2023, Vol. 63
表1(Table 1)
古菌RecJ蛋白的研究进展
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220610
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 施静茹, 张立奎. 2023
- SHI Jingru, ZHANG Likui.
- 古菌RecJ蛋白的研究进展
- Research progress of archaeal RecJ protein
- 微生物学报, 63(4): 1318-1328
- Acta Microbiologica Sinica, 63(4): 1318-1328
-
文章历史
- 收稿日期：2022-08-11
- 网络出版日期：2022-10-19
引用本文 |
施静茹, 张立奎. 古菌RecJ蛋白的研究进展[J]. 微生物学报, 2023, 63(4): 1318-1328.
Shi Jingru, Zhang Likui. Research progress of archaeal RecJ protein[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2023, 63(4): 1318-1328.
古菌RecJ蛋白的研究进展
扬州大学环境科学与工程学院, 江苏 扬州 225127
摘要：RecJ蛋白属于aspartate-histidine-histidine (DHH)磷酸酯酶超家族，存在于细菌、真核生物和古菌中。细菌RecJ蛋白是一种5′→3′ ssDNA外切酶，参与错配修复、同源重组、碱基切除修复等生物学过程。真核生物cell division cycle 45 (Cdc45)蛋白是细菌RecJ核酸酶的同源物，但不具有核酸酶活性。Cdc45蛋白能够与minichromosome maintenance (MCM)和Go-Ichi-Ni-San (GINS)形成Cdc45-MCM-GINS (CMG)复合物，是真核生物DNA复制的重要组分。在古菌中，几乎所有基因组已测序的古菌均编码一种或多种RecJ蛋白同源物。与细菌RecJ核酸酶不同，古菌RecJ蛋白具有多样化的核酸酶活性，并且能够与MCM和GINS形成类似于真核生物CMG的复合物。因此，古菌RecJ蛋白是参与古菌DNA复制、修复和重组的重要成分。基于目前古菌RecJ蛋白的研究报道，本文综述了古菌RecJ蛋白的活性、结构与功能方面的研究进展，聚焦于不同古菌RecJ蛋白以及它们与细菌RecJ核酸酶和真核生物RecJ同源物的异同点，并对古菌RecJ蛋白未来的研究方向进行了展望。
关键词：古菌 RecJ蛋白 DNA修复 DNA复制
Research progress of archaeal RecJ protein
College of Environmental Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, Jiangsu, China
Abstract: RecJ proteins, the members of aspartate-histidine-histidine (DHH) superfamily of phosphoesterases, are ubiquitous in bacteria, eukaryotes, and archaea. In bacteria, the archetypal RecJ protein is a 5′→3′ ssDNA exonuclease that functions in biological processes such as mismatch repair, homologous recombination, and base excision repair. Cell division cycle 45 (Cdc45) protein, a homologue of bacterial RecJ nuclease, is essential in eukaryotes, but has no nuclease activity. Cdc45 protein forms Cdc45-MCM-GINS (CMG) complex with minichromosome maintenance (MCM) and Go-Ichi-Ni-Sa (GINS), and the complex plays a key role in DNA replication in eukaryotes. Almost all archaea whose genomes have been sequenced encode one or more RecJ protein homologues. Unlike bacterial RecJ nuclease, archaeal RecJ protein has diverse nuclease activities and can form a complex with MCM and GINS which shows functions similar to eukaryotic CMG complex. Thus, archaeal RecJ protein is an important component that is involved in archaeal DNA replication, repair and recombination. Based on current reports on archaeal RecJ protein, this study reviewed the activities, structures, and functions of archaeal RecJ protein, focusing on similarities and differences between different archaeal RecJ proteins and between archaeal RecJ proteins and bacterial RecJ nucleases/eukaryotic RecJ homologues. In addition, we summarized the research trends in archaeal RecJ protein.
