布鲁氏菌(Brucella spp.)属于变形菌门的α-2型分支，是革兰氏阴性兼性胞内寄生菌。布鲁氏菌病呈全球性流行，有超过170个国家有关于布鲁氏菌病的报道^[1]。我国将其列为二类疫病，可能造成较大经济损失和社会影响，布鲁氏菌病的疫情依然严峻^[1-2]。

布鲁氏菌没有经典的毒力因子，其侵入机体后，通过多种途径突破宿主的免疫杀伤并在细胞内生存是其致病的关键^[3]。因而，布鲁氏菌入侵宿主和在细胞内存活的机制一直是该领域研究的重点。但有关布鲁氏菌入侵相关因子的研究并不充分。研究显示，入侵相关位点B (invasion-associated locus B, ialB)基因编码的蛋白是一种入侵相关蛋白，在巴尔通体逃避免疫、黏附并侵袭宿主红细胞中发挥重要作用^[4]。ialB在所有种属的巴尔通体中是保守的，对杆菌样巴尔通体的ialB基因进行插入突变，突变株和野生株相比，其黏附和入侵红细胞的能力下降了47%–53%^[5]。ialB与耶尔森菌中编码Ail蛋白的基因具有相当的序列相似性，Ail蛋白属于外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)，与黏附和入侵宿主细胞有关^[6]。ialB基因也被证明可赋予大肠杆菌入侵红细胞的表型，暗示其在细菌毒力中的作用^[7]。ialB也有可能和致病菌在不同的环境中适应和生存相关，如杆菌样巴尔通体从宿主白蛉传递到人时，可以适应温度、pH、氧化应激等显著变化的生存环境^[8]。

布鲁氏菌和巴尔通体均是α-变形杆菌，它们的系统发育关系相近，都能在真核细胞中生存。ialB的同源基因在包括猪布鲁氏菌的根瘤菌目中是广泛保守的，但关于布鲁氏菌ialB基因的报道却十分有限。对马耳他布鲁氏菌进行热应激处理(37 ℃转到42 ℃条件下培养)，IalB蛋白表达量下调^[9]。推测布鲁氏菌ialB的功能可能与入侵细胞以及适应吞噬细胞中遭遇的环境胁迫如低pH、活性氧(reactive oxygen species, ROS)等有关。因此，构建布鲁氏菌ialB缺失株，研究ialB在布鲁氏菌中可能的功能及其是否对布鲁氏菌入侵巨噬细胞和在巨噬细胞中存活和增殖产生影响，对于揭示布鲁氏菌感染的机制具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒

猪种布鲁氏菌S2株(Brucella suis S2)、pUC18、pBBR1MCS-5、pET32a和pEGFP-N1等载体由本实验室(农业农村部动物生物技术重点实验室)保存。

1.1.2 主要试剂和仪器

胰酪大豆胨液体培养基(trypticase soy broth, TSB)购自北京奥博星生物技术有限公司，Primer star DNA polymerase、DNA Marker、限制性核酸内切酶购自大连宝生物工程有限公司，ClonExpress^® MultiS One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司，高纯度质粒小提中量试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，多黏菌素B (polymyxin B)购自广州赛国生物科技有限公司，HCl、H₂O₂和NaCl等购自汕头西陇科学股份有限公司，Triton X-100购自上海索莱宝生物科技有限公司，DMEM高糖培养基购自HyClone公司。

1.2 引物设计

根据NCBI网站上公布的布鲁氏菌S2株全基因组序列(GenBank登录号为NZ_CP006961.1)和pEGFP-N1载体的基因序列(GenBank登录号为U55762.1)，用DNASTAR软件分别设计ialB上下游同源臂扩增引物、ialB基因缺失鉴定引物、携带自身启动子的ialB基因扩增引物和卡那霉素抗性基因扩增引物。引物序列见表 1。

