2023, Vol. 63中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 黄立鑫, 孙俊, 刘琴, 韩光杰, 李传明, 夏杨, 陆玉荣, 徐健. 2023
- HUANG Lixin, SUN Jun, LIU Qin, HAN Guangjie, LI Chuanming, XIA Yang, LU Yurong, XU Jian.
- 粘虫颗粒体病毒增效蛋白在苏云金芽胞杆菌中的表达及增效活性
- Expression and synergistic activity of enhancin from Pseudaletia unipuncta granulovirus-Ps in Bacillus thuringiensis
- 微生物学报, 63(4): 1460-1471
- Acta Microbiologica Sinica, 63(4): 1460-1471
-
文章历史
- 收稿日期：2022-08-08
- 网络出版日期：2022-10-18
引用本文 |
2. 扬州绿源生物化工有限公司, 江苏 扬州 225008
2. Yangzhou Luyuan Bio-Chemical Company Limited, Yangzhou 225008, Jiangsu, China
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是重要的生物防治因子，在形成芽胞的同时能够合成具有特异杀虫活性的杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs)，在农业、林业及卫生害虫的防治中得到了广泛的应用[1]。但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、毒力低等缺点，通过生物技术手段构建高效广谱的Bt工程菌成为国内外微生物农药发展的重要方向[2-3]。Hu等[4]通过将几丁质酶和Cry2Aa共表达，可以增强Bt对棉铃虫(Helicoverpa armigera)的杀虫活性。Chen等[5]的研究发现，将蜘蛛毒素和Cry1Ac融合表达可以增强Bt对多种鳞翅目害虫、螨虫和线虫的杀虫活性。因此，在Bt中表达外源蛋白以提高其杀虫活性、拓宽其杀虫谱具有可行性。
研究表明，转宿主粘虫颗粒体病毒(Pseudaletia unipuncta granulovirus-Ps, PuGV-PS)可以增强Bt的杀虫活性[6-7]，Xu等[8]进一步证明了增效蛋白(enhancin, En)是PuGV-Ps起增效作用的主要成分。增效蛋白是一类由杆状病毒基因编码的金属蛋白酶，其分子量大小通常为89−110 kDa，可以降解寄主昆虫肠粘蛋白(insect intestinal mucin, IIM)，进而增加中肠围食膜(peritrophic matrix, PM)的通透性，促进病毒粒子的感染[9-10]。Yin等[11]对增效蛋白锌离子结合域的氨基酸残基进行定点突变，可以显著减弱其增效活性，证明了其金属蛋白酶的特性。此外，在核型多角体病毒(nuclearpolyhedrosisvirus, NPV)和痘病毒(entomopxvirus, EPV)中也鉴定出增效蛋白及其同源蛋白[12-13]。增效蛋白不仅能提高多种NPV的侵染能力[14-15]，还可以增强Bt的杀虫活性[6, 16-17]。
虽然原核表达的增效蛋白对Bt具有增效活性，但由于其分子量较大，重组表达具有一定难度，限制了对增效蛋白的深入研究与利用。Han等[18]通过对截短后的PuGV-Ps增效蛋白活性进行分析，发现缺失N端M60-like结构域或C端糖蛋白结合域的增效蛋白依然具有增效活性。但是由于原核表达具有较高的生产成本，而无法大规模应用到生产中，需要探索增效蛋白应用的新途径。因此，本研究通过对PuGV-Ps截短后的增效蛋白基因序列进行优化，分析增效蛋白在Bt中的表达水平及对Bt的增效活性，探索增效蛋白基因的合理利用途径，为构建高效的Bt工程菌提供理论支持。
1 材料与方法 1.1 实验材料本研究用的菌株和质粒信息见表 1。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Top10和ET分别用于进行分子克隆和质粒去甲基化实验，并在37 ℃条件下培养。Bt库斯塔克亚种(B. thuringiensis subsp. kurstaki, Btk)野生株HD73和无晶体突变株HD73‒，在30 ℃条件下培养。小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫为实验室人工利用小青菜幼苗饲养，温度25 ℃，相对湿度60%−70%，光周期14L: 10D。
| Strains and plasmids | Characterization | Resource |
| Escherichia coli strains | ||
| E. coli Top10 | Molecular clone | Lab stock |
| E. coli ET | Demethylation | Lab stock |
| Bacillus thuringiensis strains | ||
| HD73 | Wild type containing cry1Ac gene | Lab stock |
| HD73‒ | Acrystalliferous mutant strain | Lab stock |
| HD‒ (RHCoEn81) | HD73‒ with recombinant vector pHTRHCoEn81 | This study |
