微生物代谢产生的脂肽是具有代表性的生物表面活性剂，国内外报道的主要有表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、丰原素(fengycin和plipastatin同时期不同实验室发现，结构相似)和kurstakin这4种结构类似物^[1]。在4种表面活性剂中表面活性素的表面活性突出^[2]。生物表面活性剂主要由细菌或酵母代谢产生^[3]，包括糖脂、脂肽、多糖-蛋白质复合物、磷脂、脂肪酸和中性脂质等^[4]。生物表面活性剂可利于分解环境中的污染物，如石油和农药残留物等，生物表面活性剂分解代谢的产物对自然环境是无害的，并且生物表面活性剂对环境具有一定的修护作用^[3]。脂肽类生物表面活性剂具有代表性的产出菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)^[5]，该菌广泛存在于自然界中，对自然界中的动植物的危害微乎其微^[6]。有研究表明生物表面活性剂的乳化性可以降解石油^[7]，因此在原油开采工业上对提高石油采收率有很重要的作用^[8]。随着工业技术的不断创新与发展，生物表面活性剂在各大领域的应用也越来越广泛，在工业、农业、医疗和化妆品等领域均有应用^[9-14]。与化学合成活性剂相比，生物表面活性剂在结构上具有多样的特点，低毒性，利于自然环境的可持续发展^[14]。

天然的surfactin是由13−15个碳原子构成的β-羟基脂肪酸链和七肽组成的环状脂肽的混合物^[15-17]。生物表面蛋白类似物有20多种脂肽，基本是由LLDLLDL的手性氨基酸构成的七肽^[1]。表面活性蛋白是具有亲水性和疏水性的两亲性分子，脂肪酸链与极性分子相连，不仅能增加化合物的溶解度，而且能增加生物的利用率，也能降低不同状态物质的表面张力或者界面张力^[18]。

本文利用产物溶血性对土壤样本进行初步筛选^[15]。溶血性已经成为初筛生物表面活性剂的有效标准，但并非溶血性是表面活性剂的特有性质，一些蛋白酶类也有溶血性，溶血也并不是表面活性剂的唯一特性^[17]。表面活性剂带有负电荷，不会直接与酸碱指示剂溴百里酚蓝(bromothymol blue, BTB)结合反应，带阳离子的氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride, CPC)可以和表面活性素强烈结合反应，在氯化十六烷基吡啶和溴百里酚蓝(CPC-BTB)的混合溶液中加入表面活性素可与氯化十六烷基吡啶和溴百里酚蓝的复合物竞争氯化十六烷基吡啶，从而释放出溴百里酚蓝，这个过程中有明显的颜色变化，从黄绿色变成亮蓝色^[19]。本文结合溶血筛选和氯化十六烷基吡啶加溴百里酚蓝混合溶液的显色反应这两种方法，高效快速的从土壤中筛选出较高产表面活性素的野生型菌株。本研究将为高效及高通量筛选野生型生产表面活性素菌株提供一定的理论基础和一定的技术支持。

1 材料与方法 1.1 样品、培养基和仪器 1.1.1 实验样品

用于分离筛选产生物表面活性剂的土壤样品采集于广东省佛山市某加油站，该样品受到原油长时间浸染。

1.1.2 培养基

种子培养基(LB液体培养基，g/L)：NaCl 10，酵母提取物5，胰蛋白胨10，pH调至7.2。

LB固体培养基(g/L)：胰蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉5，琼脂粉15。

血琼脂平板：LB固体培养基中添加5%的无菌脱纤维羊血(广州鸿泉生物科技有限公司)。

营养肉汤培养基(nutritious broth, NB培养基)，广东环凯微生物科技有限公司。

发酵培养基(Landy培养基，g/L)：葡萄糖20，l-谷氨酸5，MgSO₄ 0.5，KCl 0.5，KH₂PO₄ 1，FeSO₄ 7H₂O 0.000 15，MnSO₄ H₂O 0.005，CuSO₄ 5H₂O 0.000 16，增加1 g/L的酵母粉(作为生长因子)，调pH至7.0 (试剂均购自上海麦克林生化科技有限公司)。

