2023, Vol. 63中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 燕霞, 苏小艳, 侯蓉, 刘颂蕊, 邓俊良. 2023
- YAN Xia, SU Xiaoyan, HOU Rong, LIU Songrui, DENG Junliang.
- 大熊猫源细菌耐药性研究进展
- Research progress in the antibiotic resistance of giant panda-derived bacteria
- 微生物学报, 63(3): 977-992
- Acta Microbiologica Sinica, 63(3): 977-992
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文章历史
- 收稿日期：2022-07-27
- 网络出版日期：2022-10-14
引用本文 |
2. 成都大熊猫繁育研究基地 四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室, 四川 成都 610081
2. Sichuan Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Wildlife, Chengdu Research Base of Giant Panda Breeding, Chengdu 610081, Sichuan, China
大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是隶属于食肉目、熊科、大熊猫亚科、大熊猫属的唯一哺乳动物，是生物多样性保护的旗舰物种，被誉为世界的“活化石”，具有重要的科学价值、社会价值和观赏价值。第4次大熊猫普查结果显示，全国野生大熊猫为1 864只[1]，截至2019年全球圈养大熊猫种群数量达600只[2]。随着大熊猫圈养种群的壮大以及大熊猫疾病研究的深入，细菌性疾病对大熊猫健康的危害也显露出来，尤其是肠道细菌性疾病在大熊猫圈养种群中的发病率明显高于其他系统疾病[3]。如肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)可引起大熊猫腹泻、粪便带黏液或血液等症状的肠炎、败血症和泌尿生殖系统感染[4]；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、β-溶血性链球菌(β-hemolytic Streptococcus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、A型魏氏梭菌(Clostridium welchii type A)均可导致大熊猫腹泻、肠炎等肠道疾病[5-6]。
大熊猫等野生动物的保护得到了越来越多的关注，尤其是圈养大熊猫在人工合理饲喂和定期驱虫等助益下，近10年来鲜有关于病原菌引起圈养大熊猫发病的报道，有研究提出，动物细菌性疾病的减少可归功于抗生素的大量使用，但是这也提高了某些肠道细菌广泛耐药的风险[7]。同时，耐药菌携带的耐药基因可通过质粒、整合子/基因盒、转座子等可移动元件在细菌间水平传播，导致或加重细菌的多重耐药性[7]，增加临床治疗难度。多重耐药菌和耐药基因已成为一种新型环境污染物，引发世界公共卫生问题。但是目前细菌耐药性研究多关注于人医临床、畜禽养殖、农田施肥等方面[8-10]，而关于大熊猫的耐药性研究报道相对较少，尤其是国外地区大熊猫源细菌耐药性的相关研究更是鲜有报道。本文对大熊猫源细菌的耐药表型、耐药基因、耐药机制及水平传播机制进行综述，旨在为大熊猫临床用药和耐药性防控提供参考依据，亦为后期科研人员深入研究大熊猫耐药提供一定的理论基础，进而助力大熊猫迁地保护。
1 大熊猫源细菌耐药表型的研究细菌的耐药表型指的是细菌对某些抗生素的临床耐药特征，细菌体外耐药表型主要通过药敏试验来分析，采用的技术方法主要有纸片扩散(kirby-bauer, K-B)法和琼脂稀释法，前者结果根据美国临床与实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)制定的标准进行判读；后者结果以抗菌药物的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)进行判读。大熊猫源细菌的药敏试验研究主要通过纸片扩散法开展[11-16]。目前大熊猫源细菌的耐药性研究主要为圈养大熊猫，分别来自中国大熊猫研究与保护中心(卧龙和雅安碧峰峡基地)、成都大熊猫繁育研究基地；较少来自千佛山、栗子坪等地的野生大熊猫[17]。样品采集来源多为大熊猫的粪便[11-16]，极少为雌性大熊猫的阴道分泌物[18]、生病大熊猫的尿液[19]及病死大熊猫的组织[20]。研究的细菌主要为大肠埃希菌(Escherichia coli，简称大肠杆菌)，少部分肠球菌[21] (Enterococcus)、克雷伯氏菌[11] (Klebsiella)、沙门氏菌(Salmonella)及铜绿假单胞菌等[13]。
