA组Chao 1、ACE指数显著提高(P < 0.05)。PCoA分析显示，4组之间的菌群组成显著分开，且ANOSIM分析表示结果出现显著性(R=0.509, P=0.001)。
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| 图 4 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠菌群α多样性(A−D)与β多样性(E−F)的影响 Figure 4 Effects of hesperidin and rosmarinic acid combination on alpha diversity (A−D) and beta diversity (E−F) of cecal microbiota. |
2.4.2 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠食糜菌群结构的影响
橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠食糜门水平菌群的影响如图 5所示。在门水平上共发现5个相对丰度超过1%的菌门，其中Firmicutes、Bacteroidota、Proteobacteria的总相对丰度超过90%。统计分析结果表明，Hes×RA组Bacteroidota和Fusobacteriota的相对丰度显著高于Con组与Hes组，Proteobacteria的相对丰度显著低于Con组与RA组(P < 0.05)。橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠食糜属水平菌群的影响如图 6所示。在属水平上共发现25种相对丰度超过1%的菌属。其中，Hes×RA组育肥猪盲肠食糜中Terrisporobacter、Clostridium sensu stricto 1、Romboutsia的相对丰度显著低于Con组，Muribaculaceae_norank的相对丰度显著高于Con组，Lactobacillus、Rikenellaceae RC9 gut group的相对丰度显著高于Con组与Hes组，Phascolarctobacterium的相对丰度显著高于Con组与RA组(P < 0.05)。此外，RA组中Lachnospiraceae XPB1014 group的相对丰度显著低于Con组(P < 0.05)。
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| 图 5 橙皮苷与迷迭香酸组合对盲肠食糜门水平菌群组成(A)和菌群变化(B−D)的影响 Figure 5 Effects of hesperidin and rosmarinic acid combination on phylum level of microbial composition (A) and microbial change (B–D) in cecum digesta. |
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| 图 6 橙皮苷与迷迭香酸组合对盲肠食糜属水平菌群组成(A)和菌群变化(B)的影响 Figure 6 Effects of hesperidin and rosmarinic acid combination on genus level of microbial composition (A) and microbial change (B) in cecum digesta. |
2.4.3 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠食糜短链脂肪酸浓度的影响
育肥猪盲肠食糜中短链脂肪酸浓度如表 5所示。结果表明，Hes×RA组盲肠食糜中异丁酸浓度显著高于Con组、Hes组和RA组，丁酸浓度显著高于Con组和Hes组(P < 0.05)。4组之间乙酸、丙酸、异戊酸、戊酸和总短链脂肪酸浓度并未出现显著差异(P≥0.05)。
| Items | Con | Hes | RA | Hes×RA | SEM | P-value |
| Acetate (μmol/g digesta) | 370.55 | 417.49 | 364.54 | 481.96 | 19.34 | 0.105 |
| Propionate (μmol/g digesta) | 105.69 | 129.10 | 114.52 | 140.58 | 5.28 | 0.079 |
| Isobutyrate (μmol/g digesta) | 8.81b | 8.34b | 11.44b | 15.94a | 1.90 | 0.009 |
| Butyrate (μmol/g digesta) | 32.38c | 35.93bc | 39.83ab | 43.67a | 1.42 | 0.017 |
| Isovalerate (μmol/g digesta) | 14.46 | 14.21 | 18.20 | 16.42 | 0.97 | 0.456 |
| Valerate (μmol/g digesta) | 9.53 | 10.39 | 10.44 | 11.32 | 0.55 | 0.752 |
