2023, Vol. 63
表1(Table 1)
一株C3形态多重耐药大肠杆菌噬菌体生物学特性和基因组分析
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20230316
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 左君豪, 王雪, 曾君, 王猛, 郭志良, 季芳, 徐莉莉, 韦燕文, 王倩, 赵瑞利, 王承民. 2023
- ZUO Junhao, WANG Xue, ZENG Jun, WANG Meng, GUO Zhiliang, JI Fang, XU Lili, WEI Yanwen, WANG Qian, ZHAO Ruili, WANG Chengmin.
- 一株C3形态多重耐药大肠杆菌噬菌体生物学特性和基因组分析
- Biological characteristics and genome of a C3-morphotype phage against multidrug-resistant Escherichia coli
- 微生物学报, 63(12): 4752-4768
- Acta Microbiologica Sinica, 63(12): 4752-4768
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文章历史
- 收稿日期：2023-05-05
- 网络出版日期：2023-08-08
引用本文 |
左君豪, 王雪, 曾君, 王猛, 郭志良, 季芳, 徐莉莉, 韦燕文, 王倩, 赵瑞利, 王承民. 一株C3形态多重耐药大肠杆菌噬菌体生物学特性和基因组分析[J]. 微生物学报, 2023, 63(12): 4752-4768.
Zuo Junhao, Wang Xue, Zeng Jun, Wang Meng, Guo Zhiliang, Ji Fang, Xu Lili, Wei Yanwen, Wang Qian, Zhao Ruili, Wang Chengmin. Biological characteristics and genome of a C3-morphotype phage against multidrug-resistant Escherichia coli[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2023, 63(12): 4752-4768.
一株C3形态多重耐药大肠杆菌噬菌体生物学特性和基因组分析
1. 天津农学院动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室, 天津 300392;
2. 广东省科学院动物研究所 广东省动物保护与资源利用重点实验室 广东省野生动物保护与利用公共实验室, 广东 广州 510260;
3. 优宜邦生物科技(上海)有限公司, 上海 201103;
4. 河北农业大学动物医学院, 河北 保定 071000;
5. 五邑大学生物科技与大健康学院, 广东 江门 529020
2. 广东省科学院动物研究所 广东省动物保护与资源利用重点实验室 广东省野生动物保护与利用公共实验室, 广东 广州 510260;
3. 优宜邦生物科技(上海)有限公司, 上海 201103;
4. 河北农业大学动物医学院, 河北 保定 071000;
5. 五邑大学生物科技与大健康学院, 广东 江门 529020
摘要：[目的] 多重耐药菌的出现对公共卫生安全构成严重威胁，本研究分离多重耐药大肠杆菌噬菌体，研究其生物学特性和基因组特征，为耐药菌的噬菌体疗法提供理论依据。[方法] 使用双层平板法从污水样本中分离纯化大肠杆菌噬菌体；磷钨酸染色后通过透射电镜观察形态；测定其宿主范围，测定温度和pH稳定性、一步生长曲线和体外抑菌效果等生物学特性；体内抑菌试验评估噬菌体对多重耐药大肠杆菌N1203-1Af感染的大蜡螟幼虫的保护作用；基于全基因组测序对其基因组特点进行分析。[结果] 本研究分离共得到5株大肠杆菌噬菌体，分别命名为pEC-S163-2.1、pEC-S163-2.2、pEC-M1167-5Ar.1、pEC-m1291-2Dr.1和pEC-N1203-2Af.1；电镜结果显示噬菌体pEC-N1203-2Af.1属于短尾噬菌体中罕见的C3形态型，头部较长，长是宽的2–3倍；pEC-N1203-2Af.1可裂解受试15株大肠杆菌中的3株；感染10 min后进入指数增长期，–20−50 ℃、pH值为4.0–10.0的环境下均能够保持稳定活性；大蜡螟幼虫感染大肠杆菌N1203-2Af后噬菌体pEC-N1203-2Af.1治疗感染复数(multiplicity of infection, MOI)=100、1和0.01在48 h内存活率均达到70%以上(7/10）；噬菌体pEC-N1203-2Af.1基因组全长77 334 bp，(G+C)%含量为42.18%，不携带耐药基因和毒力因子；功能基因预测表明，噬菌体pEC-N1203-2Af.1基因组共有121个CDS，其中CDS53–CDS64是编码噬菌体结构和裂解模块的序列。[结论] 多重耐药大肠杆菌噬菌体pEC-N1203-2Af.1具有良好的抑菌活性，生物学特性稳定，可能为Kuravirus属的新成员，其具有罕见的C3形态，这种头部细长的特殊形态可能与CDS63编码的主要头部蛋白有关。不同地区的C3形态噬菌体长尾纤维远端三聚体蛋白一致性小于50%，推测该形态噬菌体为适应不同的环境可能发生了不同方向的进化。
关键词：多重耐药大肠杆菌 C3形态噬菌体 生物学特性 结构蛋白基因 基因组学
Biological characteristics and genome of a C3-morphotype phage against multidrug-resistant Escherichia coli
1. Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China;
2. Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization, Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Institute of Zoology, Guangdong Academy of Sciences, Guangzhou 510260, Guangdong, China;