| HD‒ (NCCoEn81) | HD73‒ with recombinant vector pHTNCCoEn81 | This study |
| HD‒ (Pcry1AcCoEn81) | HD73‒ with recombinant vector pHTPcry1AcCoEn81 | This study |
| HD‒ (Pcry8ECoEn81) | HD73‒ with recombinant vector pHTPcry8ECoEn81 | This study |
| Plasmids | ||
| pHT315 | Expression vector, 6.5 kb, A+, E+ | Lab stock |
| pHTRHCoEn81 | pHT315 containing CoEn81 and cry1Ac | This study |
| pHTNCCoEn81 | pHT315 containing CoEn81 and part of cry1Ac | This study |
| pHTPcry1AcCoEn81 | pHT315 containing Pcry1Ac and CoEn81 | This study |
| pHTPcry8ECoEn81 | pHT315 containing Pcry8E and CoEn81 | This study |
1.2 增效蛋白基因优化
根据前期PuGV-Ps增效蛋白结构域分析结果[18]，选取C端糖蛋白结合域缺失的增效蛋白序列(En81)进行密码子优化。利用在线数据库Codon Usage Databass (http://www.kazusa.or.jp/codon/)获取Btk的密码子使用频率表，利用在线软件DNAWorks (https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/)对增效蛋白密码子进行优化。优化后的增效蛋白基因序列(CoEn81)经通用生物系统(安徽)有限公司进行人工合成，合成后的序列克隆至质粒pUC57中(pUC57-CoEn81)用于后续表达载体构建。
1.3 PCR扩增选用TaKaRa公司的PrimeStar酶，扩增程序为：98 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 kb/min，30个循环；72 ℃ 10 min。引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成，引物序列见表 2。
| Primer names | Sequences (5′→3′) | Restriction sites |
| 1AcPF | GACCATGATTACGCCAAGCTTTTGCAGGTAAATGGTTCTAACATGT | Hind Ⅲ |
| 1AcPR | CGGAACAATTACCTTATAACTCATAAGTTACCTCCATCTCTTTTATTA | |
| 1AcR | GGAACAATTACCTTATAACTCATTTCCTCCATAAGGAGTAATTCCAC | |
| RHF | GTGGAATTACTCCTTATGGAGGAAATGAGTTATAAGGTAATTGTTCC | |
| RHR | TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCTAACTGTAGTTGTCTAGGAAAGC | EcoR Ⅰ |
| 1Ac5′ | CGGAACAATTACCTTATAACTCATAATTGGATATCTTCTACTATCATA | |
| 1Ac3′ | GCAGCTTTCCTAGACAACTACAGTGTCATTAAAAATGGTGATTTTAAT | |
| 1AcTF | GCTTTCCTAGACAACTACAGTTAATCTCATGCAAACTCAGGTTTAAAT | |
| 1AcTR | AAATAAAGCACTAATAGGGTGTTTTTGGAATTCACTGGCCGTCGTTTT | EcoR Ⅰ |
| PT1 | TAATAAAAGAGATGGAGGTAACTTATGAGTTATAAGGTAATTGTTCCG | |
| PT2 | ATTTAAACCTGAGTTTGCATGAGATTAACTGTAGTTGTCTAGGAAAGC | |
| PT3 | ATCTTGTGTATGTATAGGAGGAAAATAGATGGATAACAATCCGAACATCAATG | |
| 8EPF | GACCATGATTACGCCAAGCTTAATGCACCTCCAATTGTTAATTATGT | Hind Ⅲ |
| 8EPR | CATTGATGTTCGGATTGTTATCCATCTATTTTCCTCCTATACATACACAAGAT | |
| gatB F | AGCTGGTCGTGAAGACCTTG | |
| gatB R | CGGCATAACAGCAGTCATCA | |
| qcry1Ac F | CGCAGAATCTTTTAGAGAGTGG | |
| qcry1Ac R | CATGTCATTGAATTGAATACGC | |
| qCoEn81 F | GCAATCTTCCTAACAAAGCAGCAT | |
| qCoEn81 R | CGTTGGACTAATTCGCAAATAATC |
1.4 增效蛋白表达载体构建
增效蛋白表达载体的构建过程如图 1所示。
|