对来自中国大熊猫研究与保护中心大熊猫粪便源大肠杆菌耐药性的相关文献进行概括总结发现(表 1)，从2006–2018年大熊猫源大肠杆菌主要对氨基糖苷类、四环素类和β-内酰胺类抗生素耐药，尤其是对氨基糖苷类和四环素类的耐药性维持较高水平并有上升趋势[11-16]；2008年大熊猫源大肠杆菌对磺胺类抗生素复方新诺明和磺胺异恶唑的耐药率均为0[12]，但是在2012年和2014年对复方新诺明和磺胺异恶唑均表现出一定的耐药性[14-15]；同时，2018年的大熊猫源大肠杆菌对氯霉素类抗生素氯霉素和氟苯尼考表现出较高耐药性，耐药率分别为31.0%和26.0%[16]，氯霉素已经被禁止用于动物，但是大熊猫有别于传统食用动物，氯霉素可用于治疗大熊猫小肠结肠炎耶尔森氏菌引起的感染等胃肠道疾病[22]，以及大熊猫角膜翳等眼科疾病[23]，故可导致细菌对氯霉素类抗生素的耐药性。尽管每次研究的分离菌株数量有所差异，但是通过以上研究仍可以发现，中国大熊猫研究与保护中心的大熊猫种群对氨基糖苷类和四环素类等抗生素已经表现出耐药性。
| Time | β-lactams | Tetracyclines | Aminoglycosides | Sulfonamides | Chloramphenicols | References | |||||||||||
| Penicillin | Amoxicillin | Vancomycin V | Tetracycline | Neomycin sulfate | Kanamycin | Streptomycin | Gentamicin | Compound sulfamethoxazole | Sulfamethoxazole | Chloramphenicol | Florfenicol | ||||||
| 2006 | 8.5 | 10.2 | 32.2 | 8.47 | [11] | ||||||||||||
| 2008 | 63.2 | 10.5 | 57.9 | 36.8 | 39.5 | 52.6 | 2.6 | 0 | 0 | [12] | |||||||
| 2009 | 13.6 | 6.9 | 15.3 | 10.2 | [13] | ||||||||||||
| 2012 | 26.7 | 55.6 | 1.1 | 2.2 | 11.1 | 18.9 | [14] | ||||||||||
| 2014 | 12.5 | 12.5 | 35.2 | 0 | 1.14 | 1.1 | 6.82 | 12.5 | [15] | ||||||||
| 2018 | 62.0 | 65.0 | 75.0 | 93.0 | 47.0 | 31.0 | 26.0 | [16] | |||||||||
对来自成都大熊猫繁育研究基地大熊猫粪便源大肠杆菌耐药性的相关文献进行概括总结发现(表 2)，大肠杆菌主要对β-内酰胺类和四环素类抗生素耐药，对氨曲南的耐药率从2014年的6.3%增加到2020年的86.9%，增幅较大；对链霉素、诺氟沙星和复方新诺明的耐药率有所下降[24–26]。
| Time | β-lactams | Aminoglycosides | Quinolones | Tetracyclines | Sulfonamides | References | ||||||||
| Ampicillin | Cefazolin | Aztreonam | Cefotaxime | Streptomycin | Norfloxacin | Tetracycline | Doxycycline | Compound sulfamethoxazole | ||||||
| 2014 | 67.7 | 51.0 | 6.3 | 10.4 | 13.5 | 19.8 | 69.8 | 27.1 | 42.7 | [24] | ||||
| 2015 | 58.0 | 68.0 | 6.0 | 8.0 | 14.0 | 8.0 | 36.0 | 30.0 | [25] | |||||
