产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)是一种通过产生志贺毒素引起人畜共患病的肠道致病菌，能够导致人体水样腹泻、出血性肠炎等轻度肠道疾病，严重时可导致溶血性尿毒综合征，甚至死亡^[1-2]。STEC菌株属大肠埃希氏菌属，为革兰氏阴性菌，最适生长条件为37 ℃、pH为7.2−7.4、盐浓度为0.5% NaCl，对营养条件的要求不高，可在常规营养琼脂培养基上生长。stx是STEC中最主要的毒力基因，具有细胞毒性、肠毒性以及神经毒性等多种毒性^[3]。

STEC的传播途径多样，主要有食源传播、动物传播、水源传播等^[4]，从而导致大多食品原材料中携带此致病菌株。存在于食品加工环境中的病原体面临许多应激源，包括酸碱、干燥、低温冷冻和高渗透压等^[5]，面对不同胁迫环境压力，它们采用多种应激防御系统，以适应不同的生理状态和应激水平^[6]。比如，经过长期进化过程，STEC菌株进化出耐酸系统，使其在酸性环境下能够长时间生存^[7]；面对低温环境，STEC菌株仍能牢固地黏附在食品表面进行定殖^[8]。这些致病性菌株依靠自身应激机制，得以在食品加工过程中面对多种胁迫环境仍能长时间生存，且保持一定的致病力，从而对食品安全造成严重的安全隐患^[9-10]。

本文以产志贺毒素大肠杆菌为研究对象，选取了3株STEC菌株(ST462、ST378、D3146)研究其在不同pH值(pH 5.0、7.0、9.0)、不同盐浓度(0.5%、1.5%、2.5% NaCl)以及不同温度(10、25、37 ℃)生长环境条件下的生长状况以及不同条件下产生的毒素对细胞造成的损害程度，来探究不同胁迫环境对产志贺毒素大肠杆菌造成的应激反应，为STEC菌株在不良环境胁迫下的应激响应机制研究提供基础数据参考，同时也为食品行业在加工保藏方面如何避免或减少由STEC菌株感染引起的食品安全事件提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源和细胞来源

3株产志贺毒素大肠杆菌(编号为STEC 11、STEC 17、STEC 36)是本实验室筛选自市场零售牛肉，经形态学分析、生化特性以及分子生物学鉴定，由农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)保藏。菌株基本信息见表 1^[11]。

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)购于上海启达生物科技有限公司。

1.1.2 试剂

LB固体培养基(Luria-Bertani agar, LB)、EC液体培养基(E. coli broth, EC)购于北京陆桥技术责任有限公司；磷酸盐缓冲液、DMEM (1×)培养基、澳洲胎牛血清、0.25%胰酶购于Thermo Fisher公司；CCK-8试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；24孔板、96孔板购于Thermo Fisher公司。

1.1.3 主要仪器

二氧化碳培养箱(Herocell 180)购自上海润度生物科技有限公司；Bio Tek多功能酶标仪(Synergy2)购自伯腾仪器有限公司；恒温振荡器(bluepard HZQ-X300C)购自上海一恒科学仪器有限公司；研究级倒置显微镜(OLYMPUS IX71)购自上海江文国际贸易有限公司。

1.2 菌株活化及生长曲线的测定和拟合

将−80 ℃冻存的菌株接种于LB固体培养基上，37 ℃条件下振荡培养12 h，挑取单菌落于新鲜EC液体培养基中37 ℃、200 r/min条件下振荡培养6 h，再次接种在LB固体培养基上培养12 h，完成3次活化。

挑取完全活化的单菌落于配制好的不同胁迫条件(pH 5.0、7.0、9.0，盐浓度为0.5%、1.5%、2.5% NaCl)的EC液体培养基中，在恒温摇床中37 ℃振荡培养至菌液浓度达到8×10⁸ CFU/mL，其中低温胁迫条件为挑取单菌落于pH 7.0、盐浓度为0.5% NaCl的EC液体培养基，在恒温摇床中10、25、37 ℃条件下振荡培养至菌液浓度达到8×10⁸ CFU/mL。将菌液进行10倍梯度稀释后，移取定量1 mL菌液于装有9 mL新鲜相同胁迫条件EC液体培养基的试管中，于摇床中振荡培养，每隔2 h取出一支试管进行菌落平板计数，记录数据。每个生物学重复3次，每次3组平行实验。

