2023, Vol. 63
迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型构建及病理分析
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20230294
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 邹文政, 余建明, 蔡鸿娇, 李忠琴, 林茂, 王泽楠. 2023
- ZOU Wenzheng, YU Jianming, CAI Hongjiao, LI Zhongqin, LIN Mao, WANG Zenan.
- 迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型构建及病理分析
- Construction and pathological analysis of a zebrafish model infected with Edwardsiella tarda
- 微生物学报, 63(12): 4686-4697
- Acta Microbiologica Sinica, 63(12): 4686-4697
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文章历史
- 收稿日期：2023-04-23
- 网络出版日期：2023-09-08
引用本文 |
邹文政, 余建明, 蔡鸿娇, 李忠琴, 林茂, 王泽楠. 迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型构建及病理分析[J]. 微生物学报, 2023, 63(12): 4686-4697.
Zou Wenzheng, Yu Jianming, Cai Hongjiao, Li Zhongqin, Lin Mao, Wang Zenan. Construction and pathological analysis of a zebrafish model infected with Edwardsiella tarda[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2023, 63(12): 4686-4697.
迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型构建及病理分析
1. 集美大学水产学院, 福建 厦门 361021;
2. 湖南师范大学生命科学学院, 湖南 长沙 410081
2. 湖南师范大学生命科学学院, 湖南 长沙 410081
摘要：[目的] 本研究旨在建立迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型，以提供疾病模型用于病理学、药理学和药物学研究。[方法] 通过不同途径对斑马鱼进行人工感染，模拟自然感染状态，并研究迟缓爱德华氏菌对斑马鱼的致病机理，包括死亡率、行为变化、生化指标和病鱼机体抗氧化能力的变化情况。[结果] 比较3种感染途径，显示腹腔注射的致病力最强。迟缓爱德华氏菌感染后，斑马鱼表现出眼球突出、肛门出血、溃疡和腹水等症状。病理检查显示，感染后的斑马鱼发生急性炎症，可见肝细胞广泛坏死脱落，肝小叶萎缩，周围见吞噬细胞聚集。从患病斑马鱼体内分离出TX菌株，并通过特异性引物聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)鉴定为迟缓爱德华氏菌，确定该菌的半致死浓度LD50为3.65×102菌落形成单位(colony forming units, CFU)尾。与对照组相比，注射感染组的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力降低22.26%，丙二醛(malondialdehyde, MDA)显著升高16倍，酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)活性和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)活性分别上升38.99%和24.36%。[结论] 本研究建立了斑马鱼腹腔注射感染迟缓爱德华氏菌的疾病模型，感染后出现典型的疾病症状和生理生化特征，确定了半致死感染剂量，为迟缓爱德华氏菌感染水生动物的病理学研究和防治爱德华氏菌病的药物研制提供科学理论参考。
关键词：迟缓爱德华氏菌 斑马鱼 致病性 病理分析
Construction and pathological analysis of a zebrafish model infected with Edwardsiella tarda
1. Fisheries College of Jimei University, Xiamen 361021, Fujian, China;
2. College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan, China
2. College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan, China
Abstract: [Objective] To establish a zebrafish model of Edwardsiella tarda infection for the pathological studies and the development of drugs. [Methods] Zebrafish were artificially infected through different routes to simulate natural infection states, and the pathogenic mechanism of E. tarda in zebrafish was studied based on mortality, behavioral changes, biochemical indicators, and changes in the antioxidant capacity. [Results] Among the three infection routes, intraperitoneal injection showed the strongest pathogenicity. The zebrafish infected with E. tarda presented symptoms such as exophthalmos, anal bleeding, surface ulcers, and ascites. Pathological examination showed that the infected zebrafish developed acute inflammation, with extensive necrosis, degeneration, and shedding of hepatocytes and phagocytes gathering around. The TX strain was isolated from the diseased zebrafish and identified as E. tarda by polymerase chain reaction (PCR) with specific primers. The median lethal dose (LD50) of the strain was determined to be 3.65×102 colony forming units (CFU)/individual. Compared with the control group, the infection model established by injection showed a decrease of 22.26% in superoxide dismutase activity and increases of 16 folds in malondialdehyde content, 38.99% in acid phosphatase activity, and 24.36% in alkaline phosphatase activity. [Conclusion] An E. tarda infection model was established by intraperitoneal injection in zebrafish, which exhibited typical disease symptoms and physiological and biochemical characteristics, and the LD50 was determined. The findings provide a theoretical reference for the pathological studies and the drug development for E. tarda infections in aquatic animals.