| 图 1 重组质粒pHTRHCoEn81、pHTNCCoEn81、pHTPcry1AcCoEn81和pHTPcry8ECoEn81的构建 Figure 1 Construction of recombinant plasmids pHTRHCoEn81, pHTNCCoEn81, pHTPcry1AcCoEn81, and pHTPcry8ECoEn81. |
1.4.1 增效蛋白与Cry1Ac融合表达
以HD73基因组为模板，1AcPF/1AcR为引物，扩增Cry1Ac启动子区域及编码区(无终止密码子)的片段3 925 bp (cry)。以质粒pUC57-CoEn81为模板，RHF/RHR为引物，扩增增效蛋白基因2 103 bp (CoEn81-1)。以扩增产物cry和CoEn81-1为模板，1AcPF/RHR为引物，进行重叠PCR，扩增cry和CoEn81-1融合片段6 028 bp (RHCoEn81)。质粒pHT315经限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切后，利用同源重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)与融合片段RHCoEn81进行连接，连接产物转化至Top10菌株中，经测序正确后，提取重组质粒pHTRHCoEn81。重组质粒经ET菌株去甲基化后，电击转化至HD73‒菌株中，获得重组菌HD‒ (RHCoEn81)。
1.4.2 增效蛋白与Cry1Ac N端和C端融合表达以HD73基因组为模板，1AcPF/1Ac5′为引物，扩增Cry1Ac启动子区域及N端序列1 186 bp (cryN)；1Ac3′/1AcTR为引物，扩增Cry1Ac C端及终止子序列934 bp (cryC)。以质粒pUC57- CoEn81为模板，NCF/NCR为引物，扩增增效蛋白基因2 100 bp (CoEn81-2) (无终止密码子)。分别以扩增产物cryN、CoEn81-2、cryC为模板，1AcPF/1AcTR为引物，进行重叠PCR，获得融合片段4 172 bp (NCCoEn81)。质粒pHT315经限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切后，利用同源重组与融合片段NCCoEn81进行连接，连接产物转化至Top10菌株中，经测序正确后，提取重组质粒pHTNCCoEn81。重组质粒经ET菌株去甲基化后，电击转化至HD73‒菌株中，获得重组菌HD‒ (NCCoEn81)。
1.4.3 cry1Ac启动子指导增效蛋白表达以HD73基因组为模板，1AcPF/1AcPR为引物，扩增cry1Ac启动子区域415 bp (Pcry1Ac)；以1AcTF/1AcTR为引物，扩增cry1Ac终止子区域328 bp (Tcry1Ac)。以质粒pUC57-CoEn81为模板，PT1/PT2为引物，扩增增效蛋白基因2 103 bp (CoEn81-3)。分别以扩增产物Pcry1Ac、CoEn81-3、Tcry1Ac为模板，1AcPF/1AcTR为引物，进行重叠PCR，获得融合片段2 798 bp (Pcry1AcCoEn81)。质粒pHT315经限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切后，利用同源重组与融合片段Pcry1AcCoEn81进行连接，连接产物转化至Top10菌株中，经测序正确后，提取重组质粒pHTPcry1AcCoEn81。重组质粒经ET菌株去甲基化后，电击转化至HD73‒，获得重组菌HD‒ (Pcry1AcCoEn81)。
1.4.4 cry8E启动子指导增效蛋白表达以HD (Pcry8E-lacZ)基因组为模板，8EPF/8EPR为引物，扩增cry8E启动子区域891 bp (Pcry8E)。以HD (Pcry1AcCoEn81)基因组为模板，PT3/1AcTR为引物，扩增包含cry1Ac终止子在内的增效蛋白基因2 435 bp (CoEn81-4)。以扩增产物Pcry8E和CoEn81-4为模板，8EPF/1AcTR为引物，进行重叠PCR，获得融合片段3 272 bp (Pcry8ECoEn81)。质粒pHT315经限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切后，利用同源重组与融合片段Pcry8ECoEn81进行连接，连接产物转化至Top10菌株中，经测序正确后，提取重组质粒pHTPcry8ECoEn81。重组质粒经ET菌株去甲基化后，电击转化至HD73‒菌株中，获得重组菌HD‒ (Pcry8ECoEn81)。
1.5 增效蛋白抗体制备增效蛋白抗体由南京钟鼎生物技术有限公司制备。利用前期原核表达得到的重组增效蛋白[18]，免疫2只新西兰白兔(2.0−2.5 kg)，皮下免疫400 μg/次，2−3周免疫1次，待抗血清针对重组增效蛋白的效价大于1:50 000时进行采血，制备抗血清。将重组增效蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4 ℃透析过夜，−80 ℃保存备用。
1.6 重组菌的蛋白表达检测重组菌经SSM培养基(8 g/L营养肉汤，0.12 g/L MgSO4，1 g/L KCl，0.5 mmol/L NaOH，25 μg/mL红霉素)培养25 h后(此时芽胞和晶体已经形成，但是菌体未裂解)，取50 mL培养液，10 000 r/min离心2 min，弃上清，加入5 mL无菌水重悬菌体。菌悬液采用BioSafer超声破碎仪，强度10%，3 s/5 s，运行5 min经超声破碎后，取100 μL破碎液10 000 r/min离心5 min，保留上清液备用，沉淀加入100 μL无菌水重悬备用。分别取破碎液、上清液、重悬液各100 μL，加入25 μL 0.5 mmol/L的NaOH溶液，室温放置5 min后，加入75 μL 3×上样缓冲液。100 ℃煮沸10 min，10 000 r/min离心5 min后，取上清液10 μL分别进行Western blotting和SDS-PAGE检测。