| Total SCFAs (μmol/g digesta) | 541.43 | 615.46 | 558.97 | 709.90 | 24.83 | 0.056 |
2.5 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠屏障功能相关基因mRNA表达的影响
橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠屏障相关基因mRNA表达的影响如图 7所示。结果表明，与Con组相比，橙皮苷与迷迭香酸组合显著提高了ZO-1、Claudin-1和MUC-2的相对mRNA表达量(P < 0.05)。此外，Hes×RA组育肥猪盲肠中ZO-1和Claudin-1的相对mRNA表达量显著高于Hes组(P < 0.05)。4组之间Occludin的相对mRNA表达量并未出现显著差异(P≥0.05)。
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| 图 7 橙皮苷与迷迭香酸组合对盲肠屏障功能相关基因表达的影响 Figure 7 Effects of hesperidin and rosmarinic acid combination on barrier-related gene expression in cecum. |
2.6 橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪盲肠细胞因子和分泌型免疫球蛋白A含量的影响
利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒检测了育肥猪盲肠黏膜中细胞因子及分泌型免疫球蛋白A的含量。如图 8所示，与Con组相比，Hes×RA组育肥猪盲肠黏膜中IL-1β的含量显著降低、SIgA的含量显著提高(P < 0.05)。此外，Hes×RA组育肥猪盲肠黏膜中SIgA的含量显著高于RA组(P < 0.05)。盲肠黏膜中IL-6、IL-10、TNF-α的含量在4组之间并没有显著的差异(P≥0.05)。
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| 图 8 橙皮苷与迷迭香酸组合对盲肠细胞因子和分泌型免疫球蛋白A含量的影响 Figure 8 Effects of hesperidin and rosmarinic acid combination on cytokines and SIgA content in cecum. |
3 讨论与结论
提高动物的生长性能是养殖业从事者追求的重要生产目标。前期研究表明，橙皮苷与迷迭香酸作为饲料添加剂能够提高动物的生长性能[15]。例如，Kamboh等[16]的研究发现，饲料中添加20 mg/kg橙皮苷显著提高了肉鸡的体重并降低了其料重比。Shang等[17]的研究发现，饲料中添加100−400 mg/kg迷迭香酸显著改善了肉鸡的平均日增重与料重比。因此，本研究首先探究了橙皮苷与迷迭香酸组合对育肥猪生长性能的影响。结果表明，与Con组相比，橙皮苷与迷迭香酸组合显著改善了育肥猪前期与全期的平均日增重及全期的料重比。此外，橙皮苷与迷迭香酸组合在育肥猪上展现出了更好的效果，如与Con组相比，显著提高了育肥猪前期、后期和全期的平均日采食量，并且橙皮苷与迷迭香酸组合使用的效果在一定程度上优于单独使用橙皮苷或迷迭香酸。以上结果表明，在饲料中添加橙皮苷与迷迭香酸组合能够改善育肥猪的生长性能，并且相较于单独添加橙皮苷或迷迭香酸，两者组合使用时发挥的效果更好。
肠道是动物重要的消化吸收器官，也是动物体内最大的免疫器官。保障肠道形态的完整性有利于发挥动物的生长潜能[18]。本研究结果表明，橙皮苷与迷迭香酸组合显著提高了育肥猪盲肠的黏膜厚度，并且其效果要优于单独使用橙皮苷。盲肠黏膜能够储存免疫效应分子、抑制病原菌对肠道的入侵[18]。因此，肠道黏膜厚度的增加有助于保护肠道免受病原菌的攻击。此外，肠道在进行正常生理活动的过程中极易产生并积累活性氧，良好的抗氧化能力是保障肠道形态结构完整性的关键因素之一[19]。在本研究中，与Con组相比，橙皮苷与迷迭香酸组合显著提高了育肥猪盲肠黏膜中SOD活性和T-AOC，并且其效果优于单独使用迷迭香酸。NRF2通路是动物机体内重要的抗氧化通路，该通路的激活能够增强通路下游抗氧化酶的表达[20]。前期研究表明，激活NRF2信号通路是橙皮苷、迷迭香酸提高动物机体组织抗氧化能力的重要途径之一。例如，Gur等[21]的研究发现，为紫杉醇处理的小鼠灌喂200 mg/kg体重的橙皮苷激活了肝和肾组织中的NRF2信号通路并提高了SOD、CAT等抗氧化酶的活性。Cai等[22]的研究发现，给高脂饮食小鼠灌喂2 mg/kg体重的迷迭香酸提高了空肠NRF2的相对mRNA表达量并增强了下游抗氧化酶SOD、HO-1的相对mRNA表达量，同时其还降低了空肠中MDA含量。本研究同样发现，Hes×RA组育肥猪盲肠中NRF2和HO-1的相对mRNA表达量显著高于Con组。以上结果表明，橙皮苷与迷迭香酸组合可能通过激活NRF2信号通路提高盲肠的抗氧化能力，有助于保障肠道形态的完整性，并且其效果在一定程度上优于单独使用橙皮苷或迷迭香酸。