Keywords:
Edwardsiella tarda zebrafish pathogenicity pathological analysis
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)为短杆型菌，最早由Hoshina于1962年在患病的日本鳗鲡(Anguilla japonica)中分离得到[1]。革兰氏染色为阴性，有短鞭毛，无荚膜，生长温度为15–42 ℃，最适合的生长温度为25–37 ℃；适合生长pH值为5.5–9.0，适应力极强，而以pH值为7.2的情况下生长效果最好，适宜生长盐度为0‰–40‰[2-5]。在Salmonella Shigella (SS)琼脂上，培养的迟缓爱德华氏菌前12 h菌落为黄色、圆形、微凸；培养超过24 h后会自中心产生黑色硫化氢，形成黑色中心的菌落[6]。
迟缓爱德华氏菌在自然界水环境中散布极为普遍，是常见的水源致病菌之一，可以感染包括如鱼、贝等多种水生动物，以及人类，甚至于鸟类也有感染的病例报道[6]。宿主被感染后可引发多种疾病及并发症，如败血症、肝脓疡和胃肠炎等病症[7-9]。迟缓爱德华氏菌已被确定为多种鱼类的重要病原体，包括如斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、日本鳗鲡和牙鲆(Paralichthys olivaceus)等[10]；适宜的生长温度范围为30–37 ℃[11]，并且在适合斑马鱼生长的温度(25–30 ℃)下感染[12]。迟缓爱德华氏菌感染斑点叉尾鮰、日本鳗鲡和牙鲆后，引起的疾病主要是全身性败血症，以及坏死性脓肿、肛门红肿、出血和腹部发白等[13]。
斑马鱼(Danio rerio)是发育生物学、神经生物学、毒理学和遗传疾病广泛使用的研究模型，是进行药物毒理学评估的良好模式动物[14]。由于斑马鱼为热带鱼，生长的温度与迟缓爱德华氏菌最适生长温度重合，且对迟缓爱德华氏菌非常敏感，水体和饲料中带菌易感染患病。同时，斑马鱼作为模式动物，也十分适合用于感染模型的研究。目前有关迟缓爱德华氏菌感染模型的研究较少，也缺乏有效的防治手段[15]，在本试验中，以斑马鱼为研究对象，人工感染迟缓爱德华氏菌，研究了斑马鱼人工感染迟缓爱德华氏菌的不同方式、主要的病理学症状以及感染后生化指标的测定。通过研究迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的模型可以有效对养殖过程中水生物感染迟缓爱德华氏菌病提供科学的疾病防控参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料健康斑马鱼480尾，平均体长(3±0.5) cm。先暂养于水族缸内，水温(25±2) ℃，每天早晚各投喂1次，每2天换水1/4，暂养2周后挑选270尾健康的鱼进行试验，分为27组，每组10尾，养于3 L鱼缸内，试验前1 d不投喂。迟缓爱德华氏菌(E. tarda) T9，来自鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)等试剂盒购自南京建成生物工程研究所。OCT冷冻切片包埋剂(optimum cutting temperature compound)购自北京诺博莱德科技有限公司。
1.2 菌株纯化与培养将‒80 ℃保存的迟缓爱德华氏菌T9划线于SS培养基上，28 ℃恒温培养24 h，挑取单个菌落接入LB (Luria-Bertani)营养肉汤，28 ℃恒温摇床200 r/ min培养至对数生长中期(OD600值达到1.0)，取菌液4 ℃、4 000 r/ min离心，弃上清，用生理盐水重悬洗涤3次后备用
1.3 注射感染及半数致死量(lethal dose, LD50)测定采用腹腔注射感染方式进行，试验组用微量进样器注射迟缓爱德华氏菌菌液，每尾10 µL，感染浓度分别为1.5×102、1.5×103、1.5×104和1.5×106 CFU/尾。对照组注射0.9% NaCl的生理盐水10 µL/尾。每个梯度组注射10尾鱼，每组设3个平行组。注射后养于亚克力鱼缸内，每日正常饲喂，并观察鱼的行为活动、发病和死亡迹象，并取发病、濒死的鱼进行病原分离鉴定和组织病理学检查。
1.4 表皮创伤浸泡感染用无菌手术刀沿斑马鱼胸鳍后方侧面轻轻刮擦，以去除3‒5个鳞片，并刮擦鱼体真皮。对照组、试验组创伤后的鱼分别养于迟缓爱德华氏菌浓度为0 CFU/mL和1.5×106 CFU/mL的3 L鱼缸中，每个浓度组10尾鱼，每组设3个平行组。试验采用静态浸泡，连续7 d，每日观察记录鱼的行为活动、发病和死亡迹象。