3. Union Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai 201103, China;
4. College of Veterinary Medicine, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, Hebei, China;
5. School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University, Jiangmen 529020, Guangdong, China
2. Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization, Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Institute of Zoology, Guangdong Academy of Sciences, Guangzhou 510260, Guangdong, China;
3. Union Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai 201103, China;
4. College of Veterinary Medicine, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, Hebei, China;
5. School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University, Jiangmen 529020, Guangdong, China
Abstract: [Objective] The emergence of multidrug-resistant bacteria represents a serious challenge to public health security. In this study, we isolated the phages against multidrug-resistant Escherichia coli and studied their biological and genomic features, aiming to provide a theoretical foundation for the development of phage therapies against drug-resistant bacteria. [Methods] We used the double plate method to isolate E. coli phages from sewage. We employed phosphotungstic acid staining and transmission electron microscopy to observe the phage morphology, and subsequently assessed the biological properties, including host range, thermal and pH stability, one-step growth curve, and in vitro antibacterial effect of the phages. Furthermore, we conducted an in vivo bacteriostasis test to evaluate the protective effects of the phages on Galleria mellonella larvae infected with multidrug-resistant E. coli N1203-1Af. Finally, we carried out whole genome sequencing to analyze the genomic characteristics of the phages. [Results] Five E. coli phages (pEC-S163-2.1, pEC-S163-2.2, pEC-M1167-5Ar.1, pEC-m1291-2DR.1, and pEC-N1203-2Af.1) were isolated. The phage pEC-N1203-2Af.1 presented a C3 morphotype rare among short-tailed phages and was characterized by a long head with the length 2–3 times that of the width. Furthermore, pEC-N1203-2Af.1 demonstrated lytic activity against three out of the 15 tested E. coli strains. Ten minutes after infection, the phage entered an exponential growth phase and exhibited stable activity within the temperature range of –20 to 50 ℃ and pH 4.0–10.0. After treatment with pEC-N1203-2Af.1 at the multiplicity of infection (MOI) levels of 100, 1, and 0.01 for 48 h, the survival of G. mellonella larvae infected with E. coli N1203-2Af reached over 70% (7/10). The genome of phage pEC-N1203-2Af.1 had a total length of 77 334 bp and the G+C content of 42.18%. Notably, the phage did not carry any drug resistance gene or virulence factor. Functional gene prediction revealed a total of 121 CDS in the phage genome, with CDS53–CDS64 