1.1.3 仪器和设备

ZQZY-78CE振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；Vir Tis Bench Top Pro冷冻干燥机、SP Scientific、JM50-Plus真空离心浓缩仪，北京吉艾姆科技有限公司；傅立叶变换红外光谱仪Bruker/TENSORII，BRUKER公司；Eppendorf Centrifuge 5804R离心机、Bio-Rad T100 PCR仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；L-8900氨基酸分析仪，日立高新技术(上海)国际贸易有限公司；液相色谱-质谱联用赛默飞-U3000，安捷伦科技有限公司。

1.2 生物表面活性剂菌株的筛选 1.2.1 样本处理

对土壤样本采取2套方案处理样品：一是直接取适量土壤样品用2 mL无菌0.9% NaCl溶液充分振荡，去除上层漂浮的杂质，取100 µL溶有土壤样品的上清液，于含有900 µL 0.9% NaCl溶液的1.5 mL EP管中充分混匀，记为10⁰，再取10⁰样液100 µL于900 µL 0.9% NaCl溶液混匀，记为10⁻¹，依次按体积稀释，直到10⁻⁷，然后取100 µL梯度稀释的样液于LB固体平板上均匀涂布，置于37 ℃恒温培养箱培养至有单菌落长出。将单菌落挑取到含有NB半固体培养基的96孔板中37 ℃恒温培养箱培养待有明显菌落长出，转移到4 ℃冰箱保存。二是取适量样本土壤充分振荡使其溶于LB中，再将样品置于80 ℃水浴加热20 min，目的是除去大肠杆菌等非芽孢菌的干扰。然后梯度稀释，涂布到LB平板上，重复上述操作，保存单菌落于96孔板中，待后续用于进一步的筛选。

1.2.2 血平板与氯化十六烷基吡啶和溴百里酚蓝显色反应筛选

将分离保存的菌落转接到含有5%无菌脱纤维绵羊血的LB琼脂平板上，37 ℃恒温培养12 h左右观察溶血圈出现的情况。将有溶血圈的菌株在96孔板对应的位置上挑取，集中在新的NB半固体培养基上，再一次培养保存。将具有溶血圈的菌株转接到含有2 mL LB液体培养基的96深孔板中，在37 ℃摇床180 r/min的条件下发酵培养24 h，发酵液在常温下使用10 000×g离心15 min，收集无细胞的上清液并保存于4 ℃冰箱，用于氯化十六烷基吡啶和溴百里酚蓝显色反应(溶血实验与显色反应可同时进行)。按照文献[19]所述进行氯化十六烷基吡啶和溴百里酚蓝显色反应，0.1 mol/L PBS (NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, pH 8.0)、0.2 mmol/L氯化十六烷基吡啶和0.2 mmol/L溴百里酚蓝三者等量混合，取800 µL氯化十六烷基吡啶和溴百里酚蓝混合溶液与100 µL发酵液无细胞上清在48孔板中常温下反应5 min，使用酶标仪测得发酵液无细胞上清在600 nm处的吸光值，相互对照并选择值相对较高者单独保存，为后续实验做准备。

1.2.3 生理生化实验

经过多次实验筛选，选定一株编号为SX-20的表面活性较明显菌株，为确定其菌种属进行如下实验：高倍显微镜下观察形态；革兰氏染色试剂盒(广东环凯微生物科技有限公司)，按照试剂盒的说明书进行操作，对菌株进行革兰氏染色；API实验，根据试剂盒的说明书进行操作，使用Bacillus subtilis ATCC 21332为对照菌株。在培养长有单菌落的平板上挑取适量的菌体，按要求加入对应的反应孔。37 ℃恒温培养箱中培养过夜，根据菌液反应颜色变化对照结果判读表，读出并记录阴阳性，并在系统中进行比对，确定菌株的种属关系。