1.3 布鲁氏菌ialB缺失株及其回补株的构建

以布鲁氏菌S2株基因组和pEGFP-N1为模板，分别扩增出ialB基因的上下游同源臂和卡那霉素抗性基因。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)产物经纯化回收后分别与pMD19T载体进行连接，获得相应重组质粒。将重组质粒和pUC18质粒用相应的限制性内切酶进行双酶切，分别获得ialB基因的上下游同源臂、卡那霉素抗性基因和pUC18质粒骨架。将上述酶切回收产物用Ligation Mix连接试剂盒进行连接，获得基因缺失质粒pUC18-ialB。将pUC18-ialB电击转化布鲁氏菌S2株感受态细胞，经卡那霉素筛选、普通PCR鉴定、荧光定量PCR鉴定，最终得到布鲁氏菌ialB缺失株。

以布鲁氏菌S2株基因组、pBBR1MCS-5和pET32a为模板，分别扩增ialB基因、pBBRori、氨苄霉素基因。纯化回收的PCR产物用重组克隆试剂盒ClonExpress^® MultiS (C113-02)进行重组连接，获得重组质粒pBBR-AmpR-ialB，然后电击转化布鲁氏菌ialB缺失株的感受态细胞，经PCR鉴定和Western blotting鉴定后得到回补株。

1.4 生长曲线的测定

在胰酪大豆胨琼脂(trypticase soy agar, TSA)平板上分别挑取布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株的单个克隆，接种在5 mL TSB培养基中，37 ℃振荡培养至600 nm处吸光值(optical density, OD)约为0.8；5 000 r/min离心10 min，弃去上清，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)重悬菌沉淀后倍比稀释，进行平板计数，以确定菌液的浓度；然后分别将1×10⁷菌落形成单位(colony forming units, CFU)的布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株接种在盛有100 mL TSB的锥形瓶中，37 ℃振荡培养，每8 h吸取一次菌液，测定OD₆₀₀，直至数值几乎不再变化。以培养时间为横轴，OD₆₀₀为纵轴，绘制生长曲线。

1.5 细菌活性测定

将布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株的菌液分别离心，5 000 r/min离心5 min，弃去上清，PBS洗3次后，将菌体用PBS调到相同OD (OD₆₀₀≈0.4)，按每毫升菌液加入10 μL的碘化丙啶(propidium iodide, PI)染液的比例对上述3株菌进行染色，混合均匀后，室温孵育10 min。多功能酶标仪激发光波长设置为536 nm，发射波长设置为617 nm，测定上述3株菌的荧光密度值。

1.6 体外应激试验

体外应激试验包括酸应激、高渗应激、低渗应激、氧化应激和多粘菌素B应激等试验，分别按照如下条件进行处理。

酸应激试验是将布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株用pH 3.9的TSB 37 ℃条件下处理30 min；高渗应激试验是将上述3株菌用山梨醇和NaCl终浓度均为1 mol/L的高渗溶液37 ℃条件下处理30 min；低渗应激试验将上述3株菌计数后重悬在无菌水中，37 ℃条件下处理30 min；氧化应激试验将上述3株菌分别用终浓度为1、2、4 mmol/L的H₂O₂ 37 ℃条件下处理1 h；多黏菌素B应激试验将上述3株菌分别用终浓度为1 200、900、600、300、150、75、37.5、18.75和9.375 IU/mL的多粘菌素B在37 ℃条件下处理30 min。对照组均为用TSB替代相应的处理溶液。进行相应的处理后，稀释涂板计数，计算相应处理的细菌存活率。

1.7 细菌聚集度测定

挑取布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株的单个克隆接种于盛有5 mL TSB的试管中培养至OD₆₀₀≈0.8，取试管中上部的菌液测定OD₆₀₀，记作0 h_OD₆₀₀。将剩下的菌液于室温中静置24 h后，取试管中上部的菌液测定OD₆₀₀，记作24 h_OD₆₀₀。细菌聚集度表示为(0 h_OD₆₀₀‒24 h_OD₆₀₀)/24 h_OD₆₀₀×100。