Keywords:
archaea RecJ protein DNA repair DNA replication
RecJ蛋白核酸酶属于aspartate-histidine-histidine (DHH)磷酸酯酶超家族，具有保守的DHH结构域，位于蛋白的N末端[1]。根据它们生化功能和保守结构域的不同，DHH磷酸酯酶分为4个家族：家族Ⅰ包含原核生物的RecJ核酸酶和真核生物的cell division cycle 45 (Cdc45)蛋白[1-3]；家族Ⅱ由不同的nanoRNases组成，能够专一性地降解短小ssRNA分子[4]；家族Ⅲ包括真核生物的Prune和PPX以及原核生物的无机焦磷酸酶[5-6]，能够降解核苷酸的衍生物；家族Ⅳ是仅为古菌所有的Hef associated nuclease (HAN)核酸酶[7]。
对于细菌RecJ核酸酶，目前研究较多的是Deinococcus radiodurans和Thermus thermophilus RecJ核酸酶[8-15]，人们对其生化功能、催化机制和结构特征的认识较为清楚。细菌RecJ具有5′→3′ ssDNA外切酶活性，但不具有切割双链DNA的活性[15-16]。最新的研究发现，细菌RecJ还具有核酸内切酶活性[17-18]。真核生物基因组不编码细菌RecJ蛋白，但是真核生物Cdc45蛋白与细菌RecJ具有同源性[3]。真核生物Cdc45蛋白缺少细菌RecJ中DHH催化结构域中的关键氨基酸残基，表明该蛋白不是一个核酸酶[19]。
根据生化功能的不同，古菌RecJ蛋白分为4类：第1类，具有细菌RecJ核酸酶活性的古菌RecJ蛋白；第2类，不具有细菌RecJ核酸酶活性的古菌RecJ蛋白；第3类，参与形成古菌CMG复合物的古菌RecJ蛋白；第4类，功能未知的古菌RecJ蛋白[2]。目前，几乎所有基因组已测序的古菌至少编码1个或多个RecJ蛋白。古菌RecJ蛋白具有细菌RecJ的核酸酶活性并且它们的核酸酶活性比细菌RecJ更加多样化。另外，古菌RecJ蛋白与真核生物Cdc45蛋白具有同源性和功能相似性。此外，古菌RecJ蛋白还具有独特的生化功能。因此古菌RecJ蛋白是古菌DNA复制、修复和重组过程中的重要成分。本文综述了古菌RecJ蛋白的研究进展，并对今后的研究进行了展望。
1 RecJ蛋白的生物学功能RecJ蛋白是一种多功能的蛋白，现已证实其参与DNA修复和DNA复制(图 1)。Lovett等最早对Escherichia coli K-12的recJ基因进行了遗传分析[20]。后来发现，E. coli RecJ参与UV引起的损伤修复和DNA重组[21-22]。进一步的研究表明，RecJ、exonuclease Ⅹ (ExoX)、exonuclease Ⅰ (Exo Ⅰ)和exonuclease Ⅶ (Exo Ⅶ)参与E. coli细胞内甲基化介导的错配修复[23-24]。
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| 图 1 RecJ蛋白的功能 Figure 1 Function of RecJ protein. |
双链断裂的5ʹ端切割，是重组DNA修复的必需步骤。E. coli RecF介导的重组是修复双链断裂损伤的途径之一[25]。研究发现，3′→5′解旋酶RecQ、5′→3′外切酶RecJ和单链DNA结合(single-strand DNA binding, SSB)蛋白相互协调参与RecF重组[26]。同样，细菌Neisseria gonorrhoeae RecJ也被证实参与同源重组和DNA修复途径[27]。
细菌RecJ具有脱氧核糖磷酸化酶(deoxyribose phosphatase, dRPase)活性[28]，能够去除无嘌呤/无嘧啶(apurinic/apyrimidinic, AP)核酸内切酶切割AP位点所形成的脱氧核糖磷酸，暗示着该酶参与碱基切除修复。研究发现，敲除recJ基因的D. radiodurans菌株表现出对H2O2和methyl-methanesulphonate (MMS)极强的敏感性，同时该突变株细胞内具有更高的自发突变频率和未被修复的AP位点含量[13]，从而证实了D. radiodurans RecJ在体内参与碱基切除修复。