通过微生物风险模型网站^[12]，采用一级生长模型中Gompertz模型对生长曲线数据进行拟合，记录最大比生长率(μ_max)和迟缓期(λ)值。

1.3 STEC毒素的提取

参照绘制的生长曲线，以相同的实验方法将菌株培养到对数期中期，取含有相同数量级菌量的菌液于离心管中，4 ℃、12 000×g条件下离心5 min；用0.22 μm过滤器过滤菌液，取上清，−20 ℃保存，备用^[13]。

1.4 细胞毒性实验^[14]

将液氮冻存条件下的Vero细胞复苏传代至旺盛状态，制备1×10⁵ cell/mL的单细胞悬液，于96孔板中铺板，37 ℃、5% CO₂条件的培养箱中过夜培养；取出96孔板，弃去培养基用1×PBS洗涤3次，加入100 µL新鲜细胞完全培养基，加入10 µL上清液待测样品37 ℃、5% CO₂条件下培养12 h；加入10 µL CCK-8溶液后放入培养箱培养2 h，待显色后在450 nm处测量其吸光值并记录。以无细胞且仅有完全培养基作为空白对照；以细胞和完全培养基为实验阴性对照。每个处理生物学重复3次。结果分析：细胞存活率C计算公式如下：

式中：T为检测孔OD值，T₀为空白组OD值，T_C为对照组OD值；检测孔OD值T为去除6个重复孔最值后的平均值，空白组T₀即为细胞完全培养液和CCK-8试剂，无细胞；对照组即为单细胞悬液和CCK-8试剂。

1.5 观察细胞损伤程度

将检测完吸光值的细胞孔板放置在倒置显微镜的载物台上，用40×物镜、10×目镜进行观察，并记录数据。

1.6 数据处理

实验数据均为3组平行，采用平均值±标准差表示。用MS Excel 2019对数据进行整理，用SPSS 25.0软件进行显著性分析(P < 0.01)，通过微生物生长模型网站进行数据拟合，通过Origin 2021软件进行作图分析及图片的整理。

2 结果与分析 2.1 不同胁迫下菌株的生长状况

在预测微生物学中，最大比生长率(μ_max)、迟缓期(λ)和最大菌浓度是一些模型的参数，用来描述单一环境条件下微生物生长随时间变化的数学模型，具有生物学意义^[15]。

2.1.1 pH胁迫

不同pH值胁迫生长环境下，STEC菌株的μ_max、λ、最大菌浓度受到显著影响。如图 1所示，相对于最适生长条件pH 7.0，在pH 5.0和pH 9.0胁迫条件下的STEC菌株中，除pH 5.0条件下菌株ST378的μ_max和pH 9.0条件下菌株ST462的λ无差异显著，菌株的μ_max降低且λ延长，差异显著(P < 0.01)。此外，不同pH值条件下STEC菌株生长的最大菌浓度差异显著，在pH 5.0和pH 9.0胁迫条件下STEC生长的最大菌浓度均低于pH 7.0条件下的值(图 2)。其中pH 5.0条件下菌株生长受到抑制，最大菌浓度只达到pH 7.0条件下的一半甚至更少；而pH 9.0胁迫下菌株的生长状态处于两者之间。结果表明菌株在偏酸、偏碱的胁迫环境中生长受到抑制，但仍能够生长。

2.1.2 盐胁迫

不同浓度盐胁迫生长环境下，随着盐浓度的增加，STEC菌株μ_max降低、λ延长，且最大菌浓度降低(图 3)。相较于0.5% NaCl条件，在1.5% NaCl和2.5% NaCl条件下，除了1.5% NaCl条件下ST378菌株的μ_max和2.5% NaCl条件下ST462的λ无差异显著，STEC菌株的μ_max降低和λ延长，差异显著(P < 0.01)；此外，1.5% NaCl和2.5% NaCl胁迫条件下STEC菌株受到不同程度抑制，其中菌株ST462、ST378的最大菌浓度低于0.5% NaCl条件下的值，其中2.5% NaCl条件下STEC的最大菌浓度只达到最适条件0.5% NaCl条件下最大菌浓度的一半(图 4)。结果表明，STEC能在一定浓度盐胁迫环境下生长，但随着盐浓度增加生长抑制加重。