1.5 剪尾鳍浸泡感染用无菌手术剪剪去斑马鱼尾鳍，对照组和试验组剪尾后的鱼分别养于含迟缓爱德华氏菌终浓度为0 CFU/mL和1.5×106 CFU/ mL的3 L鱼缸中，每个浓度组10尾鱼，每组设3个平行组。试验采用静态浸泡，连续7 d，每日观察记录鱼的行为活动、发病和死亡迹象。
1.6 内脏团生化指标活性测定取迟缓爱德华氏菌注射感染组(1.5×104 CFU/尾)感染后第10天的活鱼以及对照组鱼进行生化指标测定。将鱼麻醉后，先用75%乙醇浸泡30 s，然后在无菌条件下取出斑马鱼内脏团，并称量，放入2 mL离心管中，加入9倍于内脏团重量的灭菌生理盐水进行匀浆。参照试剂盒说明书操作对病鱼内脏进行SOD、ACP、AKP和MDA等指标测定。
1.7 组织病理学观察取注射组感染发病且有明显病症的濒死斑马鱼和对照组健康斑马鱼进行冷冻切片，观察其组织病理变化。具体操作方法为：将鱼麻醉之后，用无菌手术剪沿鱼腹线剪开，在解剖镜下取出肝脏，置于20倍样本体积的4%甲醛溶液中固定48 h后，OCT包埋，液氮速冻，立即进行冷冻切片，经苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)后中性树脂封片，完全干燥后用正置荧光显微镜观察。
1.8 重新分离细菌取注射组感染发病且有明显病症的濒死斑马鱼进行麻醉后，先用75%乙醇浸泡30 s，然后在无菌条件下将斑马鱼解剖并取出内脏团放入2 mL离心管中，加入1 mL灭菌生理盐水进行匀浆。匀浆液用生理盐水稀释100倍后取0.1 mL涂布SS琼脂平板上，28 ℃恒温培养2 d后，挑取形状、大小、颜色一致的优势菌落进行划线分离纯化，直至获得纯菌。
1.9 分离菌株形态观察以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为对照，分离的菌株进行革兰氏染色。
1.10 菌株鉴定采用常规菌液聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)进行分离菌株鉴定。将分离纯化的细菌接种至LB肉汤，置于恒温摇床培养，温度28 ℃、速度为200 r/min，取对数生长中5期的菌液作为PCR模板。PCR反应体系为25 μL：10 μmol/L正引物1 μL、反引物1 μL、ddH2O 9.5 μL、模板菌液1 μL、2×Taq MasterMix 12.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，重复35个循环。扩增的片段进行1%琼脂糖凝胶电泳，并比对结果。所用特异性引物为迟缓爱德华氏菌5唾液酸酶基因mRNA引物F (5ʹ-CTGATGGACACGGCAAA GTG-3ʹ)和R (5ʹ-GATAACGGCCTGCGATAGAA- 3ʹ)。GenBank登录号：LC268999.1。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.11 16S rRNA基因序列分析将病鱼体内分离得到的菌株MH、Qi和TX挑取单个菌落接入LB营养肉汤，28 ℃恒温摇床200 r/min培养过夜，取1.5 mL菌液，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。将测得序列通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)进行BLAST序列同源性分析，并下载相关16S rRNA基因序列，使用MEGA X的Clustal W模式进行序列匹配，使用邻接法(neighbour-joining, NJ)构建进化树并进行1 000次自举分析。
2 结果与分析 2.1 三种人工感染方式比较斑马鱼分别经3种操作方式感染迟缓爱德华氏菌，死亡情况见图 1。在试验期间，对照组斑马鱼活动正常，没有发生死亡。表皮创伤组、剪尾鳍组和腹腔注射组在感染后7 d内的平均累积死亡率分别为30.5%、27.0%和100%。