| 2020 | 69.1 | 8.3 | 86.9 | 9.5 | 9.5 | 7.1 | 48.8 | 61.9 | 17.9 | [26] | ||||
同时，我们前期对来自成都大熊猫繁育研究基地2018年和2019年大熊猫粪便源肺炎克雷伯菌的耐药表型也进行了分析，发现分离菌株对多西环素耐药率最高(15.2%)，对其他抗生素的耐药率较低(均低于10.0%)；与2018年相比，2019年分离的肺炎克雷伯菌对头孢噻肟、亚胺培南和阿奇霉素的耐药性显著增高(P < 0.05)，对头孢西丁耐药率显著降低(P < 0.05)；对四环素类及磺胺类抗生素耐药率升高，但无显著性差异(P > 0.05)[27]。进一步对大熊猫粪便源多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药表型分析发现，这些菌株主要对阿莫西林、强力霉素、氯霉素和复方甲氧苄啶耐药，耐药率分别为100.0%、86.7%、60.0%和60.0%[28]。大肠杆菌和肺炎克雷伯菌同属于肠杆菌科的革兰氏阴性杆菌，通过以上研究可以看出，成都大熊猫繁育研究基地大熊猫种群主要对β-内酰胺类和四环素类等抗生素耐药。
两个环境的大熊猫圈养种群对抗生素耐药的种类有所不同，可能与以下因素有关：(1) 不同场所的兽医临床抗菌药物使用习惯不同；(2) 不同大熊猫圈养种群平时所患细菌性疾病的种类不同；(3) 外源耐药基因的输入有所不同。2018年，Chen等[17]对野生大熊猫粪便源大肠杆菌的耐药性进行了研究，发现对链霉素的耐药性最高(61.0%)，其次是阿米卡星(30.0%)。总之，不管在大熊猫圈养种群还是野外种群都出现了抗生素耐药性，警示我们平时更加需要合理地临床用药，做好抗生素耐药性的监测工作。
2 大熊猫源细菌耐药基因的研究耐药基因是一段核苷酸序列(DNA片段)，可以在细菌的分裂和增殖过程中得到复制，从而使细菌表达出耐药性状，对抗生素表现出耐药性。大熊猫耐药基因的研究主要对大熊猫源大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、肠杆菌、葡萄球菌属、链球菌、铜绿假单胞菌、肠球菌和唾液乳杆菌等细菌开展，其中对大熊猫源大肠杆菌和肺炎克雷伯菌耐药基因的研究相较其他细菌更加深入，并且这2种细菌携带的耐药基因种类也更多；大熊猫源细菌携带的耐药基因可归属为β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类、多粘菌素类、MLSB和万古霉素类等大类，分别介导相应抗生素大类的表型耐药[11, 13, 16-17, 19-20, 24-25, 27-41] (表 3)。综上发现，大熊猫源细菌耐药基因的研究采用普通PCR、高通量荧光定量PCR法(high-throughput real-time quantitative PCR, HT-qPCR)、宏基因组测序和全基因组测序等技术。
| Giant panda-derived bacteria | Antibiotic resistant genes and classification | Role of antibiotic resistance genes | Mobile genetic elements | Integron and gene cassettes | References |
| Escherichia coli | β-lactams (ampC, CTX, CTX-M, CTX-M-28, CTX-M-55, OXA, SHV, TEM, TEM-1, TEM-34), tetracyclines (tetA, tetB, tetC, tetE, tetM, tetR), aminoglycosides (aac (6′)-Ib, aac(3)-IIa, aacC2, aacC4, aadA, ant(3′)-Ia, aphA3, aph(3′)IIa, StrB), sulfonamides (sul1, sul2, sul3), quinolones (qnrB), chloramphenicols (cmlA, cat1, floR), methylase (rmtA, rmtB) | Encoding resistance to β-lactams, tetracyclines, aminoglycosides, sulfonamides, quinolones and