2.1.3 温度胁迫

环境温度的变化对STEC菌株生长同样具有一定的影响，低温环境下STEC菌株主要表现为μ_max降低、λ变长。经过较长时间的迟缓期，STEC适应低温环境后能够继续生长，且最大菌浓度高于最适温度37 ℃。如图 5所示，相较于37 ℃生长条件，10 ℃和25 ℃条件下STEC菌株的μ_max降低和延长，差异显著(P < 0.01)。此外，不同温度条件下，STEC菌株生长达到的最大菌浓度不同，10 ℃和25 ℃条件下STEC菌株的最大菌浓度均明显高于37 ℃条件下的值。另外，除了菌株ST462，25 ℃条件下菌株的最大菌浓度高于10 ℃条件下的值(图 6)。结果表明，生长环境温度对STEC菌株生长具有一定的影响，且低温环境胁迫后，STEC菌株的最大菌浓度有所增长。

2.2 细胞毒性实验

本研究提取了不同胁迫生长环境下STEC菌株所产生的毒素来侵染Vero细胞，测定细胞活力并观察细胞的损害程度。

2.2.1 pH胁迫

不同pH值条件下STEC菌株产生的毒素均能对Vero细胞造成不同程度的伤害，且酸性环境和碱性环境下STEC所产毒素对Vero细胞造成的影响不同(图 7和图 8)。与pH 7.0条件相比，在pH 5.0条件下STEC菌株测得细胞存活率高，菌株D3146除外；在pH 9.0条件下STEC菌株测得细胞存活率低，菌株ST462除外。与最适条件pH 7.0相比，pH 5.0和pH 9.0条件下STEC菌株所测细胞存活率差异显著(P < 0.01)。此外，从图 8毒素对细胞损伤程度中同样可以发现相同的现象，在pH 9.0条件下菌株ST378、D3146所产毒素对细胞侵害作用最为严重，细胞边缘萎缩，末端膨大，甚至出现凋亡现象；而在pH 5.0条件下，菌株ST462、ST378所产毒素对细胞侵害作用弱于pH 7.0条件下，细胞生长仅仅出现轻微影响，细胞呈略微收缩状态。结果表明，酸性条件下STEC菌株所产毒素对细胞的损害程度小于对照，而碱性条件下相反。

2.2.2 盐胁迫

不同浓度盐胁迫条件下STEC产生的毒素侵染Vero细胞，细胞存活率随着盐浓度的增加而降低，细胞损害程度加重(图 9和图 10)。在1.5% NaCl条件下，菌株ST462和D3146所产毒素测得的细胞存活率低于0.5% NaCl条件下的值；在2.5% NaCl条件下，STEC菌株所产毒素测得的细胞存活率低于1.5% NaCl条件下的值，与最适条件0.5% NaCl相比，1.5% NaCl和2.5% NaCl条件下STEC菌株所测细胞存活率差异显著(P < 0.01)。此外，从图 10中可以看出，随着盐浓度增加，细胞受到的损害增加，细胞从圆润饱满变得边缘收缩、形态细长、末端膨大。结果表明，在一定浓度盐胁迫环境下，STEC对盐具有耐受性，且盐浓度越高，菌株受到的胁迫越大，所产毒素对细胞造成的伤害越大。

2.2.3 温度胁迫

不同温度条件下STEC产生的毒素侵染Vero细胞，细胞存活率随着温度的降低而降低，细胞损害程度加重，结果见图 11和图 12。在25 ℃条件下，STEC菌株所产毒素测得的细胞存活率均低于37 ℃条件下的值；在10 ℃条件下，除菌株ST462外STEC菌株所产毒素测得的细胞存活率低于25 ℃条件下的值。与最适条件37 ℃相比，25 ℃和10 ℃条件下STEC菌株所测细胞存活率差异显著(P < 0.01)。从图 12中可以看出，与37 ℃条件下STEC所产毒素造成的细胞状态相比，在10 ℃和25 ℃条件下STEC所产毒素造成的细胞形态发生显著变化。低温环境下，细胞形态收缩且变得细长，破裂细胞明显增多。当生长环境温度低于最适生长环境温度，STEC生长受到抑制，其内部调控机制可能会发生改变，以分泌毒素形式提高适应能力。结果表明，低温环境对STEC生长有一定的胁迫作用，菌株经过长时间的适应后，所产毒素对Vero细胞造成的损害加重。

3 讨论与结论

本研究选取3株属于不同血清型、携带不同毒力基因的STEC菌株(ST462、ST378、D3146)，在不同pH值、不同盐浓度、不同温度下进行STEC菌株适应性传代培养，通过拟合生长曲线和Vero细胞毒性实验来分析胁迫环境下STEC菌株的生长应激状况及产毒情况。