encoding the phage structure and lysis module. [Conclusion] The phage pEC-N1203-2Af.1 against multidrug-resistant E. coli exhibits potent antibacterial activity and stable biological characteristics. Our findings suggest that pEC-N1203-2Af.1 may represent a new member of the Kuravirus genus, characterized by a rare C3 morphotype that may be attributed to the main head protein encoded by CDS63. Notably, the distal trimeric protein of bacteriophages with a C3 morphotype exhibits less than 50% consistency across different regions, which indicates that the bacteriophages with this morphotype may have evolved in diverse directions to adapt to varying environmental conditions.
Keywords:
multidrug-resistant Escherichia coli bacteriophage with a C3-morphotype biological characteristics structural protein genes genomics
大肠杆菌(Escherichia coli)是肠杆菌科的重要成员，其广泛分布于自然界，普遍栖息在人类和温血动物胃肠道中，也是最重要的条件致病菌之一[1]。大肠杆菌是引起肠炎、尿路感染、败血症和其他临床感染(如新生儿脑膜炎)的主要病原体[2]，2011–2014年美国国家医疗安全网络报告指出，美国境内出现的临床相关感染中12%由大肠杆菌引起[3]。目前，抗生素仍然是大肠杆菌感染的主要治疗手段，然而由于抗生素的滥用，大肠杆菌的耐药率不断提高。2021年中国细菌耐药监测报告称大肠杆菌对头孢曲松、头孢噻肟、哌拉西林、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均超过50%[4]。碳青霉烯耐药大肠杆菌在全球范围存在，在一部分国家和地区已经成造成严峻的公共卫生问题，2022年Ledda等报道了某地区医院爆发的ST399型碳青霉烯耐药大肠杆菌，其质粒携带碳青霉烯酶编码基因blaOXA-48[5]。2018年，河南某医院的大肠杆菌分离株中发现blaNDM-5和mcr-1共存的现象，该分离株对包括粘菌素在内的所有受试抗生素均表现出耐药性[6]。多重耐药菌的出现对医疗工作和公共卫生构成严重威胁，传统抗生素疗法面临治疗无效的困境，需要加强对抗生素使用的管理和监控，亟需发展新型抗菌药物加以应对，而噬菌体疗法具备治疗耐药菌株感染潜力，有望成为替代抗生素疗法的新型绿色生态技术[7]。
噬菌体是一种能够特异性感染细菌、真菌和古菌等宿主的微生物病毒，在自然界分布极广[8]。基于噬菌体基因组类型，可分为最常见的双链DNA类型(double stranded deoxyribonucleic acid, dsDNA)，和不常见的单链DNA类型(single stranded deoxyribonucleic acid, ssDNA)、双链RNA类型(double stranded ribonucleic acid, dsRNA)和单链RNA类型(single stranded ribonucleic acid, ssRNA)[9]。迄今为止绝大多数dsDNA基因组类型的噬菌体都属于尾噬菌体目(Caudovirales)[10]，值得注意的是，C3形态型噬菌体短尾噬菌体中较为罕见的类型，其头部呈细长的椭圆形，长是宽的2−3倍，通过5 500株噬菌体的电镜观察试验，观察到的C3样噬菌体仅占比0.5%[11]。依据2019年国际病毒分类委员会发布的噬菌体分类学研究，以phiEco32为代表的C3形态型噬菌体被归类至Kuravirus属[12]，phiEco32具有该类型噬菌体的典型结构，能够以大肠杆菌作为宿主，2008年Dhruti Savalia等在大规模筛选治疗牛乳腺炎的噬菌体时，首次从格鲁吉亚第比利斯的库拉河中分离得到[13]。目前绝大多数C3形态型噬菌体以革兰氏阴性菌作为宿主菌，中国首次报道的C3形态噬菌体NJ01分离自江苏省南京市，其以禽致病性大肠杆菌为宿主菌[14]，肠道沙门氏菌噬菌体7−11则发现于加拿大，其在转录过程中不依赖σ70转录的关闭，不存在中间启动子[15]。革兰氏阳性菌中，具有C3形态的噬菌体仅由Alain Chopin等报道，它以乳酸乳球菌为宿主菌，具有T7-like转录系统，基因组组分与其他C3样噬菌体同源性很低[16]。
由于抗生素的过度使用，多种临床常见菌株产生耐药性并广泛传播于细菌界，若不加以遏制，细菌感染引发的病症将面临无药可用的困境。噬菌体具有宿主特异性高、自我快速复制和安全性高等优势，作为细菌的“专业杀手”，噬菌体有望成为抗生素的优良替代疗法。在针对多重耐药大肠杆菌的研究中，本研究分离得到1株C3形态的大肠杆菌噬菌体，命名为pEC-N1203-2Af.1。尽管噬菌体pEC-N1203-2Af.1宿主谱较窄但它的3株宿主菌均为多重耐药菌，同时该噬菌体的形态特殊罕见、生物学特性稳定且具有良好的抑菌活性，因此基于其生物学表型和基因组特征进行深入研究，为提供进一步合理利用噬菌体资源的理论依据，以及研发新型噬菌体疗法奠定基础。
1 材料与方法 1.1 菌株来源分离噬菌体所用的15株大肠杆菌由本实验室分离，置于−20 ℃条件下50%甘油水冻存保藏。
1.2 噬菌体分离纯化样本采集自广州市西朗污水处理厂，并使用双层平板法分离纯化噬菌体。将10 mL污水样品8 000 r/min离心10 min，使用0.22 μm滤膜过滤后备用。重新复壮15株大肠杆菌，取滤液1 mL与菌液100 μL在5 mL M-H肉汤(Mueller-Hinton broth, MHB)培养基中充分混匀，连续培养12 h后8 000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm水系微孔滤膜至另一离心管。取100 μL菌液与8 mL预热的半固体培养基(MHB+0.7%琼脂)混匀，倾倒于底层固体MHA平板并在表面滴加10 μL MHB培养基滤液，37 ℃条件下连续培养12 h，期间多次观察是否有透明噬菌斑出现。