chloramphenicols | Conjugate plasmid (tbrC), transposon (tnpA/Tn21, merA), insert sequence (IISCR3/14, IS1133, ISEcp1, IS26, ISaba1, IS903), integrators (class Ⅰ, class Ⅱ) | intI1 (dfrA12-orfF-aadA2, dfrA12-aadA2, dfrA17-aadA5, dfrA27-aadA2, dfrA1-aadA1, aacA4-aadAl-catB2, aadA1, aadA2, aadA5, dfrA1, dfrA7), intI2 (dfrA1-sat2-aadA1) | [11, 13], [16-17], [19-20], [24-25], [29-34] |
| Klebsiella pneumoniae | β-lactams (ampC−02, ampC−04, ampC−06, ampC−07, ampC−09, ampC/blaDHA, CMY2-01, CMY2-02, CTX−M−01, CTX−M−02, CTX−M−03, CTX−M−04, CTX−M−05, CTX−M−06, GES, IMP-01, KPC, KPC2-13, MOX/CMY, NDM, NDM-1, OCH, OXA10-01, OXA10-02, OXA/OXA30, OXY, PER, SHV, SHV−01, SHV−02, TEM, VEB, VIM), tetracyclines (tetA, tetA−01, tetA−02, tetB−01, tetB−02, tetC−01, tetC−02, tetD, tetE, tetG−01, tetG−02, tetJ, tetM−01, tetPB−01), aminoglycosides (aac(6′)−Ib, aac(6′)−Iy, aac(6′)−Ib(aka aacA4)−01, aac(6′)−Ib(aka aacA4)−02, aac(6′)−Ib(aka aacA4)−03, aac(6′)I1, aac, aacC, aacC2, aac(6')I1, aadA1, aadA2−01, aadA2−02, aph, aph6ia, aph(2′)-ld-01, aphA1(aka kanR), aphA3−01, aphA3−02, ant(3′)-I), sulfonamides (sul1, sul2, sul3), quinolones (qnrA), Polymyxin (mcr1, mcr2), MLSB (erm, ermA, ermB, msrA-01), vancomycins (vanA, vanB−01, vanC1, vanC2/vanC3, vanHB, vanHD, vanSB, vanTC−02) | Encoding resistance to β-lactams, tetracyclines, aminoglycosides, sulfonamides, quinolones, polymyxin, MLSB and vancomycins | Conjugate plasmid (tbrC), Transposon (tnpU, tnpA/Tn21, merA, tnp513), Insert Sequence (ISCR1, ISCR3/14, ISEcp1, IS26, ISkpn7, ISaba1, IS903, IS613, IS3), Integrators (Class Ⅰ, Class Ⅱ, Class Ⅲ) |
intI1(dfrA12- orfF-aadA2, dfrA12-orfF) |
[27-28], [34-38] |
| Salmonella | Aminoglycosides (aph(3′)-IIa, ant(3′)-Ia), tetracyclines (tetC, tetM) | Encoding resistance to aminoglycoside and tetracycline | − | − | [13] |
| Enterobacteriaceae | β-lactams (CTX, TEM, SHV), tetracyclines (tetA), aminoglycosides (ant(3′)-Ia), sulfonamides (sul1) | Encoding resistance to β-lactams, tetracyclines, aminoglycosides | − | − | [34] |