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| 图 1 三种感染方式感染斑马鱼的累积死亡率 Figure 1 Cumulative mortality rate of zebrafish infected with three different modes of infection for 7 days. Each point represents the means mortality from three replicate experiments. |
2.2 感染后斑马鱼的表观症状
迟缓爱德华氏菌感染后，斑马鱼的眼球突出(图 2A、2B)；腹部膨胀(图 2C)，有腹水(图 2D)；肛门水肿(图 2D)；注射部位较大病变，严重溃烂；体表出现溃疡(图 2D)等，其行为表现为食欲不振，游动缓慢，对外界刺激反应迟钝等。
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| 图 2 感染后斑马鱼的表观症状 Figure 2 The phenotypic symptoms of zebrafish infection with Edwardsiella tarda. A: Exophthalmos (dorsal view). B: Exophthalmos (ventral aspect view). C: Abdo minal swelling. D: Abdo minal swelling, ulceration, ascites, exophthalmos. |
2.3 感染后斑马鱼组织病理学观察
斑马鱼感染迟缓爱德华氏菌后，肝脏组织形态严重受损，大面积坏死(图 3A)。肝细胞坏死脱落，吞噬细胞增生(图 3B)，肝小叶排列松散，萎缩，出现空泡状变性(图 3C)。对照组未见明显异常(图 3D)。
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| 图 3 斑马鱼的肝脏病理切片 Figure 3 Liver biopsy of zebrafish after infection with Edwardsiella tarda. A: The arrows indicate severely damaged liver tissue with extensive necrosis. B: The arrows indicate necrosis and shedding of liver cells, and proliferation of phagocytic cells. C: The arrows indicate that the hepatic lobules are loosely arranged, shrunk, and appear vacuolar degeneration. D: No abnormality was found in the control group. |
2.4 感染后病原菌的再分离与鉴定 2.4.1 菌株分离结果
从对照组和注射组斑马鱼的内脏、水样中，经SS琼脂培养分离纯化，从注射组斑马鱼内脏中得到3株可疑菌株，根据优势菌丰度由高到低分别命名为TX、MH和Qi，对照组鱼内脏未分离出细菌。菌株TX在SS琼脂平板上28 ℃培养，前12 h为黄色、圆形、微凸的细小菌落，培养超过24 h后形成黑色中心的菌落(图 4A)，与菌株T9 SS琼脂平板上菌落形态一致(图 4B)，同一块分离平板数量占92.6%；菌株Qi在SS琼脂平板上28 ℃培养24 h后形成圆形、黄色、湿润、光滑的菌落(图 4C)，同一块分离平板上数量仅为7.4%；菌株MH在SS琼脂平板上28 ℃培养24 h后形成圆形、玫红色、个别中心带黑点的菌落(图 4D)，同一块分离平板上极少，偶有出现。
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| 图 4 TX、MH和Qi及原始感染菌株Edwardsiella tarda T9在SS琼脂平板上菌落形态 Figure 4 Morphology of TX, MH, Qi and original infected Edwardsiella tarda T9 on SS agar plate. A: The colony morphology of TX strain on SS agar plate. B: The colony morphology of the original infected strain T9 on SS agar plate. C: The colony morphology of Qi strain on SS agar plate. D: The colony morphology of MH strain on SS agar plate. |