使用双层平板法对噬菌体进行纯化[17]，挑取双层平板表面出现的单个噬菌斑，10倍梯度连续稀释，吸取适宜稀释度下100 μL噬菌体液与等体积宿主菌液混匀，35 ℃条件下吸附10 min，加入8 mL预热的半固体培养基，颠倒混匀后倒入M-H琼脂(Mueller-Hinton agar, MHA)平板，冷却凝固后35 ℃条件下倒置培养12 h。以上步骤重复3–5次，至噬菌斑形态、大小均一不再变化，即获得单一噬菌体。上述操作均在无菌条件下进行。
1.3 噬菌体生物学特性检测 1.3.1 形态学观察使用负染色法进行电镜样品染色，将10 μL样品滴于石蜡封口膜，铜网正面朝下倒扣至样品静置1 min，吸走多余样品液后以同样方法倒扣于磷钨酸染色液，静置1 min，室温下干燥。通过透射电子显微镜JEM-1400 flash在120 kV下观察并拍摄噬菌体的形态特征。
1.3.2 宿主谱参照Ahmed R. Sofy等的方法[18]，取本实验室保藏的大肠杆菌重新复壮至对数生长期，将100 μL菌液与预热的半固体培养基混匀，倾倒于固体平板表面，待上层培养基凝固后，取10 μL噬菌体富集液滴于半固体培养基表面，于恒温培养箱35 ℃倒置培养12 h以确认宿主范围。
1.3.3 温度及酸碱稳定性将1 mL噬菌体纯化液分别置于−20、4、25、37、50、60和70 ℃条件下处理1 h，通过双层平板法测定效价以评估其温度稳定性。
使用HCl和NaOH溶液将MHB培养基调整pH值至2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0和12.0，取噬菌体纯化液100 μL与900 μL上述液体混匀，37 ℃孵育1 h，通过双层平板法测定效价以评估其酸碱稳定性[19]。
1.3.4 一步生长曲线噬菌体与宿主菌以感染复数(multiplicity of infection, MOI)=0.01比例充分混匀，35 ℃条件下孵育10 min以吸附噬菌体，10 000 r/min离心1 min收集菌体沉淀并弃去上清，用新鲜MHB洗涤2次，10 000 r/min离心1 min后重悬沉淀并添加MHB至5 mL，将离心管振荡混匀，此时计为0时刻，间隔10 min多次取样，10 000 r/min离心1 min取上层清液，通过双层平板法测定其效价并绘制一步生长曲线。
1.3.5 体外抑菌试验使用MHB稀释调整对数生长期宿主菌液至OD595=0.10 [7×107 colony forming unit (CFU)/mL]，稀释后的菌液分装至4支无菌离心管内，设置4个分组(1个对照组和3个试验组）。对照组，10 mL菌液+10 mL MHB培养基；试验组1 (MOI=100)，10 mL菌液+10 mL噬菌体液(以MOI为100的比例)；试验组2 (MOI=1)，10 mL菌液+10 mL噬菌体液(以MOI为1的比例)；试验组3 (MOI=0.01)，10 mL菌液+10 mL噬菌体液(以MOI为0.01的比例)。各组充分混匀后分装至1.5 mL离心管，37 ℃，180 r/min，每3 h取样并测定595 nm处的吸光度，连续测定24 h，每组重复3次，绘制噬菌体体外抑菌曲线。
1.3.6 噬菌体对大蜡螟幼虫的体内抑菌效果重新复苏多重耐药菌Escherichia coli N1203-2Af，活菌计数后用MHB稀释菌液调整其菌量为6×106、6×107、6×108和6×109 CFU/mL。将体重为200–250 mg的大蜡螟幼虫随机分为4组，每组10只，饥饿处理24 h。使用75%乙醇对大蜡螟幼虫进行体表消毒，从尾部左侧第一腹足处注射菌液(Escherichia coli N1203-2Af，10 μL/只，6×104、6×105、6×106和6×107 CFU)，注射完成后的大蜡螟幼虫置于37 ℃黑暗环境中禁食观察，每隔3 h记录存活率，连续记录24 h。
将体重为200−250 mg的大蜡螟幼虫随机分为6组，每组10只，禁食处理24 h，使用75%乙醇进行体表消毒。对于空白对照组及噬菌体安全性检验组，首先自尾部左侧第一腹足处注射10 μL生理盐水，30 min后自右侧第一腹足处注射等量生理盐水或噬菌体pEC-N1203-2Af.1 [5×107 PFU (plaque formation unit)]；对于其余试验组，首先自尾部左侧第一腹足处注射Escherichia coli N1203-2Af菌液10 μL (5×105 CFU)，30 min后在右侧第一副足分别注射等量生理盐水或噬菌体pEC-N1203-2Af.1 (5×107、5×105和5×103 PFU，表 1)。将大蜡螟幼虫置于37 ℃黑暗环境中禁食观察，每隔3 h记录存活率，连续记录48 h记录大蜡螟幼虫黑化情况和存活率[20]。
表 1. 噬菌体对大蜡螟幼虫的体内抑菌试验分组
Table 1. Grouping of bacteriophage protection tests against the larvae of Galleria mellonella
| Group | The first injection a | 30 minutes later b |
| Infection control | N1203-2Af (5×105 CFU） | Physiological saline |
| Blank control | Physiological saline | Physiological saline |
| Phage safety group | Physiological saline | pEC-N1203-2Af.1 (5×107 PFU) |
| Postinfection phage treatment group (MOI=100) | N1203-2Af (5×105 CFU） | pEC-N1203-2Af.1 (5×107 PFU) |
| Postinfection phage treatment group (MOI=1) | N1203-2Af (5×105 CFU） | pEC-N1203-2Af.1 (5×105 PFU) |
| Postinfection phage treatment group (MOI=0.01) | N1203-2Af (5×105 CFU） | pEC-N1203-2Af.1 (5×103 PFU) |