1.7 实时荧光定量PCR重组菌在SSM培养基中培养至T0和T8时，采用TRIzol (Invitrogen)法提取总RNA。使用gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa)将纯化的RNA逆转录为cDNA。选择gatB作为内参基因[19]，采用的特异引物见表 2。采用TaKaRa公司的定量试剂盒TB Green Fast qPCR Mix和ABI公司的StepOnePlus实时PCR系统进行实时定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR)。实验设置3个技术重复和3个生物学重复，验证引物的特异性和扩增效率，并采用2−ΔΔCT法计算增效蛋白基因的相对表达量。
1.8 重组增效蛋白的纯化挑取单菌落于5 mL SSM培养基中，220 r/min、30 ℃过夜培养，将母液按1:100的比例加入到50 mL新鲜的SSM培养基中，220 r/min、30 ℃培养至母细胞完全裂解。取培养液10 000 r/min离心10 min，弃上清，分别用2 mol/L和3 mol/L的尿素充分洗涤沉淀，最后用8 mol/L的尿素溶解沉淀。将含有重组蛋白的尿素溶液，加入到半透膜中，依次放入到6、4、2、1、0.5、0 mol/L的尿素溶液中，分别在4 ℃中孵育12 h进行复性，复性后的重组增效蛋白置于−80 ℃保存。
1.9 生物测定菌株HD73在发酵培养基(2%淀粉，4.5%豆饼粉，2.0%玉米浆，0.1% MgSO4，0.1% CaCO4，0.1% KH2PO4)中，220 r/min、30 ℃培养至晶体蛋白完全释放。发酵液经梯度稀释至4、2、1、0.5、0.25 mL/L后，取4 cm×4 cm大小的青菜叶片，完全浸渍于稀释液中5 min。同时，另取一组发酵稀释液，每个浓度梯度加入终浓度为500 μg/L的重组增效蛋白，以相同的方法处理青菜叶片。取出叶片置于操作台上，晾至无水渍后，将叶片放于直径为90 mm培养皿，每皿接入20头3龄小菜蛾幼虫，放置于25 ℃恒温培养箱中，48 h后检查试虫死亡情况。LC50值和95%置信区间(confidence intervals, CIs)的分析采用PoloPlus软件[20]。致死中浓度比值(LC50 ratio, LCR)的置信区间不包含1时，表明LC50值是具有显著性差异的(P < 0.05)。
2 结果与分析 2.1 PuGV-Ps增效蛋白密码子优化截短后增效蛋白基因序列长度为2 100 bp，编码700个氨基酸，利用在线工具Compute pI/Mw估算其蛋白大小为81 kDa。密码子未优化增效蛋白基因(En81)的GC含量为47%，密码子优化后增效蛋白基因(CoEn81)的GC含量为38% (图 2)。
|
| 图 2 截短后的PuGV-Ps增效蛋白密码子优化 Figure 2 Codon optimization of short-enhancin. A: En81. B: CoEn81. |
2.2 重组PuGV-Ps增效蛋白质粒构建
经PCR检测，目的条带大小正确，表明增效蛋白与Cry1Ac融合表达载体pHTRHCoEn81、增效蛋白与Cry1Ac N端和C端融合表达载体pHTNCCoEn81、cry1Ac启动子指导增效蛋白表达载体pHTPcry1AcCoEn81和cry8E启动子指导增效蛋白表达载体pHTPcry8ECoEn81均构建成功(图 3)。
|
| 图 3 PCR检测重组PuGV-Ps增效蛋白质粒 Figure 3 The recombinant plasmids were detected by PCR. M: Marker; Lane 1: pHTRHCoEn81; Lane 2: pHTNCCoEn81; Lane 3: pHTPcry1AcCoEn81; Lane 4: pHTPcry8ECoEn81. |
2.3 重组PuGV-Ps增效蛋白表达检测
重组质粒pHTRHCoEn81、pHTNCCoEn81、pHTPcry1AcCoEn81分别转入HD73−中获得重组菌HD‒ (RHCoEn81)、HD‒ (NCCoEn81)和HD‒ (Pcry1AcCoEn81)。重组增效蛋白RHCoEn81、NCCoEn81和CoEn81 (Pcry1Ac)分子量大小分别约为214、134、81 kDa，经Western blotting检测后，均表达成功(图 4A)，但是SDS-PAGE检测不到重组增效蛋白RHCoEn81的表达(图 4B)。
|
| 图 4 重组PuGV-Ps增效蛋白表达检测 Figure 4 Expression detection of recombinant proteins by western blotting (A) and SDS-PAGE (B). M: Marker; Lane 1 and 4: RHCoEn; Lane 2 and 5: NCCoEn81; Lane 3 and 6: Pcry1AcCoEn81; Lane 7: Cry1Ac; Lane 8: En-BL21. The recombinant enhancin in lanes 5 and 6 were marked with blue and red arrows, respectively. |