1.8 扫描电镜观察细菌形态

将布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株在TSB中培养至OD₆₀₀≈0.6，取3 mL菌液5 500 r/min离心10 min，弃上清，加入PBS清洗沉淀，每次10 min，洗3次后，加入2.5%戊二醛，混匀后，4 ℃固定过夜。依次用10%、30%、50%、70%、80%和90%的乙醇溶液进行脱水操作，每次脱水时间为15–20 min；用100%的乙醇脱水2次，每次30 min。最后用500 μL 100%的乙醇重悬菌沉淀。吸取菌液10 μL于盖玻片上，CO₂干燥后，粘到导电胶上，喷金后即可上电镜观察。

1.9 极性延长相关基因mRNA水平表达检测

实时荧光定量PCR方法检测布鲁氏菌极性延长相关基因在mRNA水平的表达情况。将布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株在TSB中培养至OD₆₀₀≈0.8，取5 mL菌液5 500 r/min离心10 min，弃上清；加入1 mL TRIzol，反复吹打，室温下裂解5 min；加入0.2 mL氯仿，混匀后室温静置15 min，4 ℃、12 000×g离心15 min；将上部水样层转移至新的EP管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀后室温静置10 min，4 ℃、12 000×g离心10 min，弃上清；75%乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥5–10 min，加入20 μL DEPC水溶解总RNA。使用Evo M-MLV反转录试剂盒Ⅱ (AG11711)获得cDNA，然后使用ChamQ SYBR^® qPCR Master Mix (Q311-02/03)进行实时荧光定量PCR，以16S RNA作为内参，2^‒ΔΔCt法进行数据分析。

1.10 细菌黏附试验

稀释平板计数法检测细菌黏附细胞的能力。将RAW264.7细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度接种在24孔板中，用含有5%胎牛血清的DMEM高糖培养液在37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h，进行攻菌操作。操作步骤如下：(1) 用含有5%胎牛血清的DMEM高糖培养液稀释布鲁氏菌S2株、布鲁氏菌ialB缺失株、回补株，使感染复数(multiplicity of infection, MOI)为50；(2) 弃去培养细胞的上清液，分别加入等体积的上述3株菌的菌液，400×g离心10 min；(3) 37 ℃、5% CO₂的环境中孵育30 min；(4) 弃去细胞培养液，用杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline, DPBS)洗5次，加入500 μL 0.25% Triton X-100裂解细胞，最后进行稀释涂板计数。

免疫荧光法检测细菌黏附细胞的能力。在24孔板中放入细胞爬片，将RAW264.7细胞以每孔5×10⁴个细胞的密度接种在24孔板中，攻菌操作如上所述，在用DPBS洗5次后，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗5次，每次5 min；加入1:100稀释的山羊抗布鲁氏菌阳性血清，每孔200 μL，室温孵育2–3 h；回收一抗，PBS洗5次，每次5 min；加入1:500稀释的驴抗山羊荧光二抗，室温孵育1.5–2 h，此步骤及后续步骤都应避光操作；回收二抗，PBS洗5次，每次5 min；每孔加入200 μL的DAPI，室温孵育15–20 min；回收DAPI，PBS洗5次，每次5 min；载玻片上滴加10 μL抗荧光淬灭剂，将爬片从24孔板中取出，边缘用吸水纸吸去多余的水分，轻轻放在有抗荧光淬灭剂的位置，用指甲油进行封片，在激光共聚焦显微镜下观察。

1.11 细菌入侵试验

细胞接种和攻菌操作如黏附试验，但MOI为500。攻菌后，弃去细胞培养液，用DPBS洗3次，加入等体积的含50 μg/mL庆大霉素的DMEM培养液，37 ℃、5% CO₂的环境中孵育1 h。用DPBS洗3次，再换成含25 μg/mL庆大霉素的DMEM培养液维持培养。以攻菌时在37 ℃、5% CO₂的环境中孵育30 min时为0 h，在其后的1、2、3 h用DPBS洗3次，再用0.25% Triton X-100裂解细胞，进行稀释涂板计数。