研究发现，真核生物Cdc45蛋白能够与解旋酶minichromosome maintenance (MCM)和Go-Ichi-Ni-San (GINS)形成Cdc45-MCM-GINS (CMG)复合物[29-30]，参与DNA复制。现已证实古菌RecJ蛋白能够与GINS和MCM形成功能类似真核生物CMG的复合物[31-35]。除此之外，古菌RecJ蛋白还能够与helicase-associated endonuclease for fork-structured DNA (Hef)蛋白相互作用，启动被阻止复制叉的修复[36-38]。
2 RecJ蛋白的结构特征目前，晶体结构得到解析的细菌RecJ蛋白主要源自于D. radiodurans[8-9]和T. thermophilus[10-11]。这些细菌RecJ蛋白晶体结构的解析，为揭示其催化机制提供了重要的线索。
D. radiodurans RecJ蛋白的晶体结构显示，其催化中心由N端的催化核心DHH和DHHA1结构域、C端的寡核苷酸/寡糖折叠结构域(oligonucleotide/oligosaccharide-binding, OB)组成(图 2A)[8]。生化研究发现，OB折叠结构域具有结合单链和双链DNA的活性，并能够增强RecJ核酸酶结合单链DNA能力[8]。另外，D. radiodurans RecJ蛋白与含有dRP类似物5′-P-dSpacer基团的ssDNA形成复合物的晶体结构显示该酶存在5′-单磷酸结合口袋，并且5′-dRP占据该酶的活性中心，从而暗示着该酶具有5′-dRP活性[9]。此外，D. radiodurans RecJ蛋白与dTMP、ssDNA和SSB C-末端形成复合物的结构也得到了解析，进一步从结构角度揭示了该酶切割ssDNA的机理[9]。同样，细菌T. thermophilus RecJ-Mn2+复合物的结构显示，RecJ蛋白利用双金属离子机理催化水解反应[10]。
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| 图 2 细菌RecJ核酸酶(A)、真核生物Cdc45蛋白(B)和古菌RecJ蛋白(C)的结构比较[2] Figure 2 Comparison of structures of bacterial RecJ nuclease (A), eukaryotic Cdc45 protein (B) and archaeal RecJ protein (C). Dra-RecJ: Deinococcus radiodurans Rec J (PDB: 5F55); Tko-GAN: Thermococcus kodakarensis GAN (PDB: 5GHT); Hum-Cdc45: Human Cdc45 (PDB: 5DGO); CTD: C-terminal domain. This figure is modified from this reference [2]. |
真核生物Cdc45蛋白的晶体结构也得到了解析，包括人类和痢疾变形虫的Cdc45蛋白[19, 39]。从整体结构上看，人类Cdc45蛋白类似细菌RecJ蛋白，由DHH和DHHA1结构域和连接区域组成(图 2B)。与细菌RecJ蛋白结构不同，真核生物Cdc45蛋白缺少DHH催化结构域中关键的氨基酸残基。重要的是，真核生物Cdc45蛋白具有CMG-interacting domain (CID)结构域，而不存在细菌RecJ蛋白的OB结构域。而古菌RecJ蛋白的整体空间结构均类似于细菌RecJ蛋白和真核生物Cdc45蛋白(图 2C)，既具有细菌RecJ蛋白的DHH催化结构域，又具有真核生物Cdc45蛋白的CID结构域，表明古菌RecJ蛋白既具有核酸酶活性，又能够形成CMG复合物。因此，古菌RecJ蛋白具有独特的结构特征。