2.4 PuGV-Ps增效蛋白在Bt中的表达水平分析
实时定量PCR结果显示，在T0和T8时，cry1Ac的表达量分别是启动子Pcry1Ac指导下CoEn81表达量的3.6倍和2.6倍，是启动子Pcry8E指导下CoEn81表达量的2.9倍和2.3倍；启动子Pcry1Ac和Pcry8E指导下CoEn81的表达量无显著性差异(图 5A)。通过对HD‒ (Pcry1AcCoEn81)和HD‒ (Pcry8ECoEn81)中增效蛋白的产量分析可知，增效蛋白在Bt中以包涵体的形式存在，2种启动子指导下的增效蛋白产量无差异，但产量均低于Cry1Ac (图 5B)。
|
| 图 5 PuGV-Ps增效蛋白在Bt中的表达水平 Figure 5 Expression level analysis of enhancin in Bt by qPCR (A) and SDS-PAGE (B). T0 is the end of the exponential phase and Tn is n hours after the end of the exponential phase. Three technical replicates and three biological replicates were performed. Error bars represent one standard error of the mean, P < 0.05. *: Significant difference, P < 0.05. ns: No significant difference, P > 0.05. M: Marker; Lane 1: En-BL21; Lane 2 and 3: Cry1Ac; Lane 4 and 5: Pcry1AcCoEn81; Lane 6 and 7: Pcry8ECoEn81. Lane 2, 4 and 6 are sediment; Lane 3, 5 and 7 are supernatant. |
2.5 PuGV-Ps增效蛋白对Bt的增效活性分析
对小菜蛾的生物测定结果表明，HD73的LC50值为1.004 μL/L，而添加终浓度为500 μg/L的重组增效蛋白后，其LC50值降低为0.269 μL/L (表 3)。平等性假设(hypothesis of equality)通过(P < 0.05)，而平行性假设(hypothesis of parallelism)未通过(P > 0.05)，表明2条毒力回归曲线平行不相等(图 6，表 3)。致死终浓度比值(LCR)为0.268，95%置信区间为0.210−0.341，不包含1，表明2个LC50值具有显著性差异。因此，重组增效蛋白可以增强Bt对小菜蛾的杀虫活性。
| Strain | LC50 (95% CI) (μL/L) | Slope±SE | χ2 (df) | LCR50 (95% CI) | Hypothesis of equality (χ2, P) | Hypothesis of parallelism (χ2, P) |
| HD73 | 1.004 (0.852−1.186) | 2.382±0.234 | 2.037 (3) | ‒ | ‒ | ‒ |
| HD73+CoEn81 | 0.269 (0.227−0.323) | 2.245±0.228 | 2.030 (3) | 0.268 (0.210−0.341) | 78.43, 0.001 | 0.17, 0.676 |
| ‒: No data. | ||||||
|
| 图 6 Bt对小菜蛾的毒力回归曲线 Figure 6 Toxicity regression curve of Bt to Plutella xylostella. |
3 讨论与结论
Bt是应用最为广泛的杀虫细菌，构建转增效蛋白工程菌可以有效提高Bt的杀虫活性。不同颗粒体病毒的增效蛋白N端同源性大于C端[21]，其N端含有锌离子结合域(HEXXH)，具有金属蛋白酶活性，去除C端糖蛋白结合域的增效蛋白依然具有增效活性，同时，截短后的增效蛋白具有较高的表达量[18]。多种颗粒体病毒的增效蛋白均可以通过大肠杆菌表达系统成功表达，且对Bt具有增效活性[8, 22]，但尚未有在Bt中成功表达增效蛋白的报道。本研究构建了增效蛋白及其融合蛋白的表达载体，并成功地在Bt中表达了分子量分别为81、134、214 kDa的重组蛋白，其中与Cry1Ac共表达的分子量为214 kD的融合蛋白，由于融合蛋白过大，导致表达量太低，利用SDS-PAGE无法检测到其表达。
重组蛋白分子量大小会影响外源基因在Bt中表达，而密码子偏爱性、mRNA稳定性、启动子活性等同样也是影响外源蛋白表达量变化的主要因素[23-25]。密码子优化策略是解决密码子偏好性最常用的方法，主要是将目的基因密码子与宿主基因组中具有最高频率的同义密码子进行替换[26-27]。前期研究发现，未优化的增效蛋白基因无法在Bt中表达(数据未显示)，因此本研究通过获取Bt密码子使用频率表，对截短后的PuGV-Ps增效蛋白密码子进行优化，消除了密码子偏爱性对增效蛋白表达量的影响。此外，本研究还引入了杀虫基因cry1Ac的终止子序列，用于增强增效蛋白mRNA稳定性。终止子含有富含GC的反向重复序列，能够形成稳定的茎环结构，通过阻止核酸外切酶对mRNA的降解，增加mRNA的稳定性，促进目标基因的表达[23, 25]。