2.4.2 重分离菌株镜检观察
分离菌株TX、MH和Qi均为革兰氏阴性，结果见图 5。菌株TX为短杆状(图 5D)，菌株MH为长杆状(图 5E)，菌株Qi为两端钝圆、类椭圆形(图 5F)。
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| 图 5 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、菌株TX、MH和Qi的革兰氏染色镜检图片 Figure 5 Gram's stain microphotograph of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, strains TX, MH and Qi. A: Escherichia coli. B: Staphylococcus aureus. C: Mixed Escherichia coli and Staphylococcus aureus. D: TX. E: MH. F: Qi. |
2.4.3 菌液PCR鉴定结果
将分离菌TX、MH和Qi的菌液作为模板进行PCR扩增，其产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图 6。从图中可以看出，菌株Qi、MH的唾液酸酶基因PCR产物无电泳条带；菌株TX和原始菌株T9的唾液酸酶基因PCR产物电泳条带一致，介于100‒250 bp。根据电泳结果可以推断菌株TX可能为迟缓爱德华氏菌。
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| 图 6 唾液酸酶基因的PCR产物电泳图 Figure 6 PCR electrophoresis of sialidase gene. M: DL2000 DNA marker; Qi: PCR product of strain Qi sialidase gene; TX: PCR products of sialidase gene of strain TX; T9: PCR product of sialidase gene of original strain T9; MH: PCR products of sialidase gene of strain MH. |
2.4.4 16S rRNA基因序列分析结果
将得到的序列在NCBI上将得到的序列进行BLAST分析，菌株MH为弗氏柠檬酸杆菌(登录号：ON533730)，序列与弗氏柠檬酸杆菌同源性为99.93%。菌株Qi为维氏气单胞菌(登录号：ON533731)，序列与维氏气单胞菌同源性为99.86%。菌株TX为迟缓爱德华氏菌(登录号：SUB12995589)，序列与迟缓爱德华氏菌同源性为99.93%。构建的系统发育树表明菌株MH与弗氏柠檬酸杆菌处于同一进化分支，菌株Qi与维氏气单胞菌处在同一进化分支，菌株TX与迟缓爱德华氏菌处于同一进化分支(图 7)。
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| 图 7 基于菌株TX、MH和Qi的16S rRNA序列构建的系统发育树 Figure 7 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA sequences of strains TX, MH, and Qi. A: Phylogenetic tree of TX. B: Phylogenetic tree of MH. C: Phylogenetic tree of Qi. The numbers of nodes are the results of 1 000 bootstrap replicates and the scale bar represents the genetic distance. |
2.5 腹腔注射感染动力学