| a: Injection of physiological saline or Escherichia coli N1203-2Af, 10 μL; b: Injection of physiological saline or phage pEC-N1203-2Af.1, 10 μL. | ||
1.4 噬菌体全基因组测序
利用illumina Novaseq 6000测序平台进行全基因组测序(广东美格基因科技有限公司，广州)。DNA样品检测合格后构建文库，采用软件Soapnuke对测序的数据质量进行评估以及去除低质量数据，确保结果可信度。使用Megahit软件对clean data进行de novo组装。
1.5 噬菌体基因组功能注释分析基于美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)在线工具BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)进行噬菌体全基因组序列比对，使用MetaGeneMark (v3.38)进行基因组基因预测，利用BLASTp (e < 10−3)将所预测基因氨基酸序列与UniProtKB数据库的病毒序列(ViralZone, reviewed protein, https://viralzone.expasy.org/)进行比对，同时将噬菌体序列提交至pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)进行注释，结合以上两种方法获得校正注释结果。使用软件SnapGene software (from insightful science; available at snapgene.com)绘制噬菌体全基因组图谱；基于耐药基因数据库CARD (https://card.mcmaster.ca/)进行分析，预测是否携带抗生素耐药基因(antibiotics resistance genes, ARG)；下载毒力因子数据库VFDB (http://www.mgc.ac.cn/VFs/)的set A核心数据库，通过BLAST比对预测噬菌体是否携带毒力因子。使用BLAST ring image generator (BRIG)软件将噬菌体pEC-N1203-2Af.1基因组与C3形态大肠杆菌噬菌体O18-11、NJ01、172-1和phiEco32，非大肠杆菌宿主C3形态噬菌体7-11、KSY1和Vb_PmiP-P59基因组进行比较。
1.6 噬菌体全基因组系统进化分析在GenBank数据库中下载噬菌体全基因组序列，建立数据集。包括C3形态噬菌体分离来源、国家和宿主菌等信息，通过VICTOR[21] (https://ggdc.dsmz.de/victor.php#)构建噬菌体全基因组系统发育树，使用iToL (https://itol.embl.de/)对系统发育树进行可视化处理。
2 结果与分析 2.1 噬菌斑及形态特征本研究选取15株Escherichia coli作为宿主菌，共分离得到5株噬菌体，分别命名为pEC-S163-2.1、pEC-S163-2.2、pEC-M1167-5Ar.1、pEC-m1291-2Dr.1和pEC-N1203-2Af.1。其中，噬菌体pEC-N1203-2Af.1分离自污水厂污水样本，能够裂解多重耐药大肠杆菌N1203-2Af。pEC-N1203-2Af.1呈现边缘光滑的圆形噬菌斑，直径约为2 mm (图 1A)，透射电镜下观察显示其头部形态呈特殊的椭圆型，长约为129.68 nm，宽约为48.92 nm，尾部长约19.44 nm (图 1B)，形态学鉴定表明pEC-N1203-2Af.1属于短尾噬菌体中较为罕见的C3形态[22]。
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| 图 1 噬菌体pEC-N1203-2Af.1噬菌斑和电镜照片 Figure 1 Phage pEC-N1203-2Af.1 plaque and electron micrograph. A: Phage pEC-N1203-2Af.1 plaque. B: Phage pEC-N1203-2Af.1 electron micrograph. |
2.2 宿主谱
噬菌体pEC-N1203-2Af.1除裂解多重耐药大肠杆菌N1203-2Af外，还可裂解15株受试菌中的2株马来穿山甲来源多重耐药大肠杆菌S163-2、M172-1 (表 2)。
表 2. 噬菌体pEC-N1203-2Af.1细菌宿主谱
Table 2. Bacterial host spectrum of phage pEC-N1203-2Af.1
| Strain name | Specie | Host | Drug resistance | Lytic |
| S163-2 | Escherichia coli | Manis javanica | MDR | + |
| S171-1 | Escherichia coli | Manis javanica | MDR | − |
| M171-1 | Escherichia coli | Manis javanica | MDR | − |
| M172-1 | Escherichia coli | Manis javanica | MDR | + |
| M159-1 | Escherichia coli | Manis javanica | MDR | − |
| M2929-1AR | Escherichia coli | Rhinopithecus | NO | − |
| M2158-1Ar | Escherichia coli | Homo sapiens | NO | − |
| M1167-5Ar | Escherichia coli | Homo sapiens | MDR | − |
| M1291-2Dr | Escherichia coli | Homo sapiens | MDR | − |
| N1203-2Af | Escherichia coli | Homo sapiens | MDR | + |
| M2149-3Ar | Escherichia coli | Homo sapiens | NO | − |
| N2603-1at | Escherichia coli | Ailuropoda melanoleuca | NO | − |
| N2607-1at | Escherichia coli | Ailuropoda melanoleuca | NO | − |