Bt中不同启动子指导的cry基因的表达量是不同的。Bt中强启动子Pcry1Ac为重叠的双启动子Bt Ⅰ和Bt Ⅱ，二者分别由σE和σK调控，是芽胞依赖型启动子，可以指导多种Cry蛋白的异源表达[23, 28]。启动子Pcry8E受σH调控，是一个营养期表达的弱启动子，但是其指导下的Cry1Ac的表达量要高于Pcry1Ac指导下Cry1Ac的表达量[29-30]。本研究分别利用启动子Pcry1Ac和Pcry8E指导增效蛋白表达，结果表明，在2种启动子的指导下，增效蛋白虽然可以成功表达，但是其表达量显著低于Cry1Ac的表达量。因此，我们推测，增效蛋白为非Bt源蛋白，不同于Cry蛋白，能够指导Cry蛋白高表达的启动子并不一定可以指导非Bt源蛋白的高表达。
枯草芽孢杆菌(B. subtilis, Bs)具有非致病性、分泌蛋白能力强等特性，是异源表达的理想宿主，同时关于其启动子的研究也较为深入[31]。Bs含有的主要转录因子有Spo0A、σH、σF、σE、σG和σK等，这些转录因子间存在级联调节机制，Bt中也存在类似的机制[32]。因此，根据Bs和Bt转录调控存在一定相似性，利用Bs中的高效启动子，在Bt中表达外源蛋白具有一定可行性。接下来我们会筛选Bs中的强启动子，在Bt中验证其对增效蛋白的表达水平，进一步构建高效表达增效蛋白的Bt工程菌。
致谢
感谢中国农科院植物保护研究所提供的菌株和质粒。
| [1] | SCHNEPF E, CRICKMORE N, van RIE J, LERECLUS D, BAUM J, FEITELSON J, ZEIGLER DR, DEAN DH. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR, 1998, 62(3): 775-806. DOI:10.1128/MMBR.62.3.775-806.1998 |
| [2] |
LIU P, XIA LQ, HU SB, YAN L, DING XZ, ZHANG YM, YU ZN. Site-specific integration of heterologous gene into Bacillus thuringiensis chromosome and its expression. Acta Microbiologica Sinica, 2008, 48(5): 661-666.
(in Chinese) 刘萍, 夏立秋, 胡胜标, 严礼, 丁学知, 张友明, 喻子牛. 外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达. 微生物学报, 2008, 48(5): 661-666. DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2008.05.014 |
| [3] | LUCENA WA, PELEGRINI PB, MARTINS-de-SA D, FONSECA FCA, GOMES JE Jr, de MACEDO LLP, da SILVA MCM, OLIVEIRA RS, GROSSI-de-SA MF. Molecular approaches to improve the insecticidal activity of Bacillus thuringiensis Cry toxins. Toxins, 2014, 6(8): 2393-2423. DOI:10.3390/toxins6082393 |
| [4] | HU SB, ZHANG X, LI YS, DING XZ, HU XF, YANG Q, XIA LQ. Constructing Bacillus thuringiensis strain that co-expresses Cry2Aa and chitinase. Biotechnology Letters, 2013, 35(7): 1045-1051. DOI:10.1007/s10529-013-1171-0 |
| [5] |
CHEN JJ, LIU F, LIAO XQ, ZHANG ZG, MIN Y, RAO B, YANG ZW, ZHOU RH, LIU XY. Fusion expression and insecticidal activity of two spider toxin peptides with Cry1Ac protein from Bacillus thuringiensis. Chinese Journal of Biological Control, 2018, 34(6): 838-847.
(in Chinese) 陈珺君, 刘芳, 廖先清, 张志刚, 闵勇, 饶犇, 杨自文, 周荣华, 刘晓艳. 两种蜘蛛毒素肽与苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白的融合表达及杀虫活性. 中国生物防治学报, 2018, 34(6): 838-847. DOI:10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.06.006 |
| [6] |
XU J, LIU Q, TAN YA, ZHU SD. Synergistic effects of Pseudaletia unipuncta granulosis virus (PuGV-Ps) on Bacillus thuringiensis (Bt) and the involved degradation of Bt toxins. Acta Entomologica Sinica, 2008, 51(1): 26-32.