3 古菌RecJ蛋白目前，已被研究过的古菌RecJ蛋白主要来自广古菌，少数来自泉古菌(仅限于硫化叶菌属的Cdc45蛋白)。广古菌RecJ蛋白具有3个保守的结构域，而泉古菌RecJ蛋白缺少具有催化活性的DHH结构域(图 2)。表 1比较了不同古菌RecJ蛋白的生化功能，表明古菌编码不同数量的RecJ蛋白，且具有功能多样性。
表 1. 古菌RecJ蛋白的生化功能比较
Table 1. Biochemical function comparison of archaeal RecJ protein
| Protein name | Component of CMG complex | Exonuclease activity | References | ||||
| ssRNA | ssDNA | ||||||
| 5′→3′ | 3′→5′ | 5′→3′ | 3′→5′ | ||||
| Tko-GAN | + | ‒ | ‒ | + | ‒ | [32] | |
| Pfu-RecJ | + | ‒ | + | + | ‒ | [38] | |
| Afu-RecJ | ‒ | ‒ | + | ‒ | + | [40] | |
| Mja-RecJ1 | ‒ | + | ‒ | + | ‒ | [41] | |
| Mja-RecJ2 | ‒ | ‒ | + | ‒ | + | [41] | |
| Tac-RecJ1 | ‒ | ‒ | ‒ | + | ‒ | [33] | |
| Tac-RecJ2 | + | ‒ | + | ‒ | + | [33] | |
| Tga-RecJ | N.D. | ‒ | ‒ | + | ‒ | [42] | |
| Sso-Cdc45 | + | ‒ | ‒ | ‒ | ‒ | [34] | |
| Sac-Cdc45 | + | ‒ | ‒ | ‒ | ‒ | [35] | |
| Tga: Thermococcus gammatolerans; Tko: Thermococcus kodakarensis; Pfu: Pyrococcus furiosus; Sso: Sulfolobus solfataricus; Sac: Sulfolobus acidocaldarius; Afu: Archaeoglobus fulgidus; Tac: Thermoplasma acidophilum; Mja: Methanocaldococcus jannaschii. “+” indicates the presence of activity; “‒” indicates the absence of activity; N.D.: Not determined. | |||||||
3.1 Thermococcus kodakarensis RecJ蛋白
极端嗜热古菌T. kodakarensis基因组编码2种RecJ-like蛋白：TK1252和TK0155。TK1252蛋白称作是GINS associated nuclease (Tko-GAN)[43]，是目前研究最详尽的古菌RecJ蛋白，其活性、结构和生理功能均得到了阐明[31-32, 44-46]。研究发现，Tko-GAN只具有5′→3′ ssDNA外切酶活性，类似于细菌RecJ，但是不能切割dsDNA或RNA。
遗传学分析表明，Tko-GAN对于T. kodakarensis细胞的生长和分裂是非必需的[45]，不同于真核生物Cdc45蛋白是DNA复制和细胞周期所必需的。另外，Tko-GAN能够去除5′端由DNA聚合酶D的链取代活性所形成的侧翼结构，暗示着该蛋白参与冈崎片段的加工。最新的研究发现，Tko-GAN能够与DNA聚合酶D相互作用[46]，从而支持这一推测。敲除实验表明，单独敲除FEN1和GAN对菌株的完整性和生长没有影响，但是同时敲除FEN1和GAN，细胞却无法生长[45]，表明细胞内FEN1或GAN完全能够维持细胞的完整性。进一步的研究发现，Tko-GAN能够在同时缺失FEN1和RNase HII的条件下维持细胞的生长，证实了Tko-GAN参与冈崎片段的成熟。