| N2926-2AT | Escherichia coli | Rhinopithecus | NO | − |
| N2615-1aT | Escherichia coli | Rhinopithecus | NO | − |
| MDR: Multidrug resistant bacteria; NO: Non multidrug-resistant bacteria; +: Lytic; −: No lytic. | ||||
2.3 噬菌体稳定性及一步生长曲线
噬菌体pEC-M1203-2Af.1在4−37 ℃孵育1 h后保持稳定效价，60 ℃孵育1 h后噬菌体效价降至最低，70 ℃孵育1h后完全失活(图 2A)；pH值在4.0−10.0保持稳定，pH值7.0时效价最高，pH值2.0和pH值12.0时完全失活(图 2B)；潜伏期小于10 min，裂解期持续至80 min，80 min后进入平台期(图 2C)。
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| 图 2 噬菌体pEC-N1203-2Af.1生物学特性和体外抑菌效果 Figure 2 Biological characteristics and bacteriostatic effect in vitro of phage pEC-N1203-2Af.1. A: Temperature stability. B: pH stability. C: One-step growth curve. D: Bacteriostatic effect of phage pEC-N1203-2Af.1 in vitro. Each point represents the means SD from three replicate experiments. |
2.4 噬菌体体外抑菌效果
pEC-N1203-2Af.1在感染宿主菌的前6 h内抑菌效果十分明显，MOI=100、MOI=1和MOI=0.01条件下OD595均小于0.15，6 h后试验组OD595迅速升高，但MOI=100组在6−24 h内升高速率低于其他试验组(MOI=1和MOI=0.01)，且24 h内均低于对照组，而MOI=1和MOI=0.01的试验组OD595在6−9 h迅速升高，9 h后已经高于对照组数值(图 2D)。
2.5 噬菌体对大蜡螟幼虫的体内抑菌效果以6×105 CFU感染量接种大肠杆菌N1203-2Af的大蜡螟幼虫在24 h内死亡率为100%，6×104 CFU感染量接种的大蜡螟幼虫在24 h内死亡率为60%。以6×105 CFU为感染量时大蜡螟幼虫死亡过快，而6×104 CFU感染量下的大蜡螟幼虫死亡率较低，因此选取5×105 CFU用于正式试验的感染菌量。
未注射pEC-N1203-2Af.1的大蜡螟幼虫在注射N1203-2Af后48 h内死亡率高达70% (图 3A)，空白对照组和噬菌体安全性检验组大蜡螟幼虫正常存活(图 3B、3C)。不同MOI条件下噬菌体对感染N1203-2Af的大蜡螟幼虫保护效率不同，MOI=100、MOI=1和MOI=0.01组死亡率分别为0%、20%和30%，48 h内死亡率与MOI值呈正相关，噬菌体保护组大蜡螟幼虫与空白对照组相比颜色略微发黑(图 3D−3F)，Kaplan-Meier分析显示，感染组与噬菌体保护组(MOI=100、MOI=1和MOI=0.01)间的大蜡螟幼虫存活率呈现显著差异(P < 0.05，图 3G)。
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| 图 3 噬菌体pEC-N1203-2Af.1对大蜡螟幼虫体内抑菌效果 Figure 3 Bacteriostatic effect of phage pEC-N1203-2Af.1 on the larvae of Galleria mellonella. A: The control was injected with N1203-2Af and physiological saline. B: Blank control, injection of physiological saline alone. C: Injected with physiological saline and phage. D: Injected N1203-2Af and phage (MOI=100). E: Injected N1203-2Af and phage (MOI=1). F: Injected N1203-2Af and phage (MOI=0.01). G: Survival curve of the larva of the Galleria mellonella. |
2.6 噬菌体基因组特征分析
噬菌体pEC-N1203-2Af.1基因组全长77 334 bp，G+C含量为42.18%，耐药基因数据库和毒力基因数据库比对显示该噬菌体未携带耐药基因和毒力因子。通过BLASTn比对，该噬菌体与大肠杆菌噬菌体NJ01、172-1和O18-11同源片段一致性大于95%，其中Escherichia phage O18-11的同源片段一致性最高(NC_070985.1, query cover=83%, per. ident=96%)。上述大肠杆菌噬菌体均属于Caudoviricetes纲Kuravirus属成员，根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)分类标准，与现有噬菌体核酸序列超过95%归类为相同种，相似性大于50%归类为相同属[23]。因此认为噬菌体pEC-N1203-2Af.1属于Kuravirus属的一员，这与其C3形态特征一致。
根据功能基因预测，基因组包括4个已知的基因簇模块：(1) DNA复制与修饰模块，包括DNA解旋酶、DNA聚合酶、噬菌体整合酶、核酸外切酶和自体运输粘附蛋白等基因；(2) DNA包装模块，包括噬菌体末端酶大亚基和噬菌体末端酶小亚基等基因；(3) 裂解模块，包括裂解酶、穿孔素和裂解转糖苷酶等基因；(4) 结构蛋白，包括噬菌体尾纤维蛋白、噬菌体门蛋白、噬菌体底板、噬菌体衣壳和支架等基因(图 4A)。基于噬菌体pEC-N1203-2Af.1基因组与C3形态大肠杆菌噬菌体O18-11、NJ01、172-1、phiEco32，非大肠杆菌宿主C3形态噬菌体7-11、KSY1、Vb_PmiP-P59基因组比对，pEC-N1203-2Af.1与C3形态大肠杆菌噬菌体高度同源(query cover > 80%, per. ident > 95%)，与非大肠杆菌宿主菌C3形态噬菌体同源性较低(query cover < 5%, per. ident < 85%，图 4B)。