(in Chinese) 徐健, 刘琴, 谭永安, 祝树德. 粘虫颗粒体病毒对苏云金杆菌的增效特性及对Bt毒蛋白的降解活化作用. 昆虫学报, 2008, 51(1): 26-32. |
| [7] |
LIU Q, MA TB, QI JH, SHI JD, LI CM, XU J. Damaging effects of PuGV-ps and Bacillus thuringiensis on peritrophic membrane of Spodoptera exigua. Chinese Journal of Biological Control, 2011, 27(2): 182-187.
(in Chinese) 刘琴, 马谈斌, 祁建杭, 施建德, 李传明, 徐健. 苏云金芽胞杆菌毒素蛋白和粘虫颗粒体病毒对甜菜夜蛾中肠围食膜的破坏作用. 中国生物防治学报, 2011, 27(2): 182-187. |
| [8] |
XU J, ZHAO S, LIU Q, YANG Q, LI CM. Expression of enhancin gene from Pseudaletia unipuncta granulovirus-ps in Escherichia coli and bioassay of its activity. Chinese Journal of Biological Control, 2013, 29(3): 389-394.
(in Chinese) 徐健, 赵松, 刘琴, 杨青, 李传明. 转宿主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因的克隆表达及活性. 中国生物防治学报, 2013, 29(3): 389-394. DOI:10.16409/j.cnki.2095-039x.2013.03.005 |
| [9] | WANG ML, WANG J, YIN FF, TAN Y, DENG F, CHEN XW, JEHLE JA, VLAK JM, HU ZH, WANG HL. Unraveling the entry mechanism of baculoviruses and its evolutionary implications. Journal of Virology, 2014, 88(4): 2301-2311. DOI:10.1128/JVI.03204-13 |
| [10] | ERLANDSON MA, TOPRAK U, HEGEDUS DD. Role of the peritrophic matrix in insect-pathogen interactions. Journal of Insect Physiology, 2019, 117: 103894. DOI:10.1016/j.jinsphys.2019.103894 |
| [11] |
YIN J, SHAN L, SONG DX, ZHONG J. Site-directed mutagenesis of the zinc-binding domain of Trichoplusia ni granulovirus enhancin. Acta Entomologica Sinica, 2007, 50(11): 1111-1115.
(in Chinese) 尹隽, 单梁, 宋大新, 钟江. 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白锌离子结合域定点突变. 昆虫学报, 2007, 50(11): 1111-1115. DOI:10.3321/j.issn:0454-6296.2007.11.005 |
| [12] | LI LL, DONLY C, LI QJ, WILLIS LG, KEDDIE BA, ERLANDSON MA, THEILMANN DA. Identification and genomic analysis of a second species of nucleopolyhedrovirus isolated from Mamestra configurata. Virology, 2002, 297(2): 226-244. DOI:10.1006/viro.2002.1411 |
| [13] | XU JH, HUKUHARA T. Biochemical properties of an enhancing factor of an entomopoxvirus. Journal of Invertebrate Pathology, 1994, 63(1): 14-18. DOI:10.1006/jipa.1994.1003 |
| [14] | HOOVER K, HUMPHRIES MA, GENDRON AR, SLAVICEK JM. Impact of viral enhancin genes on potency of Lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus in L. dispar following disruption of the peritrophic matrix. Journal of Invertebrate Pathology, 2010, 104(2): 150-152. DOI:10.1016/j.jip.2010.02.008 |
| [15] | RICARTE-BERMEJO A, SIMÓN O, FERNÁNDEZ AB, WILLIAMS T, CABALLERO P. Bacmid expression of granulovirus enhancin En3 accumulates in cell soluble fraction to potentiate nucleopolyhedrovirus infection. Viruses, 2021, 13(7): 1233. DOI:10.3390/v13071233 |
| [16] | GUO W, KAIN W, WANG P. Effects of disruption of the peritrophic membrane on larval susceptibility to Bt toxin Cry1Ac in cabbage loopers. Journal of Insect Physiology, 2019, 117: 103897. DOI:10.1016/j.jinsphys.2019.103897 |
| [17] | GRANADOS RR, FU Y, CORSARO B, HUGHES PR. Enhancement of Bacillus thuringiensis toxicity to lepidopterous species with the enhancin from Trichoplusia ni granulovirus. Biological Control, 2001, 20(2): 153-159. DOI:10.1006/bcon.2000.0891 |
| [18] |
HAN GJ, LIU Q, XU BB, WANG JJ, QI JH, LI CM, XU J. Optimized expression and functional analysis of enhancin gene from Pseudaletia unipuncta granulovirus (PuGV-Ps). Acta Microbiologica Sinica, 2016, 56(9): 1459-1467.