T. kodakarensis编码的第2个RecJ蛋白是TK0155，称作为HAN，即与Hef作用的核酸酶[7]。Hef蛋白在修复被阻止的复制叉起着必要的作用，主要存在广古菌和一些Asgard古菌[47]，而在泉古菌中尚未发现。生化实验表明，Tko-HAN具有3′→5′外切酶活性，能够切割ssDNA和RNA底物，不同于Tko-GAN[37]。另外，Tko-Hef促进Tko-HAN活性，而Tko-HAN抑制Tko-Hef核酸酶活性。遗传学的数据表明，Tko-HAN对细胞的完整性为非必需的，而Δgan-han基因突变株在85 ℃的最适生长条件下不能生长[37]。但是，通过插入编码核酸酶缺陷HAN的基因到这个突变株的基因组内，该突变株仍不能恢复正常的生长[37]，表明缺失GAN的不稳定CMG复合物不能使DNA复制进行，进一步表明HAN对于修复被阻止的复制叉的重要性，并且其核酸酶活性是该蛋白在细胞内发挥其功能所必需的。
3.2 Thermococcus gammatolerans RecJ蛋白本实验室探讨了极端嗜热耐辐射古菌T. gammatolerans RecJ (Tga-RecJ)蛋白的生化功能和催化机理[42]。研究发现，Tga-RecJ在高温条件下具有5′→3′方向切割ssDNA，类似于Tko-GAN、Pfu-RecJ、Mja-RecJ1和Tac-RecJ1。与Pfu-RecJ、Afu-RecJ、Mja-RecJ2和Tac-RecJ2不同，Tga-RecJ缺少3′→5′外切ssRNA活性。该酶活性的最适温度为50−70 ℃，最适pH为pH 7.0−9.0，其活性依赖Mn2+。该酶是目前所有报道的RecJ蛋白中最为耐热的蛋白。另外，本实验室在50−70 ℃温度下测试Tga-RecJ切割DNA的反应速率，从而揭示了该酶切割DNA的激活自由能为(10.5±0.6) kcal/mol，这是RecJ蛋白切割ssDNA的激活能量的首次报道。突变分析结果表明，Tga-RecJ D36A、D83A、D105A、H106A、H107A和D166A突变体活性完全损失，表明氨基酸残基D36、D83、D105、H106、H107和D166是该酶切割DNA的关键位点。
3.3 Pyrococcus furiosus RecJ蛋白极端嗜热古菌P. furiosus编码两种RecJ蛋白：Q8U3Q7和Q8TZE0，其中Q8U3Q7的蛋白为Pfu-HAN，Q8TZE0的蛋白为Pfu-RecJ。目前Pfu-HAN尚未被研究。Pfu-RecJ具有完整的DHH核酸酶结构域，具有类似于Tko-GAN的5′→3′ ssDNA活性。与Tko-GAN不同的是，Pfu-RecJ还具有3′→5′ ssRNA活性，能够水解单链RNA和RNA/DNA中的RNA链[38]。进一步的研究发现，复制蛋白A和DNA结合蛋白能够促进Pfu-RecJ去除RNA/DNA中的RNA链，这暗示着Pfu-RecJ可能在体内校对RNA引物。另外，Pfu-RecJ在体外切割ssRNA的活性高于切割RNA/DNA杂合体的活性，暗示着该酶参与RNA降解。
Pfu-RecJ蛋白的晶体结构显示，其结构由DHH、DHHA1和CID组成，类似于Tko-GAN结构[48]。Pfu-RecJ和Tko-GAN结构的不同之处在于连接DHH和DHHA1结构域的定位不同。类似于Tko-GAN，Pfu-RecJ通过其DHH结构域结合Pfu-GINS中GINS51亚基的B-结构域与GINS相互作用，暗示着Pfu-RecJ能够形成CMG复合物。另外，Pfu-RecJ蛋白与2个CMPs形成复合物的晶体结构也得到了解析，其结构显示该酶存在由几个带有正电荷的氨基酸残基组成的通道，用于结合ssDNA底物或者释放单个核苷酸产物。缺失CID结构域，导致Pfu-RecJ增加5倍5′→3′ ssDNA外切酶活性的kcat/Km值和4倍3′→5′ ssRNA外切酶活性的kcat/Km值，表明CID结构域调控该酶的活性。