| Staphylococcus | β-lactams (bla Z, mec A), tetracyclines (tet M, tet K), aminoglycosides (aac A-aph D, aph(3′)-IIa, ant(3′)-Ia), sulfonamides (sul1), chloramphenicols (floR), MLSB (ermA, ermB, ermC), vancomycins (Van A, Van B) | Encoding resistance to β-lactams, tetracyclines, aminoglycosides, sulfonamides, chloramphenicols, MLSB and vancomycins | − | − | [13, 39] |
| Streptococcus faecalis | Chloramphenicols (cmlA) | Encoding resistance to chloramphenicols | − | − | [13] |
| Pseudomonas aeruginosa | Tetracyclines (tetC), aminoglycosides (aph(3′)-Iia), sulfonamides (sul1, sul3), chloramphenicols (cmlA, cat1, floR) | Encoding resistance to aminoglycosides, sulfonamides and chloramphenicols | − | − | [13] |
| Enterococcus | Tetracyclines (tetL, tetM), aminoglycosides (aac(6′)-Ie-aph(2′)-Ia), macrolides (ermE) | Encoding resistance to tetracyclines, aminoglycosides, and macrolides | − | − | [34, 40] |
| Lactobacillus salivarius | Tetracyclines (tetM) | Encoding resistance to tetracyclines | − | − | [41] |
| − represents no relevant references or reports. | |||||
2.1 基于PCR技术对大熊猫源细菌耐药基因的研究
PCR是一种能够在生物体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术，通过设计已知序列的耐药基因引物可以直接检测细菌或环境样品中的耐药基因[42-43]。携带耐药基因是导致细菌对抗生素耐受的主要原因，耐药基因赋予了细菌对几乎所有主要抗生素类别的抗性。张安云等[11]早在2006年利用GenBank上提供的氨基糖苷类抗生素的各个耐药基因序列设计引物，在大熊猫粪便源革兰阴性肠杆菌分离菌株中检测到氨基糖苷类抗生素耐药基因aphA3、aadA、aacC2和aacC4，比较其耐药表型与基因型的符合率为76.3%；Zhang等[13]在30只大熊猫粪便源大肠杆菌、葡萄球菌和铜绿假单胞菌等多种分离菌株中发现多重耐药菌株(耐药表型)，通过四重PCR技术亦检测到菌株携带aph(3′)-Ⅱa、cmlA、ant(3′′)-Ⅰa、tetC和sul1等多种耐药基因(基因型)；高彤彤[24]在大熊猫粪便源大肠杆菌中检测到产超广谱β-内酰胺酶菌株(耐药表型)，通过设计β-内酰胺类耐药基因，检测到菌株携带TEM和CTX-M等耐药基因(基因型)，表明在大熊猫圈养种群中，产超广谱β-内酰胺酶的流行基因型可能是TEM和CTX-M。理论上分离菌株的耐药表型和基因型是一一对应的，但是也存在耐药基因不表达或数量太多无法一一研究的情况，因此，存在耐药表型和基因型符合率不高的问题。通过PCR技术可以有针对性地检测菌株的耐药基因，通过结合菌株耐药表型，能更好地分析菌株的临床抗生素耐药情况以及耐药机制。但是普通PCR技术存在检测通量小，工作量大，且需要测序进一步分析检测结果等缺点[44]，而HT-qPCR具有通量高、灵敏、快速等优点，可以对菌株携带的耐药基因进行大量、快速的量化检测，了解掌握耐药基因的全面概况[45]。