1.2.4 16S rRNA基因的体外扩增、测序和系统发育树

挑取适量待提取总DNA菌株的单菌落，混入1 mL的无菌去离子水中，采用珠磨法使其细胞壁细胞膜充分破碎，暴露出核酸，利用通用引物1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′；27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，在热启动Taq聚合酶的作用下，扩增目的菌株的16S rRNA基因。热循环程序如下：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s，56 ℃，30 s，72 ℃，15 s；循环34次，72 ℃，5 min。将扩增出目的片段的PCR产物与质粒载体pUC19在连接酶的作用下16 ℃孵育过夜，将连接完成的质粒转化到大肠杆菌中，利用含氨苄西林(ampicillin, Amp)、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)、β-半乳糖苷酶(X-Gal)的琼脂平板进行蓝白斑筛选，选取白斑菌落，利用通用引物M13F：5′-TGTAAAACGACGGC CAGT-3′；M13R：5′-AGCGGATAACAATTTCA CACAGGA-3′进行菌落PCR，然后进行测序，菌株的16S rRNA基因序列上传到EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/)与模式菌株进行比对分析。然后用MEGA X软件，采用临近法计算1 000次比对重复验证，并构建进化树。

1.3 生物表面活性剂的发酵

将甘油保存的菌株于LB平板上划线37 ℃恒温过夜培养，挑取单菌落转接到适量的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min制成种子液，种子液的OD₆₀₀值在1左右。根据Landy等^[20]的研究，采用改进过的Landy培养基，100 mL无菌培养基接种5 mL的种子液(5%，体积分数)，并在37 ℃、180 r/min条件下培养36 h。

1.4 生物表面活性剂的提取

对表面活性蛋白的提取采用酸沉淀和甲醇萃取的方法^[13]。液体发酵培养36 h后的发酵液，在常温下10 000×g的高速离心机中离心15 min，去除细菌细胞，收集无细胞上清液(cell free supernatant, CFS)，使用6 mol/L HCl调节发酵上清的pH，使其最终的pH约为2.0，然后置于4 ℃冰箱过夜沉淀。将酸沉淀后的发酵液在4 ℃ 10 000×g的条件下离心10 min，以获取沉淀物，收集沉淀物加入适量的无菌去离子水溶解，并用11 mol/L NaOH溶液将pH调至中性，然后过夜冻干。冻干后的提取样加入适量的甲醇溶液回溶，振荡使其充分溶解，然后在常温下10 000×g离心10 min，去除沉淀，收集上清液，并过0.22 µm的有机相滤膜，将过膜后的溶有表面蛋白的甲醇溶液在45 ℃下真空旋转蒸发干燥，收集表面活性蛋白粗提取物样品，待后续验证实验使用。

1.5 抑菌实验

为验证产物的抑菌性，选取大肠杆菌(Escherichia coli)、金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痤疮丙酸杆菌IV (Propionibacterium acnes Ⅳ) (菌种均为本实验室所保存)作为指示菌株。采取平板打孔法进行抑菌实验，抑菌样品浓度为2 g/L，上样量为50 µL。大肠杆菌和金色葡萄球菌在37 ℃恒温培养箱培养24 h，观察抑菌圈大小。痤疮丙酸杆菌属于厌氧菌，在37 ℃恒温厌氧培养箱中培养48 h，再观察记录抑菌圈。用已知的产表面活性蛋白的菌株枯草芽孢杆菌ATCC 21332 (Bacillus subtilis ATCC 21332)作阳性对照，溶质无菌水做阴性对照。

1.6 傅里叶变换红外质谱

为了推断筛选得到菌株产物中的化学键和官能团的整体性质，将经过酸沉淀甲醇萃取，真空旋转蒸发干燥后收集到的粗产物，使用傅里叶变换红外光谱对产物进行分析。取提前干燥的溴化钾(KBr) 100 mg和1 mg产物充分研磨，使粗产物与溴化钾完全混合磨细后负载加压30 s制成半透明的压片，在400 cm⁻¹到4 000 cm⁻¹之间收集分辨率为2 cm⁻¹的FTIR的光谱数据，并进行分析。