3.4 Thermoplasma acidophilum RecJ蛋白嗜酸热古菌T. acidophylum基因组编码2个RecJ-like蛋白，分别命名为Tac-RecJ1和Tac-RecJ2，但是不编码HAN同源物。生化研究表明，Tac-RecJ1和Tac-RecJ2均是外切酶，但是它们具有不同的底物偏好性和不同的极性[33]。Tac-RecJ1具有5′→3′ ssDNA专一性外切酶活性，类似于Tko-GAN。然而，Tac-RecJ2具有3′→5′外切酶活性，能够切割ssRNA和ssDNA，并且RNA是该酶的最适底物。尽管Tac-RecJ1与Tko-GAN具有相似的底物偏好性和极性，但是它不能形成CMG复合物，而Tko-GAN却能形成CMG复合物。
Tac-RecJ2通过与Tac-Gins51的B结构域相互作用，与Tac-GINS按照2:1的摩尔比形成稳定的复合物[33]。进一步的研究发现，该复合物能够促进Tac-MCM活性，并且在细胞内证实了CMG复合物的存在。但是，Tac-RecJ2不能直接与Tac-MCM相互作用，在体外并不是激活解旋酶所必需。这些结果表明，尽管古菌和真核生物CMG复合物形成的保守性，古菌RecJ蛋白在DNA复制的功能仍不同于Cdc45。Tac-RecJ1作为细菌RecJ的类似物，在修复被阻止的复制叉过程发挥功能。另外，Tac-RecJ1能够降解冈崎片段。因此，T. acidophilum所编码的这2个RecJ蛋白在复制叉准确前进的不同过程中发挥功能。
3.5 Methanocaldococcus jannaschii RecJ蛋白嗜热产甲烷古菌M. jannaschii基因组编码3个RecJ-like蛋白，其中2个RecJ-like蛋白(MJ0977和MJ0831)为Tko-GAN同源物，另一个(MJ1198)为Tko-HAN同源物。尽管MJ1198蛋白的生化功能尚未研究，但是其N段的部分结构得到了解析(PDB: 2K52)。通过在E. coli中表达MJ0977或MJ0831蛋白，能够部分补偿recJ基因缺失的E. coli突变株对UV的敏感性[49]，表明RecJ蛋白参与DNA修复，进一步表明RecJ蛋白在进化过程中的功能保守性。
MJ0977和MJ0831蛋白分别定义为Mja-RecJ1和Mja-RecJ2。研究发现，Mja-RecJ1更加类似于Tko-GAN和Tac-RecJ1，具有5′→3′核酸外切酶活性，能够切割ssDNA和ssRNA底物[41]。相对于ssRNA底物，该酶偏好ssDNA底物。与Mja-RecJ1不同，Mja-RecJ2具有3′→5′核酸外切酶活性，也能够切割ssDNA和ssRNA。相对于ssDNA，该酶更偏好ssRNA为底物。另外，5′端磷酸促进Mja-RecJ1活性，而3′端磷酸抑制Mja-RecJ2活性。与T. acidopylum不同，其编码的Tac-RecJ2能够与GINS相互作用，而M. jannaschii所编码的Mja-RecJ1和Mja-RecJ2均不能与Mja-GINS形成稳定的复合物。
3.6 Archaeoglobus fulgidus RecJ蛋白极端嗜热古菌A. fulgidus基因组编码3种RecJ蛋白：AF_0699、AF_0735和AF_0075。AF_0735蛋白在大肠杆菌中表达时，大部分形成包涵体，对纯化到极少量可溶性蛋白的活性分析表明，该蛋白不具有核酸酶活性。而AF_0075蛋白与其他两个RecJ蛋白相比，序列相似性较低，也不具有核酸酶活性。但是，AF_0699蛋白具有核酸酶活性[40]。研究发现，与Pfu-RecJ类似，A. fulgidus RecJ (Afu-RecJ, AF_0699)核酸酶不仅具有单链DNA特异性的3′→5′外切核酸酶活性，还具有单链RNA 3′→5′外切酶活性[40]。Afu-RecJ的活性需要二价金属离子，其中Mn2+是该酶的最适二价金属离子。该酶最适反应温度为55−65 ℃，其活性受高浓度NaCl (高于200 mmol/L)抑制。进一步的研究发现，Afu-RecJ对不同长度的单链DNA和单链RNA具有选择性，优先切割长度≥4个核苷酸长度的单链RNA和≥12个核苷酸长度的单链DNA。Afu-RecJ的生化功能特征暗示着该酶在细胞内参与DNA修复和RNA降解。