1.12 胞内增殖试验

稀释平板计数法检测胞内增殖。细胞接种和攻菌操作如黏附试验，杀胞外菌和维持培养如入侵试验，以攻菌时在37 ℃、5% CO₂的环境中孵育30 min时为0 h，在其后的3、6、12、24、48 h，用DPBS洗3次，再用0.25% Triton X-100裂解细胞，进行稀释涂板计数。

免疫荧光法检测胞内增殖。按照稀释平板计数法检测胞内增殖来进行细胞接种、攻菌、杀胞外菌和维持培养等。以攻菌时在37 ℃、5% CO₂的环境中孵育30 min时为0 h，在其后的12、24、48 h用DPBS洗3次后，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，后续操作如1.11所述。

1.13 数据统计分析

所有数据采用平均数±标准差(means±SD)表示，用GraphPad Prism 8统计学软件进行数据的差异显著性分析(t检验法，*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001)。

2 结果与分析 2.1 布鲁氏菌ialB缺失株及其回补株的构建

用ialB鉴定引物对布鲁氏菌S2株和布鲁氏菌ialB缺失候选菌株进行菌液PCR鉴定，结果显示布鲁氏菌S2株可扩增出大小为328 bp的条带，而布鲁氏菌ialB缺失候选菌株则未扩增出条带(图 1A)。荧光定量PCR检测布鲁氏菌S2株和布鲁氏菌ialB缺失候选菌株ialB基因的转录，结果显示布鲁氏菌ialB缺失候选菌株的ialB基因低于可检范围，表明缺失菌株构建成功，命名为ΔialB (图 1B)。对候选回补株进行菌液PCR鉴定，结果显示其可扩增出1 918 bp的条带，大小符合预期(图 1C)；进一步进行Western blotting鉴定，在21 kDa的地方出现条带，大小符合预期，表明回补菌株构建成功，命名为CΔialB (图 1D)。

2.2 生长曲线

布鲁氏菌S2株、ΔialB、CΔialB前期均生长较慢，在24 h时进入对数生长期，在48 h时生长速度变缓；布鲁氏菌S2株在64 h时到达平台期，而ΔialB、CΔialB在96 h时才缓慢到达平台期；可以看到，进入平台期后，布鲁氏菌S2株的OD₆₀₀值最大，CΔialB次之，ΔialB的OD₆₀₀值最小，表明ialB基因缺失抑制了布鲁氏菌的生长活性(图 2)。

2.3 细菌活性检测

对等量具有相同OD₆₀₀的3种菌株分别进行PI染色，ΔialB的荧光密度显著高于布鲁氏菌S2株和CΔialB。根据PI不能通过细胞膜完整的细胞的染色原理，可推测ΔialB的活力相比于布鲁氏菌S2株和CΔialB均有所降低(图 3)。

2.4 体外应激试验

在应对酸应激、高渗应激和低渗应激时，ΔialB的存活率均显著低于布鲁氏菌S2株和CΔialB (图 4A−4C)。而在应对氧化应激时，ΔialB的存活率则显著高于布鲁氏菌S2株和CΔialB (图 4D)。在用不同浓度的多黏菌素B对上述3种菌株进行处理时，3株菌的存活率均随着多黏菌素B浓度的上升而下降，其中ΔialB的存活率相较于布鲁氏菌S2株和CΔialB下降得更为显著。在多黏菌素B浓度为1 200 IU时，ΔialB的存活率几乎降为0，布鲁氏菌S2株的存活率降为50%左右，CΔialB的存活率介于ΔialB和布鲁氏菌S2株之间(图 4E)。该结果提示，ialB基因缺失影响了布鲁氏菌外膜的完整性。

2.5 细菌聚集度

将培养至生长对数期的布鲁氏菌S2株、ΔialB、CΔialB调整至相同的OD₆₀₀，此时(0 h) 3种菌株的菌液均呈均匀浑浊状。在静置24 h后，布鲁氏菌S2株的菌液浑浊度无显著变化，ΔialB上部液体相比于0 h较为澄清，细菌沉降聚集在试管底部和中部，CΔialB的状态介于布鲁氏菌S2株和ΔialB之间(图 5A)。分别测量上述菌液静置前后上层的OD₆₀₀，计算3株菌的聚集度，结果表明，ΔialB菌体的聚集度最大，布鲁氏菌S2株菌体的聚集程度较小，CΔialB介于二者之间(图 5B)，进一步确认了ialB基因与布鲁氏菌外膜的完整性有关。