1.7 氨基酸分析

关于获取产物中所含的氨基酸种类及含量，进行了氨基酸种类分析，使用耐高温的专用反应试剂瓶，取浓度为2 mg/mL的样品适量，按体积比1:1与12 mol/L HCl混合，使最终pH为6，在油浴锅中120 ℃反应2 h，油浴结束后，开盖在80 ℃的恒温沙子中蒸干水分，样品进行预处理后，使用氨基酸分析仪进行分析，并使用氨基酸标准品作为对照。

1.8 LC-MS分析

将筛选所得菌株SX-20的发酵产物经过提取旋转蒸发干燥，液相色谱-气质色谱联用(liquid chromatograph-mass spectrometer, LC-MS)对其粗产物进行结构分析。淡黄色粉末状样品用无菌去离子水溶解，过0.22 µm的水相滤膜，制成样品待使用。气相色谱电喷雾电压设置最高为5 000 V，毛细管温度设置为320 ℃，鞘气(sheath gas) 45.00 arb，辅助气体(aux gas) 20.00 arb，最大喷雾电流(max spray current) 80.00 uA，液相色谱-大气压化学电离串联四极杆质谱正离子监测模式，液相分析柱为ZORBAX SB-CN 4.6 mm×75 mm，3.5 µm，流动相A：甲醇、B：0.1%甲酸水，柱温30 ℃、流速0.4 mL/min，进样20 μL，得到LC、MS1、MS2图谱。

2 结果与分析 2.1 筛选结果及菌株鉴定

经过初步筛选和氯化十六烷基吡啶和溴百里酚蓝显色反应复筛，以及产物特性的初步筛选，从原油污染的土壤中挑取的1 000多株菌株中，挑选出表现较好溶血性和显色值较高的单菌落，从这些株菌中选择其中表现较其他菌株更好的，最后选定一株，编号为SX-20。

对SX-20生理生化的实验结果显示，该菌的单菌落周围不规则，表面粗糙，呈白色不透明，为革兰氏阳性菌，在光学显微镜10×100倍下呈柱状或者短棒状，芽孢位于菌体中央或稍偏，如图 1A、1B所示；API 50 CH及20E实验结果显示该菌与Bacillus subtilis的相似度为99.7%，结果如表 1所示。提取菌株SX-20的16S rRNA测序，与Bacillus subtilis NCIB 3 610 (T)的相似度为99.80%，得到图 2所示的进化树，结果显示菌株SX-20与Bacillus subtilis NCIB 3 610 (T)在同一分支上，结合生理生化实验结果^[21]可鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。

2.2 筛选菌株发酵产物的抑菌作用

筛选所得菌株SX-20的产物，对大肠杆菌、金色葡糖球菌、痤疮丙酸杆菌具有抑制生长的作用，对痤疮丙酸杆菌的抑制作用在之前的报道中几乎没有。抑菌圈如图 3所示，用溶剂无菌去离子水做阴性对照，已知产脂肽的菌株Bacillus subtilis ATCC 21332做阳性对照。图 3A为粗产物对大肠杆菌的抑制效果，图 3B为粗产物对金色葡萄球菌的抑制效果，图中阳性对照Bacillus subtilis ATCC 21332与实验菌株SX-20对应的孔均有明显的抑菌圈，阴性对照没有抑菌圈。图 3C是SX-20粗产物对痤疮丙酸杆菌Ⅳ的抑制效果，在无氧条件下20 µL粗产物对痤疮丙酸杆菌Ⅳ具有明显的抑制效果(抑菌圈有重叠部分)，图 3D为SX-20粗产物对痤疮丙酸杆菌Ⅳ完整的抑菌圈图。综上所述，该菌的发酵产物可抑制大肠杆菌、金色葡糖球菌以及痤疮丙酸杆菌的生长。