(in Chinese) 韩光杰, 刘琴, 徐贝贝, 王建军, 祁建杭, 李传明, 徐健. 粘虫颗粒体病毒增效蛋白基因片段优化及功能. 微生物学报, 2016, 56(9): 1459-1467. |
| [19] | REITER L, KOLSTØ AB, PIEHLER AP. Reference genes for quantitative, reverse-transcription PCR in Bacillus cereus group strains throughout the bacterial life cycle. Journal of Microbiological Methods, 2011, 86(2): 210-217. |
| [20] | STRAUS DL. Copper sulfate toxicity to channel catfish fry: Yolk sac versus swim-up fry. North American Journal of Aquaculture, 2008, 70(3): 323-327. |
| [21] | ROELVINK PW, CORSARO BG, GRANADOS RR. Characterization of the Helicoverpa armigera and Pseudaletia unipuncta granulovirus enhancin genes. The Journal of General Virology, 1995, 76(Pt 11): 2693-2705. |
| [22] |
YUAN ZM, CHEN HT, LIANG CC. Synergism of recombinant enhancin to Bacillus thuringiensis and cypermethrin against the larvae of Helicoverpa armigera. Chinese Journal of Biological Control, 2006, 22(3): 194-197.
(in Chinese) 袁哲明, 陈浩涛, 梁晨彩. 重组增效蛋白对Bt和氯氰菊酯防治棉铃虫的增效作用. 中国生物防治, 2006, 22(3): 194-197. |
| [23] |
ZHENG W, YE WX, PENG DH, SUN M. Construction of Bacillus thuringiensis expression vector by using regulatory elements from cry1Ac gene. Hubei Agricultural Sciences, 2012, 51(2): 400-405.
(in Chinese) 郑文, 叶伟星, 彭东海, 孙明. 基于cry1Ac表达调控元件的苏云金芽孢杆菌表达载体构建. 湖北农业科学, 2012, 51(2): 400-405. |
| [24] |
ZHOU CF, PENG DH, QIU DW, ZHOU K, RUAN LF, CHEN SW, YU ZN, SUN M. Expressing activator protein Ap36 in Bacillus thuringiensis and the function of recombined strain on disease resistance. Journal of Agricultural Biotechnology, 2008, 16(1): 142-147.
(in Chinese) 周臣飞, 彭东海, 邱德文, 周康, 阮丽芳, 陈守文, 喻子牛, 孙明. 植物激活蛋白Ap36在苏云金芽胞杆菌的表达及抗病作用. 农业生物技术学报, 2008, 16(1): 142-147. |
| [25] | WONG HC, CHANG S. Identification of a positive retroregulator that stabilizes mRNAs in bacteria. International Journal of Computational Biology and Drug Design, 1986, 83(10): 3233-3237. |
| [26] |
YANG YP, MA XY, HUO YX. Application of codon optimization strategy in heterologous protein expression. Chinese Journal of Biotechnology, 2019, 35(12): 2227-2237.
(in Chinese) 杨云彭, 马晓焉, 霍毅欣. 密码子优化策略在异源蛋白表达中的应用. 生物工程学报, 2019, 35(12): 2227-2237. |
| [27] | QUAX TEF, CLAASSENS NJ, SÖLL D, van der OOST J. Codon bias as a means to fine-tune gene expression. Molecular Cell, 2015, 59(2): 149-161. |
| [28] | SEDLAK M, WALTER T, ARONSON A. Regulation by overlapping promoters of the rate of synthesis and deposition into crystalline inclusions of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins. Journal of Bacteriology, 2000, 182(3): 734-741. |
| [29] | DU LX, QIU LL, PENG Q, LERECLUS D, ZHANG J, SONG FP, HUANG DF. Identification of the promoter in the intergenic region between orf1 and cry8Ea1 controlled by sigma H factor. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(12): 4164-4168. |
| [30] |
LI CR, DU LX, PENG Q, LIANG Y, GAO JG, ZHANG J, SONG FP. Construction of high-level expression vector for Bacillus thuringiensis. Microbiology China, 2013, 40(2): 350-361.
(in Chinese) 李朝睿, 杜立新, 彭琦, 梁影屏, 高继国, 张杰, 宋福平. 苏云金芽胞杆菌高效表达载体的构建. 微生物学通报, 2013, 40(2): 350-361. |
| [31] |
YU XX, TIAN J, LIU XQ, WU NF. Research progress of Bacillus subtilis expression system and its promoter regulatory elements. Biotechnology Bulletin, 2015, 31(2): 35-44.
(in Chinese) 余小霞, 田健, 刘晓青, 伍宁丰. 枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展. 生物技术通报, 2015, 31(2): 35-44. |
| [32] | LERECLUS D, AGAISSE H, GRANDVALET C, SALAMITOU S, GOMINET M. Regulation of toxin and virulence gene transcription in Bacillus thuringiensis. International Journal of Medical Microbiology, 2000, 290(4/5): 295-299. |