大肠杆菌本身具有耐酸、耐冷、耐热、耐高压等特点，在自然界中广泛地存在于各种环境中，即使是在高酸、高盐以及低温的食品加工环境中同样存在着大量的大肠杆菌^[16]。本研究中，STEC菌株在pH 5.0条件下生长受到抑制，且其在抑制过程中所产毒素对Vero细胞造成的伤害低于最适条件pH 7.0。但Li等^[17]的研究发现STEC菌株在pH 5.0–7.0之间生长状态良好，且在pH < 4.0时，STEC菌株的生长受到抑制，尤其是pH < 2.0时，菌株将完全不能够生长。这可能是由于不同STEC菌株之间的耐酸性存在着异质性^[18]。面对酸性环境，STEC菌株能够快速调节其毒力蛋白来提高生存能力。但有研究表明，低于一定pH值的酸性环境，STEC菌株可能会存在损伤或致命情况，导致其菌株状态受到较大影响，从而降低其产毒^[19]。目前在STEC菌株的耐酸机制方面已有足够的探究，但其在酸性环境下的产毒研究仍有较大空白。

Yan等^[20]在探究泡菜发酵过程中指出，不同浓度盐胁迫对STEC菌株生长造成的影响尤为重要。本文研究结果显示，STEC菌株耐盐能力强，在高浓度盐2.5% NaCl胁迫条件下仍能生长，且所产毒素对Vero细胞造成的损害程度大于1.5% NaCl条件下。在高渗透压条件下，大肠杆菌在初期生长受到抑制，但通过短暂诱导RpoE、RpoH和RpoS来调节对高渗透压的长期适应使大肠杆菌在生长后期仍保持在生长范围内^[21]，但其在盐胁迫条件下产毒能力的应激机制有待进一步研究。但我们推测，对于不同盐浓度胁迫压力，菌株响应应激机制来诱导蛋白的基因或者方法不同，致使STEC菌株所产毒素强弱不同。

除了pH值和盐浓度，生长环境的温度也是影响STEC菌株生长状态的因素之一^[22]。Zhao等^[23]通过研究发现冷藏温度5 ℃或10 ℃条件下可能无法控制食源性致病菌生长风险。本研究中发现STEC菌株在10 ℃胁迫条件下经过长时间适应后仍能生长，且菌株ST378和D3146在生长过程中所产毒素对Vero细胞造成严重的损害。低温条件下STEC菌株表现出具有强被膜形成能力和产志贺毒素能力，从而更好地适应环境^[13]。结合研究结果，我们可以推测低温环境下STEC菌株通过响应其内部应激机制，一段时间适应后，STEC菌株仍能够继续生长，同时以增强其产毒来适应低温环境，这需要进一步的研究。STEC菌株面对多种胁迫环境进化出了复杂的应激反应机制，促进了生存，但也有助于定殖和增强致病性^[7]。

值得注意的是在本研究中pH 5.0条件下菌株ST378、pH 9.0条件下菌株D3146、1.5% NaCl条件下菌株ST378、2.5% NaCl条件下菌株以及10 ℃条件下菌株ST462表现出不同的表型，这可能是由于菌株之间所存在的异质性造成的。菌株对环境反应的多样性和差异性增加了对大肠杆菌的致病性和微生物食品安全控制的难度。Murphy等^[24]最早提出菌株异质性能真实地反映种群的差异性。后续研究提出，微生物异质性一般指同一微生物即使在通过单克隆培养后，种群中的每个细胞都可能在遗传、生理和生长行为等方面表现出广泛的差异性^[25]。

调查研究发现在一些加工或未加工的食品中检测出STEC，说明食品在经过高温、高压、盐处理以及低温冷藏等处理过程中并不能够完全除去STEC以及其产生的毒素，从而引发了多起食品安全事件^[26-28]。结合本研究结果，这可能是因为食品原材料中的STEC菌株在经过一系列常规的灭菌、保鲜操作后仍存活。面对不适的生存环境，细菌会通过改变细胞结构、细胞膜蛋白分子质量等一系列调控反应来抵抗外界生存环境所带来的胁迫压力，提高对胁迫环境的反应和适应能力^[29-30]。

综上所述，面对外界胁迫环境的压力，STEC菌株通过调控相关蛋白基因来响应应激机制，经过一段时间的适应能够继续生长，且所产毒素毒性增强。食品加工行业中，大多通过跨栏技术来实现对食源性致病菌的控制，使菌株处于一种亚致死状态，一旦菌株经过长时间的适应后，仍然释放毒素，从而对食品健康安全留下隐患。因此，本研究结果为更好地了解胁迫环境下STEC菌株的应激响应机制和生物学特性研究提供基础数据参考，同时也为食品行业在食品加工过程中消毒、除菌环节提供数据参考。