我们采用HT-qPCR技术检测成都大熊猫繁育研究基地2018–2019年分离的178株大熊猫源肺炎克雷伯菌的227种耐药基因，共检测出106种耐药基因，其中多重耐药基因和β-内酰胺类耐药基因含量最高，分别为33.2%和26.6%[27]；同时我们进一步运用HT-qPCR技术检测成都大熊猫繁育研究基地2020年分离的30株大熊猫源多重耐药肺炎克雷伯菌的82种耐药基因，共检测出50种不同类型、共包括671个耐药基因，丰度排名前十位的耐药基因为：vanTC-02、aacC、CTX-M-04、SHV-01、SHV-02、ampC-04、OXY、tetD、TEM和tetA-02，介导了一系列抗生素的耐药性，如β-内酰胺类、氨基糖苷类、万古霉素类、四环素类和磺胺类抗生素的耐药性，其中大部分耐药基因归属于β-内酰胺类抗生素[28]。这也与成都大熊猫繁育研究基地大熊猫种群主要对β-内酰胺类抗生素耐药的表型研究相符合[24-26]。虽然采用PCR技术开展大熊猫耐药基因研究具有检测目标明确、能与耐药表型对应分析的优点，但是，无论是普通PCR还是HT-qPCR都须以细菌培养为基础，并且还局限于对已知序列的耐药基因进行检测，不能发现新的耐药基因。
2.2 基于测序技术对大熊猫源细菌耐药基因的研究全基因组测序是对未知基因组序列的物种进行个体的基因组测序，细菌则包括染色体和所有质粒的遗传信息和框架。通过全基因组测序能掌握细菌的所有耐药基因信息，包括碱基组成、亚型种类和数量、所在位置及基因环境。2019年邓雯文等[19]在泌尿生殖道感染出现潜血的大熊猫尿液中分离出一株致病性大肠杆菌(Escherichia coli CCHTP)，对该菌株进行全基因组测序，发现其携带了包括14大类、共161个抗生素耐药基因，涉及介导糖肽类抗生素(万古霉素)耐药的vanTG/TC/RI等10个耐药基因、介导多肽类抗生素多肽类(多粘菌素)抗生素耐药的mcr-3、PmrF/E/C等9个耐药基因和介导四环素类抗生素(四环素)耐药的tetT/B(60)/A(48)/34等耐药基因。运用全基因组测序分别对大熊猫源大肠埃希菌CCHTP、大肠埃希菌ECGP15、鲍曼不动杆菌AB53、肺炎克雷伯菌KPGP110和铜绿假单胞菌PA212的基因组进行分析，发现以上5株菌携带了大量的耐药基因，主要介导了糖肽类、多肽类和四环素类抗生素耐药[46]。运用全基因组测序研究细菌耐药性可以在分析耐药基因的基础上进一步对其耐药机制和水平传播机制进行探讨，但也存在需要在菌株纯培养基础上进行的缺点。
宏基因组测序则是不需要细菌培养，通过直接提取环境样品的DNA并进行高通量测序、序列组装和基因注释之后，与耐药基因数据库比对，达到对样品中所有微生物宏基因组的信息进行集合，从而定性定量分析的目的。运用宏基因组测序不仅可以掌握大熊猫群体整体的耐药基因携带情况，还可以探讨年龄、生活环境等因素对大熊猫源菌群携带耐药基因的影响。李才武等[46]比较不同年龄大熊猫肠道细菌耐药基因携带情况，结果表明耐药基因在大熊猫粪便样本中高度富集，涉及了喹诺酮类和β-内酰胺类等抗生素耐药基因；对丰度前30的耐药基因比较发现，幼年、成年和老年大熊猫各有优势耐药基因，但总体上表现为幼年大熊猫高于成年和老年。2021年Mustafa等[47]对中国大熊猫保护研究中心的大熊猫肠道耐药基因进行研究，发现大熊猫肠道菌群中广泛分布抗生素耐药基因，大熊猫的肠道是新型耐药基因和抗生素生物合成的储存库，并且在幼年大熊猫肠道中耐药基因的丰度显著高于成年和老年大熊猫。Hu等[48]运用宏基因组分析了大熊猫野生种群(秦岭、邛崃山和小香岭)和圈养种群(雅安和成都)中抗生素耐药基因的地理分布，发现圈养对大熊猫耐药基因的组成有影响，与其他野生和圈养种群研究相比，秦岭种群肠道菌群携带的耐药基因表现出极大的差异，主要表现在梭菌和万古霉素耐药基因的差异。综上可知，不同生境下不同年龄大熊猫的耐药性有所区别。
3 大熊猫源细菌耐药机制和水平传播机制的研究细菌主要通过表达药物灭活酶或钝化酶使抗生素失活、外膜通透性的改变使抗生素无法渗透入细菌内、主动外排系统主动泵出抗菌药物和改变抗生素作用的靶点等生化机制对抗生素产生耐药。目前关于大熊猫源细菌的耐药机制的研究报道较少。李才武等[46]通过宏基因组测序发现耐药基因在大熊猫粪便样本中高度富集，其中检出率最高的耐药基因主要为外排泵系统，尤其是耐药结节细胞分化(resistance-nodulation-cell division, RND)家族抗生素外排泵，揭示其可能为大熊猫肠道细菌耐药的主要机制。我们前期对178株大熊猫源肺炎克雷伯菌携带的耐药基因进行分析，发现外排泵(42.0%)、抗生素失活(41.8%)和改变作用靶位(16.2%)为其主要的耐药机制[27]。2017年刘晓强等[49]报道大熊猫源大肠埃希菌对新型动物专用氟喹诺酮类药物普多沙星的耐药机制主要由靶基因的点突变和外排泵基因的过量表达所导致。2022年Wang等[34]对一株耐16种抗生素的大熊猫粪便源肺炎克雷伯菌携带的耐药基因进行预测，发现其大部分耐药基因是外排泵基因。综上可知，目前大熊猫源细菌的耐药机制主要是主动外排。