迟缓爱德华氏菌腹腔注射感染斑马鱼累积死亡情况见图 8，对照组未表现死亡现象。由图可知，在感染7 d内，腹腔注射感染组1.5×102、1.5×103、1.5×104和1.5×106 CFU/尾的斑马鱼平均累积死亡率分别为43.33%、53.33%、57.67%和100%。感染组1.5×106 CFU/尾的斑马鱼在3 dpi全部死亡，其余感染组死亡集中在1–4 dpi。斑马鱼腹腔注射迟缓爱德华氏菌各浓度累积死亡率与菌浓对数关系拟合方程y=0.141x–0.177 2 (R2=0.920 4)，根据Reed-Muench方法计算得到LD50为3.65×102 CFU/尾。
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| 图 8 腹腔注射感染斑马鱼累积死亡率 Figure 8 Cumulative mortality of zebrafish infected by intraperitoneal injection of Edwardsiella tarda. Each point represents the means mortality from three replicate experiments. |
2.6 斑马鱼注射感染后生化指标
斑马鱼腹腔注射1.5×104 CFU/尾的迟缓爱德华氏菌感染第10天，其内脏团SOD活力和抑制率、内脏团MDA含量、内脏团磷酸酶活性见图 9。由图可知，对照组、感染组平均SOD活力分别为180.38 U/mg prot和140.24 U/mg prot，平均SOD抑制率分别为24.12%和18.86%；感染组较对照组SOD活力下降22.26%，SOD抑制率下降5.26%，两试验组SOD活力和抑制率没有显著性差异(P > 0.05)。对照组和感染组平均MDA含量分别为1.96 nmol/mg prot和34.05 nmol/mg prot，感染组较对照组增加16倍，两者之间差异性极显著(P < 0.01)。其内脏团磷酸酶活性见图 9。由图可知，对照组和感染组平均ACP活力分别为251.7 King’s unit/g prot和349.9 King’s unit/g prot，平均AKP活力分别为290.9 King’s unit/g prot和361.8 King’s unit/g prot。感染组较对照组ACP和AKP活力分别上升38.99%和24.36%，但两组之间均无显著性差异(P > 0.05)。
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| 图 9 斑马鱼注射感染后生化指标测定 Figure 9 Determination of biochemical characteristics in zebrafish after injection of Edwardsiella tarda. ***: Significant difference compared with the control (P < 0.01); ns: There was no significant difference with the control (P > 0.05). |
3 讨论 3.1 三种人工方式感染斑马鱼比较
在自然条件下，迟缓爱德华氏菌可以感染多种水生物，并引起死亡，如尼罗罗非鱼[16]、莫桑比克罗非鱼(Tilapia mossambica)[17]、鲤鱼[18]、大口黑鲈(Micropterus salmoides)[19]、奇努克鲑鱼(Oncorhynchus tshawytscha)[20]和虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)[21]。Pressley等[12]研究发现，以斑马鱼作为宿主研究迟缓爱德华氏菌的致病力时，未对鱼体造成损伤的感染方式不会造成明显感染。本研究以3种不同方式人工感染，发现斑马鱼腹腔注射迟缓爱德华氏菌的LD50为3.65×102 CFU/尾；腹腔注射、表皮创伤和剪尾鳍浸泡于浓度为1.5×106 CFU/mL迟缓爱德华氏菌水体，在感染后7 d内斑马鱼的死亡率分别为57.67%、30.5%和27.0%，表明迟缓爱德华氏菌可以引起斑马鱼致病，且腹腔注射感染在菌浓较低的情况下可使斑马鱼发病、甚至死亡；机体体表创伤在较高菌浓水体中，斑马鱼也会受到感染、死亡。这可能是由于斑马鱼的创伤，导致机械屏障的破坏，引起菌的继发性感染；同时，感染发病的鱼经细菌再分离、鉴定，丰度最高优势菌确定为迟缓爱德华氏菌。这些结果也表明斑马鱼可以作为研究迟缓爱德华氏菌感染的模型生物。