肠道微生态平衡对维持动物肠道的功能与健康有着重要的意义。前期研究表明，橙皮苷与迷迭香酸在抑制病原菌生长、调节肠道菌群组成上有良好的效果[23-25]。微生物的多样性指数是判断微生物群丰富度、多样性及组成差异的重要指标。在本研究中，PCoA分析显示4组的微生物组成存在显著的差异，表明橙皮苷、迷迭香酸及其组合能够改变育肥猪盲肠食糜菌群组成。因此，在门水平与属水平上进行了进一步的分析以探究不同处理组中的差异微生物。结果表明，Hes×RA组中Proteobacteria相对丰度显著低于Con组与RA组。Proteobacteria中包含许多致病菌，该菌门丰度的增加往往被认为是肠道疾病或微生态失调的标志[26-27]。此外，在属水平上，与Con组相比，橙皮苷与迷迭香酸组合显著降低了Terrisporobacter、Clostridium sensu stricto 1和Romboutsia的相对丰度。Terrisporobacter能够产生三甲胺N-氧化物，并且三甲胺N-氧化物浓度的增加会导致宿主体内的氧化应激[28-29]。因此，Terrisporobacter相对丰度的降低将有助于改善肠道的氧化还原稳态，这与本研究中Hes×RA组盲肠黏膜抗氧化能力的提高所一致。在以往研究中，Clostridium sensu stricto 1被认定为肠道中的致病菌[30]。例如，Wang等[31]的研究发现，高丰度的Clostridium_sensu_stricto_1破坏了断奶仔猪的肠道黏膜屏障并引起了肠道炎症。此外，Romboutsia相对丰度的增加往往与肠道疾病密切相关。例如，Wu等[32]的研究发现，在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠的结肠食糜中，Romboutsia的相对丰度显著增加。Wu等[33]的研究表明，Romboutsia的相对丰度在肠易激综合征大鼠的结肠食糜中显著增加。以上结果表明，橙皮苷与迷迭香酸组合能够改变盲肠食糜菌群组成，减少肠道中致病菌的定植，有助于降低肠道疾病风险。
肠道中定殖的微生物能够通过产生短链脂肪酸来改善肠道的健康与功能。本研究发现，Hes×RA组中Bacteroidota和Fusobacteriota的相对丰度显著提高。在前期研究中，Bacteroidota中的许多微生物被鉴定为短链脂肪酸产生菌，如Muribaculaceae_norank、Rikenellaceae RC9 gut group等[34-35]。并且在本研究中，Muribaculaceae_norank和Rikenellaceae RC9 gut group在Hes×RA组中的相对丰度显著高于Con组。Fusobacteriota中的微生物在以往研究中被发现能够利用碳水化合物及黏蛋白等产生丁酸，该菌门丰度的提高有助于肠道食糜中短链脂肪酸浓度的提高[36]。此外，Hes×RA组中Lactobacillus与Phascolarctobacterium的相对丰度显著高于Con组。Wang等[37]的研究发现，利用Lactobacillus体外发酵大豆不溶性膳食纤维能够促进短链脂肪酸的产生。此外，Phascolarctobacterium在以往的研究中也被鉴定为短链脂肪酸产生菌[38]。在本研究中，与Con组相比，Hes×RA组中异丁酸和丁酸的浓度显著增加，并且其浓度显著高于Hes组或RA组。以上结果表明，橙皮苷与迷迭香酸组合能够通过促进肠道中短链脂肪酸产生菌的定植来增加肠道食糜中短链脂肪酸的浓度。
许多研究表明，高浓度的短链脂肪酸有利于肠道屏障功能的提高。紧密连接能够封闭肠道上皮细胞间的空隙从而保障肠道屏障的完整性，是肠道屏障的关键组成部分[39]。Wang等[40]通过体外培养小肠上皮细胞发现，丁酸盐的添加显著提高了紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的蛋白表达量。本研究同样发现，与Con组相比，Hes×RA组盲肠黏膜中ZO-1和Claudin-1的相对mRNA表达量显著提高，且其效果显著优于Hes组。肠道上皮细胞上覆盖有一层黏液能够防止病原菌与肠道上皮细胞直接接触，而Muc-2是形成肠道黏液层的主要黏蛋白[41]。Nielsen等[42]通过体外培养结肠上皮细胞发现，丁酸盐的添加显著提高了MUC-2的相对mRNA表达量。同样，本研究中Hes×RA组盲肠黏膜中MUC-2的相对mRNA表达量显著高于Con组。此外，肠道中存在的细胞因子与免疫球蛋白等免疫效应分子有利于维持肠道的免疫稳态，是肠道免疫屏障的重要组成部分[43]。前期研究表明，短链脂肪酸能够通过扩散或主动转运进入肠道细胞从而调节肠道免疫效应分子的表达[44]。本研究结果发现，与Con组相比，Hes×RA组育肥猪盲肠中IL-1β的含量显著降低，同时SIgA的含量显著增加并高于RA组。以上结果表明，Hes×RA组育肥猪盲肠中高浓度的短链脂肪酸改善了盲肠的屏障功能，并且其效果优于Hes组与RA组。
综上所述，橙皮苷与迷迭香酸组合提高了育肥猪的生长性能，同时提高了盲肠抗氧化能力并改善了盲肠肠道形态。此外，橙皮苷与迷迭香酸组合调节了肠道微生物组成、提高了盲肠食糜中短链脂肪酸浓度，有助于肠道屏障功能的提高。并且在本研究中，橙皮苷与迷迭香酸组合使用的效果优于单独使用的橙皮苷或迷迭香酸。
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