耐药菌和耐药基因之所以成为一种新型的环境污染物，是因为耐药菌携带的耐药基因可借助质粒、转座子(如insertion sequence，IS序列)、整合子/基因盒系统、噬菌体以及抗性岛等可移动元件在不同细菌间以及环境中进行水平转移，从而使敏感菌获得耐药性[50]。2012年余丛等[51]在大熊猫粪便源大肠杆菌的抗性质粒序列中预测到转座酶基因。2015年闫国栋等[25]对来自成都大熊猫繁育研究基地的50株大熊猫粪便源大肠杆菌携带的整合子-基因盒情况开展了研究，发现有15株(30.0%)携带Ⅰ类整合子，并且其中6株含有基因盒，主要介导氨基糖苷类和磺胺-甲氧苄啶耐药，未发现Ⅱ类和Ⅲ类整合子。2018年Zou等[16]对来自中国大熊猫研究与保护中心89株大熊猫粪便源大肠杆菌携带的整合子-基因盒情况开展了研究，发现47.0%的菌株携带Ⅰ类整合子，8.0%菌株携带Ⅱ类整合子，部分含有耐药基因盒，未发现Ⅲ类整合子。2020年Zhu等[26]对来自成都大熊猫繁育研究基地的84株大熊猫粪便源大肠杆菌携带的转座子、插入序列和整合子-基因盒情况等可移动元件开展了研究，共检测到11种可移动元件，其中转座子遗传标记merA (54/84, 64.3%)的检出率最高，同时分别有32.0%和4.0%的分离株携带Ⅰ类和Ⅱ类整合子，部分含有耐药基因盒，未发现Ⅲ类整合子。我们前期对30株大熊猫粪便源多重耐药肺炎克雷伯菌研究发现这些菌株携带了13种可移动元件，其中插入序列遗传标记IS26 (96.7%, 29/30)的检出率最高，Ⅰ类整合子的检出率为96.7%，且含有耐药基因盒，未检测到Ⅱ类和Ⅲ类整合子[28]。Wang等[34]对一株大熊猫粪便源肺炎克雷伯菌进行全基因组测序，发现其携带的耐药基因blaTEM-1与blaCTX-M-3相邻，其耐药性区域的两侧是各种IS序列，并且菌株含有Ⅰ类整合子基因盒。2016年万莉[29]通过R质粒结合转移试验发现大熊猫粪便源大肠杆菌的R质粒上的抗四环素和产β-内酰胺酶的耐药基因可以转移至大肠杆菌J53，进行耐药基因的水平传播。综上所述，大熊猫源细菌中已经存在大量多样的可移动元件，包括接合性质粒、转座子、拆入序列和整合子-基因盒(表 3)，存在水平转移的威胁。其中整合酶的类型主要为Ⅰ型整合子，较少为Ⅱ型和Ⅲ型，基因盒的研究主要对Ⅰ型和Ⅱ型整合子开展，组成主要有dfrA12-orfF-aadA2和dfrA1-sat2-aadA1 (表 3)。造成这种结果的原因可能是大熊猫源细菌的耐药性研究主要集中在革兰氏阴性菌，而在革兰氏阴性菌中，Ⅰ类整合子比Ⅱ类或Ⅲ类更普遍；且在动物和临床样本中Ⅲ类整合子很少见[52–54]。
4 大熊猫源细菌与其他物种来源细菌的耐药性比较整体上大熊猫的耐药性与其他物种一样——不同年龄组的耐药性有所不同。通过宏基因组测序对幼年、成年和老年大熊猫粪便样本中耐药基因的亚型和丰度分析发现，幼年大熊猫携带的耐药基因亚型的丰度是高于成年和老年大熊猫的[46-47]；肖延光等[55]对分离自不同年龄段猪源链球菌的耐药性进行了比较发现，5周龄仔猪源分离菌株已经具有较高较全面的耐药性，但对头孢吡肟、氟苯尼考等抗生素的耐药性低于20周龄猪；岑敏等[56]对不同年龄段儿童肺炎克雷伯菌的耐药性分析发现，0–3岁年龄段儿童分离的肺炎克雷伯菌对常见抗菌药物的耐药率大于3–7岁年龄段儿童。以上研究可以看出，不同年龄个体的耐药性以及对某一特种抗生素的耐药性有所不同，临床用药须考虑年龄因素。同时，幼龄动物免疫力较弱，更易受到细菌性疾病的威胁，造成抗生素使用频率增大。大熊猫产仔难，幼仔存活率不高，日常护理更需科学和精心，以增强其免疫力，抵抗细菌性疾病的危害，降低抗生素耐药性。