2.6 扫描电镜结果

扫描电镜照片显示，布鲁氏菌S2株形态饱满，轮廓清晰，呈短杆状，表面分布有均匀的颗粒，折光性较好，可看到部分菌体正在进行分裂；ΔialB相较于布鲁氏菌S2株形态明显发生改变，表面皱缩，甚至有部分菌体已经破裂，表面颗粒物不清晰，整体变圆，亦有部分菌体大小超过布鲁氏菌S2株数倍，众多细菌堆积在一起，菌体轮廓不清晰，部分菌体呈针尖分裂，相当部分表面出现菜花样赘生物，折光性较差；CΔialB菌体较布鲁氏菌S2株明显变得细长，相当多的菌体表面呈现针尖分裂(图 6A)。对上述3株菌的长度进行测量和统计分析，布鲁氏菌S2株的长度多集中在0.6–0.9 μm范围内，ΔialB长度大部分在0.5–0.7 μm范围内，CΔialB的长度范围跨度较大，长度大小分布在0.6–1.2 μm范围内(图 6B、6C)。该结果进一步表明，IalB与布鲁氏菌的生长活性有关。

2.7 极性延长相关基因mRNA水平表达结果

实时荧光定量PCR检测细菌极性延长相关基因FtsZ、FtsA、PopZ、pbp-1A、ErfK 1、ErfK 4的mRNA水平表达。结果显示，布鲁氏菌ialB缺失株FtsA、PopZ的mRNA水平显著上调，pbp-1A、ErfK 1、ErfK 4的mRNA水平显著下调，其中ErfK 1下调得最为显著(图 7)。该结果提示，IalB可能与布鲁氏菌的极性生长有关。

2.8 黏附试验结果

由于ialB基因缺失影响了布鲁氏菌外膜的完整性，本文进一步检测了3种菌株对细胞的黏附能力。结果显示，ΔialB对RAW264.7细胞的黏附能力与布鲁氏菌S2株相比无显著变化，而CΔialB对RAW264.7细胞的黏附能力显著高于ΔialB (图 8)。

2.9 入侵试验结果

进一步的入侵试验结果显示，ΔialB入侵RAW264.7细胞的能力与布鲁氏菌S2株相比有一定程度提高，尤其在2 h时，二者差异显著，而CΔialB入侵RAW264.7细胞的能力相较于ΔialB显著提升(图 9)。

2.10 胞内增殖试验结果

胞内增殖试验结果显示，在12 h之前布鲁氏菌S2株的胞内增殖能力不比ΔialB和CΔialB强，甚至弱于ΔialB和CΔialB；但在24 h时，布鲁氏菌S2株的胞内增殖能力与ΔialB和CΔialB相当；48 h时布鲁氏菌S2株的胞内增殖能力显著超过ΔialB和CΔialB，而CΔialB在48 h时，胞内增殖能力显著比ΔialB强，ΔialB在48 h时胞内增殖突然下降(图 10A)。12、24、48 h的免疫荧光结果与上述结果相符(图 10B)。

3 讨论

目前关于ialB基因的报道比较少，有限的几篇研究也集中于讨论其对巴尔通体入侵红细胞的影响^[10-11]。和布鲁氏菌一样，巴尔通体也能逃避宿主细胞的内吞途径，并在宿主细胞内建立核周生态位。ialB是巴尔通体重要的致病因子，是入侵红细胞的关键。ialB与耶尔森菌编码Ail蛋白的基因具有相当的序列相似性，Ail蛋白所属的OMP家族成员经常与黏附和入侵宿主细胞有关^[5]。尽管ialB的同源基因在包括猪布鲁氏菌的根瘤菌目中是广泛保守的，但其在猪布鲁氏菌中的功能尚不清楚。