3.2 迟缓爱德华氏菌感染后的表观和病理学症状水生生物被迟缓爱德华氏菌感染后，通常表现为体表发红、脏器脓肿等病理变化。自然发病以及人工感染爱德华氏菌的日本比目鱼[22]和鲶鱼[23]肾脏和肝脏明显脓肿和坏死；罗非鱼感染迟缓爱德华氏菌后，腹部发红，肛门红肿、出血[24]；对于注射感染的斑马鱼，美洲黑石斑在感染迟缓爱德华氏菌后体表未出现异常，但鳃丝内出现白点，内脏有白点结节[25]。本试验通过人工感染迟缓爱德华氏菌，斑马鱼腹部肿胀、出血，表皮溃疡，肝脏组织空泡状变性、细胞破碎，变性，萎缩坏死，这些发病症状与其他鱼类自然或人工感染迟缓爱德华氏菌发病症状类似。
皮肤感染是多种细菌感染宿主的入侵途径，Chu和O’Toole等[26-27]研究发现，嗜水气单胞菌主要通过该途径感染宿主。本试验以表皮创伤感染的斑马鱼，在创伤部位会有溃疡、点状出血；以剪尾鳍感染的斑马鱼症状不明显，死亡率较低，且尾鳍有重新长出的趋势，这是因为斑马鱼尾鳍再生能力强[28]。此外，前者较后者感染后死亡明显，这可能是表皮屏障防御在鱼类预防感染方面起着至关重要的作用，也进一步说明在浸泡感染前去除鳞片、刮去表皮和磨损真皮使斑马鱼更易被细菌感染[29]。
3.3 斑马鱼感染迟缓爱德华氏菌后生化指标变化彭国瑞等[11]研究发现，斑马鱼感染迟缓爱德华氏菌后，表现出了严重的肝组织变性，这与本研究报道的结果一致。关于迟缓爱德华氏菌的致病机理尚未完全探明，本试验通过测定斑马鱼急性感染后的生化指标，研究迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼的致病机理。斑马鱼在急性感染后，机体会产生大量的活性氧自由基，从而刺激机体分泌SOD来清除自由基[30]，因此SOD活力是反应感染后机体变化情况的一个指标。沈洪艳等[31]研究表明，在抗生素如头孢噻肟钠的胁迫下，会破坏斑马鱼机体的抗氧化平衡系统，给机体带来不同程度的氧化损伤，表现为SOD活性抑制，MDA含量升高。本试验采用1.5×104 CFU/尾注射感染组的斑马鱼活鱼以及对照组鱼进行SOD测定，结果显示感染组较对照组的SOD活力和抑制率分别下降22.26%和5.26%，表明斑马鱼被迟缓爱德华氏菌感染后细胞严重损伤，进而引起发病症状。
丙二醛(MDA)是脂质过氧化后的主要产物之一，当鱼被感染后，体内脂质过氧化程度上升，MDA含量也随之上升。这间接反映了细胞损伤的程度，从而反应免疫力下降的程度[31]。在本试验中，感染组MDA (34.05 nmol/mg prot)显著高于对照组MDA (1.96 nmol/mg prot)，升高16倍。表明迟缓爱德华氏菌感染斑马鱼导致体内细胞严重氧化损伤，进而导致免疫力严重下降。在本试验中，除了迟缓爱德华氏菌外，还从发病鱼体内分离出了柠檬酸杆菌和维氏气单胞菌，表明斑马鱼在感染迟缓爱德华氏菌后出现了继发性感染的情况，这些继发性感染可能会对鱼体免疫系统造成更严重的损伤，并且进一步破坏抗氧化平衡系统。
酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)是2种重要的溶酶体酶，广泛应用于细胞吞噬研究中，并被认为是细胞吞噬作用的代表性标记酶，磷酸酶的变化在一定程度上反映了动物体免疫系统的受损情况[32]，ACP同时也表明细胞内消化活动的进行[33]，斑马鱼体内细胞可以通过胞饮的作用直接吸收蛋白质颗粒，然后在胞内进行消化[34]。本试验结果表明，注射感染组斑马鱼ACP活力和AKP活力均高于对照组，这表明斑马鱼被迟缓爱德华氏菌感染后启动了细胞免疫反应，以细胞吞噬的方式消除细菌等不利因子。
4 结论本研究通过不同的人工感染方式(剪尾鳍浸泡、表皮创伤浸泡和腹腔注射)对斑马鱼感染迟缓爱德华氏菌进行了系统研究，包括感染途径、发病机理、致死原因和半致死剂量等，为病理学、药理学和药物学研究提供了疾病模型。研究结果显示，在3种感染方式中，腹腔注射感染的斑马鱼疾病症状最为明显，表现出眼球突出、肛门出血、溃疡和腹水等症状，半致死剂量LD50为3.65×102 CFU/尾；通过SOD、MDA、ACP和AKP等生化指标的检测，以及肝脏病理切片的观察，发现斑马鱼在感染迟缓爱德华氏菌后会出现严重的细胞氧化损伤，导致免疫力严重下降，从而引发其他病原菌的继发性感染。综上所述，本研究揭示了斑马鱼易受迟缓爱德华氏菌感染的途径，尤其在破坏皮肤屏障后感染明显。研究结果为鱼类疾病学研究和防治药物研制提供了重要的疾病模型构建方法。
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