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| 图 4 噬菌体pEC-N1203-2Af.1基因组结构与同源性比较 Figure 4 Phage pEC-N1203-2Af.1 genome and homology comparison of phage pEC-N1203-2Af.1. A: Genome structure of pEC-N1203-2Af.1; B: Whole genome sequence comparison of phage pEC-N1203-2Af.1 with seven C3 phages. |
2.7 pEC-N1203-2Af.1功能基因组件特征分析
根据功能基因预测，决定pEC-N1203-2Af.1 C3样形态与结构相关蛋白基因主要分布于27 022−41 848 bp碱基片段中。该片段由两部分组成，第1部分为编码噬菌体头部蛋白的基因片段(38 281−41 848 bp)；其中CDS63和CDS64编码头部衣壳蛋白、CDS62编码Ig结构域样蛋白、CDS61编码连接蛋白，其中CDS63与Kuravirus属中所有C3形态大肠杆菌噬菌体同源性很高(query cover > 95%, per. ident > 85%)；第2部分(27 022−38 271 bp)编码噬菌体尾部蛋白和裂解相关蛋白，其中CDS60、CDS59、CDS55、CDS54和CDS53编码尾部蛋白，CDS57、CDS56则为分别编码穿孔素(holin)和内溶素(endolysin)的裂解酶同源序列。GenBank数据库中保存了24株携带该片段同源序列的噬菌体(query cover > 50%, per. ident > 80%)，这些噬菌体其中13株来源于亚洲，它们主要集中在东亚和南亚地区(中国、印度、日本和韩国)，8株来自于欧洲，3株来自于美洲(菌株信息NMDCX0000212储存在国家微生物科学数据中心，链接为https://nmdc.cn/resource/attachment/detail/NMDCX0000212)。本研究自东向西选取来自于东亚地区的IME267 (中国)、172-1 (中国)和vB_EcoP_YF01 (日本)，来自于中亚的MN03 (孟加拉)，来自于亚欧交界处的phiEco32 (格鲁尼亚），来自中欧的vB_EcoP-101114UKE3 (奥地利)，来自北欧的vB_EcoP_SU7 (瑞典)，来自于南美洲的vB_EcoP_EcoN5 (哥伦比亚)和来自于北美洲的Paul (美国)共9株代表性噬菌体的同源序列(图 5)进行比较，不同地区的长尾纤维蛋白显示出较低的同源性(query cover < 40%, per. ident < 85%)。
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| 图 5 噬菌体pEC-N1203-2Af.1结构蛋白和裂解蛋白相关片段与9个相似序列的比较 Figure 5 Comparison of phage pEC-N1203-2Af.1 structural protein and lytic protein-related fragments with 9 similar sequences. |
2.8 噬菌体全基因组系统发育树
基于GenBank数据库中记录的C3形态噬菌体核酸序列，全基因组系统发育树进一步证实噬菌体pEC-N1203-2Af.1与处于同一进化分支的Kuravirus属大肠杆菌噬菌体O18-11、LAMP、NJ01、172-1和MN05亲缘关系最为密切(图 6)除LAMP来自欧洲外，其余序列均来自亚洲，MN05分离自印度，O18-11、NJ01和172-1分离自中国。
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| 图 6 噬菌体pEC-N1203-2Af.1全基因组系统发育树 Figure 6 Phage pEC-N1203-2Af.1 whole-genome phylogenetic tree. |
3 讨论与结论
噬菌体是地球生物圈中含量最丰富的生物实体，几乎存在于各类生境中，它们在调节细菌种群和物质循环等方面的作用至关重要[24]。噬菌体能够特异性裂解其宿主菌，该特性令噬菌体在后抗生素时代逐渐成为治疗细菌感染的研究热点[25]。本研究以15株大肠杆菌为宿主菌，从污水样本中获得5株大肠杆菌噬菌体，其中pEC-1203-2Af.1属于Kuravirus属，为罕见的C3形态短尾噬菌体(图 1B)，全基因组测序结果和全基因组进化树显示噬菌体pEC-N1203-2Af.1与中国分离的Escherichia phage O18-011相似度最高(query cover=83%, per. ident=96%，图 6)。噬菌体pEC-M1203-2Af.1在4−37 ℃保持稳定活性，37 ℃时达到最高效价(图 2A)，pH值为4.0−10.0时保持稳定的活性，pH值为7.0时达到最高，但在70 ℃高温或pH值2.0、pH值12.0时失活(图 2B)。噬菌体是由蛋白质和核酸组成，大多数蛋白质会在60 ℃以上的温度下发生变性，因此仅有少数噬菌体能在高温、强酸和强碱的极端环境下存活[26]。噬菌体温度稳定性和蛋白质的折叠稳定性和蛋白质-蛋白质互作稳定性有关。噬菌体φX174am3突变体的耐高温可能是由突变区域的疏水性升高引起的[27]。Kuo Hao Lee等报道噬菌体对高温的耐受能力可能是它所在的高温环境导致衣壳蛋白的突变产生的，突变可能加强了衣壳蛋白五聚体之间的相互作用，从而稳定衣壳蛋白，使噬菌体更耐高温[28]。