布鲁氏菌是兼性胞内寄生菌，其侵入宿主细胞后会面对酸应激、抗菌素防御、活性氧等多种胞内环境胁迫^[12]。在本研究中，ΔialB在面对酸应激和多黏菌素B应激时，存活率相比于布鲁氏菌S2株和CΔialB显著下降，特别是在用较低浓度的多黏菌素B (9.375 IU/mL)进行处理时，布鲁氏菌S2株和CΔialB的存活率几乎为100%，而ΔialB的存活率只有60%左右，可见多黏菌素B对ΔialB的影响极大。多黏菌素B常用来测定细菌外膜的稳定性，因此推测ialB的缺失对布鲁氏菌S2株外膜的完整性产生了较大影响^[13]。而后，又进行了高渗应激试验和低渗应激试验，结果显示ΔialB的存活率均显著下降，进一步印证了其外膜的完整性被破坏，从而无法调节细胞内外渗透压的平衡。在细菌和真菌细胞中，胞外H₂O₂能够通过膜定位的水通道蛋白进入胞内，进而使细胞遭受氧化应激^[14-17]。在本研究中，ΔialB在面对胞外H₂O₂刺激时的存活率显著高于布鲁氏菌S2株和CΔialB，其原因可能为ΔialB外膜完整性的破坏抑制了细胞膜对胞外H₂O₂的通透性。

在本研究中，ΔialB形态相对于布鲁氏菌S2株发生了较大的改变。使用扫描电镜技术对布鲁氏菌S2株、ΔialB以及CΔialB进行形态观察，布鲁氏菌S2株的形态饱满，轮廓清晰，呈短杆状，表面分布有均匀的颗粒，折光性较好，ΔialB形态发生明显改变，表面皱缩，表面颗粒物不清晰，整体变圆，菌体轮廓不清晰，部分菌体呈针尖分裂，相当部分表面出现菜花样赘生物，折光性较差。通过统计学分析，相比于布鲁氏菌S2株，ΔialB菌体长度变短，因此推测ΔialB的菌体延长相关的基因表达受到了影响。布鲁氏菌缺乏经典的延长体核心组分，其延长方式也有别于大肠杆菌等模式菌，生长延长方式为极性生长^[18-19]。现有的研究对阐明布鲁氏菌的菌体延长机制尚不清晰，因此选定了FtsZ、FtsA和pbp-1A等若干个菌体延长相关基因，检测其转录水平，发现大部分基因的表达有不同程度下调，其中ErfK 1表达下降最为明显。ErfK 1与根瘤菌目ATU0669蛋白对应的基因遗传关系较近，表明ialB可能影响了布鲁氏菌的极性生长^[20]。

对比于ialB在巴尔通体中入侵细胞的能力，本研究检测了ΔialB对RAW264.7细胞的黏附、入侵以及在RAW264.7细胞内的增殖能力。ΔialB黏附和入侵RAW264.7细胞的能力并不比布鲁氏菌S2株弱，具体原因有待进一步试验分析。值得注意的是，CΔialB黏附和入侵RAW264.7细胞的能力要显著强于布鲁氏菌S2株。ΔialB和CΔialB胞内增殖能力在前期比布鲁氏菌S2株强，后期(48 h时) ΔialB在RAW264.7细胞的细菌数量突然下降，CΔialB维持24 h时的水平，布鲁氏菌S2株呈指数级上升。在本研究中，CΔialB株ialB的转录水平比布鲁氏菌S2株要高，相当于ialB的过表达菌株，所以ialB的回补可能使布鲁氏菌的黏附和入侵RAW264.7细胞的能力都得到了增强，ialB的缺失使ΔialB无法在胞内持续存在。

本研究通过构建布鲁氏菌S2株ialB缺失株初步探讨了ΔialB的生物学特性，发现ΔialB活力降低，外膜完整性可能被破坏；其生长可能被抑制；在RAW264.7细胞内增殖能力降低。本研究为进一步揭示ialB在布鲁氏菌中的功能和对布鲁氏菌的致病作用提供了参考和方向，具有重要意义。