3.7 硫化叶菌RecJ-like蛋白上述描述的古菌RecJ蛋白来自广古菌，目前泉古菌的RecJ-like蛋白的报道，仅限于硫化叶菌属。Sulfolobus solfataricus Cdc45 (Sso-Cdc45)蛋白是第一个研究报道的泉古菌RecJ-like蛋白[34]。该蛋白最初被定义为RecJdbh，现在称为Sso-Cdc45蛋白。Sso-Cdc45蛋白与广古菌RecJ蛋白的相似性低，特别是缺少其他RecJ蛋白DHH催化结构域中的关键催化氨基酸残基(图 2)。因此，Sso-Cdc45蛋白不具有核酸酶活性，不是一个核酸酶。进一步的研究发现，Sso-Cdc45蛋白能够与GINS相互作用，并与MCM形成CMG复合物[35]。同样，硫化叶菌属中的S. acidocaldarius Cdc45 (Sac-Cdc45)蛋白得到了研究。利用Sac-Cdc45、Sac-GINS和Sac-MCM，体外构建Sac-CMG复合物，证实了Sac-Cdc45-GINS促进Sac-MCM活性的功能[35]。
3.8 Asgard古菌RecJ-like蛋白目前，已鉴定的Asgard古菌包括4种门类：Thorarchaeota、Odinarchaeota、Heimdallarchaeota和Lokiarchaeota[50]。序列分析表明[2]，这4种门类的Asgard古菌均编码GAN-like蛋白，与Tko-GAN具有30%氨基酸序列相似性，包含了具有活性的RecJ-like结构域。但是只有Heimdallarchaeota门编码HAN-like同源物，暗示着Thorarchaeota、Odinarchaeota和Lokiarchaeota在进化过程中丢失了这一基因。
4 总结与展望古菌编码多个RecJ蛋白，具有核酸酶活性和不具有核酸酶活性的RecJ蛋白都已被发现，暗示着古菌RecJ蛋白在古菌DNA复制和修复以及维持基因组稳定性中发挥作用。古菌RecJ蛋白的结构与细菌RecJ蛋白的结构高度相似，并且具有真核生物Cdc45蛋白的特征。但是，古菌RecJ蛋白在底物偏好和作用方式上与细菌RecJ蛋白存在显著差异。另外，古菌RecJ蛋白与真核生物Cdc45蛋白相似，能够与MCM和GINS形成复合物，参与DNA复制。因此，古菌RecJ蛋白在古菌DNA复制和修复中扮演重要角色。
目前，利用生物化学、蛋白质晶体学和遗传学的方法对古菌RecJ蛋白的活性、结构特征和生理功能进行了探讨，从而使人们对古菌RecJ蛋白对不同底物偏好性和作用模式有了一定的认识。然而，古菌RecJ蛋白的功能尚未完全弄清楚，还有许多问题有待于回答：
(1) Tko-GAN和Tac-RecJ2既具有核酸酶活性，又是CMG的组分。作为CMG的组分，当解开DNA双螺旋后，它们是否在复制叉处发挥其核酸酶活性。如果是，它们作用于什么底物。如果这些蛋白质作为CMG的组分没有活性，它们的活性又如何被抑制。
(2) 古菌RecJ蛋白的核酸酶活性不是古菌CMG复合物功能所必需的，至少在硫化叶菌中不需要。因此，古菌细胞完全有可能存在含有抑制而非永久失活的RecJ蛋白的CMG。在这种情况下，古菌RecJ蛋白是否具有催化作用与结构作用，取决于它们在溶液中是游离的还是CMG的组分。如何区分古菌RecJ蛋白的催化作用和结构作用，需要进一步探讨。
(3) 生化数据表明，Pfu-RecJ具有校对3′端错配RNA引物的功能，遗传学分析结果暗示着Tko-GAN参与冈崎片段的加工。这样会引起一个问题：具有3′→5′ ssRNA外切活性的RecJ蛋白的活性中心与其5′→3′ ssDNA的活性中心是否一致。
(4) 古菌RecJ蛋白3′→5′ ssRNA外切活性与其作为CMG成分的功能是如何实现的。
(5) 目前，仍有一些古菌的遗传操作体系尚未建立，如何识别这些古菌RecJ蛋白(比如Tac-RecJ1)的生理功能。
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