目前大熊猫源大肠杆菌的耐药性研究较多，将其与其他物种源大肠杆菌的耐药性进行对比发现，大熊猫源大肠杆菌的耐药性相较于其他野生动物更高、相较于食品动物源更低。大熊猫源大肠杆菌对氨苄西林的耐药率为58.0%–69.1%、四环素耐药率为13.6%–69.8%、阿莫西林耐药率为12.5–26.7%、氨曲南2020年耐药率已达86.9% (表 1和表 2)；丹顶鹤源大肠杆菌菌株对氨苄西林的耐药率为57.5%，但对氨曲南、阿莫西林敏感[57]；野生禽类(野鸽，野鸭，麻雀和无斑点燕八哥)源大肠杆菌菌株对四环素、氨苄西林的耐药率分别为21.3%和19.5%[58]；王娟等[59]对分离自山东、内蒙古、山西、重庆4个省(市/自治区)的猪源、鸡源大肠杆菌的耐药性检测发现，对四环素耐药率高达92.5%，耐药率高于70.0%的有5种药物；林居纯等[60]对四川地区不同养殖场和屠宰场中健康鸡、猪、鸭肛拭子及肠道内容物分离的大肠杆菌的耐药性检测发现，对氨苄西林、四环素等抗生素的耐药率均在80.0%以上。推测出现以上差异的原因一方面是大熊猫作为野生动物的一种，食性单一，平时抗生素使用严格，故比食品动物源大肠杆菌的耐药性低；另一方面大熊猫相较于其他野生动物与人的关系更为紧密，有更多机会接触抗生素，故大熊猫源大肠杆菌的耐药性高于其他野生动物。
近年来，我们课题组对大熊猫源肺炎克雷伯菌的耐药性开展了研究发现，大熊猫源肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类和磺胺类等常见37种抗生素的耐药率低于10.0%[27]；郭蕊等[61]对貂源肺炎克雷伯菌的耐药性进行检测，发现对阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、新霉素、氟苯尼考、强力霉素、磺胺二甲氧嘧啶7种药物的耐药率为59.5%–100.0%；解秀梅等[62]对西宁地区宠物犬源肺炎克雷伯菌的耐药性进行研究，发现对阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、新霉素、氟苯尼考、强力霉素、大观霉素、磺胺二甲氧嘧啶8种药物耐药率均在61.0%以上；尧荣凤等[63]对人源肺炎克雷伯菌的耐药性分析发现，分离株对亚胺培南和美罗培南的耐药率从2013年的5.1%和6.2%上升至2019年的28.6%和29.2%，并且产碳青霉烯酶菌株对多数抗菌药物的耐药率大于80.0%。以上研究可以看出，大熊猫源肺炎克雷伯菌的抗生素耐药性整体上是比较低的，表明大熊猫平时临床用药比较合理。但是多重耐药肺炎克雷伯菌[28]、产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌[36, 38]和产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌[37]菌株已在大熊猫种群中出现，警示我们须进一步加强大熊猫耐药性的监测，做到合理用药；并加强大熊猫耐药菌的来源与传播机制相关研究，以防止大熊猫源细菌耐药性的扩散和加重。
5 小结与展望综上分析，大熊猫种群中已经出现了耐药菌，并且部分菌株还表现出多重耐药性，耐药机制主要为主动外排。比较大熊猫圈养种群和野生种群耐药性发现，大熊猫的生存环境和方式等对其影响相对较小[21]，但对某些大类抗生素的耐药性存在差异，大熊猫圈养种群对四环素类和大环内酯类的耐药性高于野生种群[48]。同时，耐药菌携带的耐药基因可通过质粒、整合子/基因盒等可移动元件进行水平传播从而加快细菌耐药性的传播。但目前大熊猫源耐药菌的研究主要集中在粪便源、革兰氏阴性菌(多为大肠杆菌)，而关于大熊猫源革兰氏阳性菌耐药性、耐药菌的主要来源与传播途径及耐药菌的危害尚不清楚，因此，在未来的研究中可从以下几点进一步探究：(1) 大熊猫源革兰氏阳性菌耐药性的调查研究；(2) 健康大熊猫粪便源细菌多为条件致病菌，可从大熊猫病料分离致病菌，开展其耐药性的调查研究；(3) 大熊猫源耐药菌的致病性，以及耐药性与毒力强弱的相关性；(4) 对大熊猫-环境-人(饲养员)链中细菌耐药性和可移动元件等开展调查，以掌握大熊猫细菌耐药性的来源与传播机制；(5) 研发新药或者新型抗菌剂(如噬菌体、抗菌肽)，以减少抗生素的使用频率；(6) 通过基因敲除、质粒消除等分子手段研究大熊猫源细菌的耐药机制，以控制大熊猫源耐药性细菌的持续产生和传播。同时考虑到我们虽然无法根除细菌耐药性，但可以通过减少对耐药性的选择压力进而减少耐药菌基因的产生与传播。因此，平时须加强大熊猫耐药性监测，以促进临床抗生素使用进一步科学化、规范化；同时合理的大熊猫饲养管理方案，尤其是对幼年大熊猫的科学护理，可增强大熊猫对疾病的抵抗力，从而减少疾病的发生，降低抗生素使用频率。通过上述的举措可进一步指导大熊猫源耐药菌的有效防控。
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