2.3 发酵产物鉴定

菌株SX-20的发酵产物经酸沉淀法提取后，呈淡黄色粉末状，发酵提取物含量约为1.03 g/L。傅里叶变换红外质谱去除水分和二氧化碳后的峰图如图 4所示，红外图谱在3 396 cm⁻¹ (N−H键的拉伸模式)和1 649 cm⁻¹ (CO−N键的拉伸模式)处具有肽特征的条带，在1 415 cm⁻¹和1 252 cm⁻¹处的峰显示的是脂肪族链(−CH₃、−CH₂)的部分，这些峰表明产物样品中存在脂肪族碳氢化合物以及肽链部分^[22]。在相同的波数范围内存在N−H键、CO−N键和−CH₃、−CH₂部分的拉伸模式的峰图，这表明菌株SX-20产生的生物表面活性剂与表面蛋白的结构具有相似的部分。

发酵产物粗提取物氨基酸分析结果如图 5A、5B所示，SX-20的粗提取产物中含14种氨基酸：Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys和Arg，其中Asp、Glu、Val和Leu的摩尔含量分别为6.875、17.542、7.272、27.138 nmol，Asp、Glu、Val与Leu摩尔含量比值接近于1:2.5:1:4，与文献中报道的Asp、Glu、Val和Leu比值为1:1:1:4相似^[19]，不同在于Glu含量更高，原因可能是本研究发酵培养基中加入了大量的谷氨酸作为发酵的前体物质，但其他3种主要氨基酸的摩尔含量比例与参考文献中相似。结合红外色谱图和氨基酸分析，可初步判断所提取的该菌株粗产物是表面活性蛋白。液相-质谱联用在正离子监测模式得到SX-20发酵产物的液相图谱主峰在10.27 (图 6A)，对10.27处进行质谱分析，得到样品的一级质谱图(图 6B)，分析可得样品分子式为C₅₃H₉₄O₁₃N₇，分子质量为1 036.689 3，这与文献中报道的分子式和质量是一致的。然后对一级质谱主峰1 036.689 3进行二次分析，得到二级质谱图(图 6C)。将二级质谱图与网站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/surfactin#section=LC-MS)进行对比，可得出该菌株产物的结构(图 7)，结合氨基酸分析可得出菌株SX-20的产物是含C15的脂肪酸链，氨基酸顺序为Leu-Leu-Asp-Val-Leu-Leu-Glu的surfactin C。

3 讨论与结论

本文通过借鉴杨欢等的高通量CPC-BTB显色法结合溶血性和抑菌性，高效地从原油污染的土壤样本中筛选得到一株产表面活性剂的菌株，枯草芽孢杆菌SX-20。结合2种方法可高效简便地从土壤样本中有目的地筛选出目的菌种。菌株SX-20的发酵产物经过酸沉淀、甲醇萃取等处理后得到粗产物，其含量为1.03 g/L。对菌株SX-20的粗产物进行FTIR分析其中的化学键和官能团，氨基酸分析粗产物中所含氨基酸种类和含量，初步确定产物类型，然后利用LC-MS对粗产物进行结构分析，得出该粗产物的分子式为C₅₃H₉₄O₁₃N₇，结构分析得出产物是含C15脂肪酸链的surfactin C，综合分析可知其氨基酸顺序为Leu-Leu-Asp-Val-Leu-Leu-Glu。SX-20发酵产物对痤疮丙酸杆菌的抑制效果比较明显，在此之前对痤疮丙酸杆菌的抑制作用报道较少。对大肠杆菌、金色葡萄球菌均具有抑制作用，另外发现该产物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌表现出不同的抑制作用，经分析这个表面活性剂的结构跟己发现的酯肽类生物表面活性剂不完全一样，这可能与其抑菌效果的表现有关，具体机理以后将进一步探讨。表面活性剂是一种新型化学品，在提高石油采收率和微生物采油、农业、生物修复环境、化妆品和医疗保健、食品等方面具有巨大前景。本研究为更高效、准确地筛选得到表面活性剂的生产菌株提供了技术路线，以及更好地应用表面活性剂提供了理论基础。

致谢

感谢中国科学院广州分院广东省微生物研究所的施庆珊研究员在选题上的帮助，感谢实验组的成员在实验中的帮助以及广东省科学院微生物研究所提供的实验设备和实验环境，以及昆明理工大学生命科学与技术学院的张琦教授的大力支持和关心。