噬菌体的体外抑菌试验显示，不同MOI条件下(MOI=100、MOI=1和MOI=0.01)，6 h内pEC-N1203-2Af.1抑菌效果良好，MOI=100组抑菌效果最好，在9-12 h时OD595显著低于对照组、MOI=1组和MOI=0.01组(P＜0.05)，且在24 h内OD595一直低于对照组(图 2D)；但3组噬菌体OD595数值在6 h后均出现升高现象，这可能是大肠杆菌N1203-2Af在噬菌体的压力下产生了抗性突变[29]。细菌在受到噬菌体攻击时，噬菌体受体基因发生突变使噬菌体受体的结构改变，导致了噬菌体无法识别受体，这是细菌对噬菌体产生抗性最简单最直接的方法[30]。Alita R. Burmeister等报道大肠杆菌通过突变外排泵蛋白和脂多糖基因从而对噬菌体U136B产生抗性[31]。细菌也可以通过掩盖或阻断细菌表面噬菌体受体来阻断噬菌体黏附，F质粒编码的蛋白TraT与大肠杆菌外膜孔蛋白A的表面暴露区域结合，使噬菌体无法与之结合[32]。噬菌体宿主防御系统是细菌预防或抑制噬菌体感染的分子途径，目前已知最广泛的噬菌体防御系统是限制修饰(restriction-modification, R-M)系统，它通过甲基转移酶在特定位点甲基化内源DNA，使内源DNA不被限制性核酸内切酶识别，而外源的未修饰的DNA会被限制性核酸内切酶能识别并将其切除[33]。噬菌体衍生的噬菌体防御系统是由于噬菌体与其他噬菌体竞争，而使宿主受益。噬菌体T5产生脂蛋白Lllp可以将自身的受体外膜蛋白FhuA隐藏，从而防止相同或密切相关的噬菌体的感染[34]。
大蜡螟幼虫保护试验显示，噬菌体安全性检验组大蜡螟幼虫在注射噬菌体48 h内未发生黑化和死亡(图 3C)，表明噬菌体具有良好的生物学安全性[35]。噬菌体保护组试验中MOI=100、MOI=1和MOI=0.01组大蜡螟幼虫存活率分别为100%、80%和70% (图 3D−3F)，治疗效果与噬菌体数量呈正相关性，表明高剂量噬菌体pEC-N1203-2Af.1应用于大肠杆菌N1203-2Af感染可能具有更好的治疗效果[36]。MOI=100条件下，大蜡螟幼虫虽然未出现死亡，但与空白对照组相比，3−6 h内大蜡螟幼虫体色略微黑化(图 3D)，6 h后黑化情况不再明显变化。据报道大蜡螟幼虫免疫系统工作会产生黑色素导致感染细菌的大蜡螟幼虫黑化[37]。结合一步生长曲线结果，噬菌体pEC-N1203-2Af.1潜伏期低于10 min (图 2C)，产生这种现象可能是由于感染大肠杆菌N1203-2Af的大蜡螟幼虫在注射噬菌体后，高剂量的噬菌体在大蜡螟幼虫体内快速大量增殖，短时间内消灭了大蜡螟幼虫体内的大部分细菌；MOI=100保护组大蜡螟幼虫在6 h出现略微黑化，可能是因为细菌的入侵启动了大蜡螟幼虫免疫系统工作，6 h后黑化情况不再明显变化可能是由于噬菌体消灭了大部分细菌后剩余的少量细菌也在6 h内被大蜡螟幼虫自身免疫系统清除；体外抑菌结果显示大肠杆菌N1203-2Af在噬菌体作用后6 h以后会产生抗性菌，而MOI=100噬菌体保护组在噬菌体和大蜡螟幼虫免疫系统的协同作用下很可能在6 h内就已经完全清除了大蜡螟幼虫体内的大肠杆菌，避免了抗性菌的产生，从而达到良好的大蜡螟幼虫保护效果。
CDS64编码头部支架蛋白，支架蛋白参与噬菌体的组装，在大多数噬菌体中，支架蛋白在组装完成后从衣壳中排出或被蛋白酶水解[38]。CDS63编码噬菌体pEC-N1203-Af.1的主要衣壳蛋白，衣壳蛋白构成噬菌体头部的二十面体结构，起到保护噬菌体DNA的作用[39]，CDS62被预测为Ig结构域蛋白，当前对其功能知之甚少。CDS61编码连接蛋白，即用于噬菌体的头部和尾部的蛋白结构[40]。CDS60、CDS59、CDS55、CDS54和CDS53编码噬菌体尾部蛋白，其中CDS64和CDS63分别编码长尾纤维的近端蛋白和远端蛋白，噬菌体通过长尾纤维附着在细菌表面，这种噬菌体与宿主菌的初始结合是可逆的被称为初级结合，初级结合的主要受体为细菌荚膜、脂多糖、磷壁酸和通道蛋白等[41]。CDS55编码短尾纤维蛋白，短尾纤维蛋白与细菌表面的次级受体结合是不可逆的，次级结合引起噬菌体向细菌注射DNA[42]。CDS54编码喷嘴蛋白，喷嘴蛋白可以运输噬菌体DNA进入宿主菌；CDS53编码尾针，尾针可以刺穿细菌外膜。C3形态大肠杆菌噬菌体尾部蛋白相互配合将噬菌体DNA注入到大肠杆菌中，据报道C3噬菌体首先通过6根长尾纤维蛋白远端三聚体与大肠杆菌发生初级结合，使噬菌体的长轴垂直于大肠杆菌外膜。此时短尾纤维和喷嘴蛋白的构象发生改变，短尾纤维向细胞膜旋转与细菌发生不可逆的次级结合，而喷嘴蛋白伸直与短尾纤维蛋白交替形成喷嘴。尾针从喷嘴中突出刺穿大肠杆菌外膜，随后尾针脱落，打开噬菌体尾部通道。喷射蛋白从头部释放，形成一条穿过周质的通道，噬菌体DNA通过喷嘴被喷射到大肠杆菌细胞质中[43]。编码裂解酶相关的CDS中，CDS57编码穿孔素(holin)，holin可以调节细胞裂解的时间，因此被称为“裂解时钟”[44]。CDS56编码内溶素(endolysin)，在holin-endolysin裂解途径中，holin在细胞膜上形成微米级的孔后，内溶素从孔中释放出来裂解肽聚糖致使细菌裂解[45]。
基于GenBank数据库的C3形态大肠杆菌噬菌体pEC-N1203-2Af.1全基因组分析表明，具有该形态的大肠杆菌噬菌体主要由亚洲地区分离报道，欧美地区则仅存在一小部分(图 6)。通过对比9条来自不同地区的C3形态噬菌体序列(携带与pEC-N1203-2Af.1结构与裂解蛋白相关基因结构同源片段，图 5)，结果显示所有C3形态大肠杆菌噬菌体的主要头部蛋白基因序列与CDS63基因高度同源(query cover > 95%, per. ident > 85%)，而长尾纤维蛋白基因序列同源性较低(query cover < 40%, per. ident < 85%)。一个可能的推测是，C3型大肠杆菌噬菌体头部细长的形态可能与CDS63编码的主要头部蛋白有关，Mohammadali等报道拥有细长的衣壳可能是一种进化趋势，虽然细长的衣壳需要更多的能量进行繁殖，但可以容纳更大的基因组，更大的基因组可以包含更多的可以对抗细菌噬菌体耐药系统的基因[46]。Marta Šiborová等的研究指出，C3形态的大肠杆菌噬菌体与大肠杆菌外膜受体的初始结合由长尾纤维介导，长尾纤维在其远端具有受体结合域[43]。因此，C3形态噬菌体在不同的环境压力下，与细菌受体结合相关的长尾纤维蛋白可能发生了适应环境的进化。
综上所述，本研究针对多重耐药大肠杆菌噬菌体pEC-N1203-2Af.1生物学特性及全基因组进行了系统分析，噬菌体pEC-N1203-Af.1具有罕见的C3形态，属于Kuravirus属，且具有较为稳定的生物学表型。pEC-N1203-2Af.1与其他10株不同地区C3形态大肠杆菌噬菌体长尾纤维蛋白编码基因序列相似性很低，由于长尾纤维蛋白与识别宿主菌株密切相关，因此噬菌体在应对不同地区的宿主菌株时，可能存在多个不同的适应环境进化方向。而不同地区的噬菌体编码主要头部蛋白的基因序列相似性超过80%，该基因可能是导致形成头部细长的C3型态噬菌体关键基因，明确该功能结构的生物学意义将为我们进一步研究并应用C3形态噬菌体提供重要科学依据。
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