大型养殖场的建设和投入，在促进经济飞速发展的同时，也对当地环境造成了一定的危害。养殖场大量粪便的堆积已成为重要的环境污染源，比如粪便在堆放过程中释放的NH₃和H₂S等恶臭气体^[1]。恶臭气体在生理上会引起嗅觉迟钝、毒害呼吸系统等，在心理上会产生不舒服、厌烦等负面情绪^[2]。因此，有效降低粪便堆放过程中臭气的释放量已经成为养殖业健康持续发展的关键技术之一，也是面临的挑战之一^[3]。

目前，国内外恶臭污染治理技术研究的主要方向为生物除臭^[4]。生物除臭中微生物除臭技术较常用，与化学和物理除臭技术相比，生物除臭技术有高效、环境友好、应用简单以及经济实惠等优点，应用和推广潜力较大^[5]。从除臭过程来看，微生物除臭技术又可分为异位控制技术和原位控制技术^[6]。异位控制技术针对已释放的恶臭气体，通过气体收集装置和除臭生物膜对臭气进行集中脱除^[7-8]。原位除臭是通过除臭菌剂代谢降解恶臭物质，或抑制臭气产生进行除臭的技术^[9-10]。除臭菌是微生物除臭的关键，所以国内外的研究工作主要集中在高效除臭优势菌株的选育。由多种微生物配制而成的复合微生物除臭制剂，充分发挥了微生物之间的协同作用^[11]，能够同时有效地降低恶臭气体成分中主要的氨气和硫化氢的释放，从而获得最佳的除臭应用效果。日本、美国、荷兰等国早在20世纪70年代就相继研发出许多微生物除臭剂，而我国90年代初期才关注和研究恶臭污染物防治与控制技术^[12]。近年来，我国自主选育和复配的复合微生物制剂研究的报道逐渐增多，但推广应用的研究还是多采用国外进口的微生物除臭制剂，以日本的EM菌剂为主^[6]。本研究以氨气和硫化氢去除为目的筛选除臭微生物，挑选高效菌株复配微生物除臭剂应用于粪便堆肥中，检测堆肥现场氨气和硫化氢的释放量以及堆肥结束后全氮和氨氮的含量，分析微生物除臭剂的应用效果，为制备畜禽粪便除臭复合菌剂提供更多菌种选择，同时推广本土自主研发微生物除臭剂的应用。

1 材料与方法 1.1 样品采集地点

沼渣样品采集于甘肃省张掖市华瑞农业股份有限公司奶牛养殖场沼气站。硫铁矿场土壤样品采集于甘肃白银厂黄铁矿型铜铅锌矿床。

1.2 培养基

细菌基础培养基(g/L)：牛肉膏10.0，蛋白胨5.0，酵母粉5.0，葡萄糖5.0，NaCl 5.0，pH 7.0–7.2，121 ℃灭菌20 min。

异养硝化培养基(g/L)：NH₄Cl 0.382 (NH₄⁺-N 100 mg/L)，乙酸钠2，MgSO₄·7H₂O 0.05，K₂HPO₄ 0.2，NaCl 0.12，MnSO₄·4H₂O 0.01，FeSO₄ 0.01，pH 7.0–7.2，121 ℃灭菌20 min。

硫氧化菌筛选培养基(g/L)：K₂HPO₄ 1.5，KH₂PO₄ 1.5，MgCl₂·7H₂O 0.8，CaCl₂ 0.5，pH 7.0–7.2，121 ℃灭菌20 min。Na₂S·9H₂O过滤后加至S^2–终浓度50 mg/L。

复合培养基(g/L)：乙酸钠4.0，NaCl 5.0，NH₄Cl 0.382，K₂HPO₄ 0.4，KH₂PO₄ 0.4，MgCl₂·7H₂O 0.8，CaCl₂ 0.5，FeCl₂ 0.02，pH 7.0–7.2，121 ℃灭菌20 min。Na₂S·9H₂O过滤后加至S^2–终浓度50 mg/L。

1.3 除臭微生物除氨效果测定

将1 mL种子液接种到装有100 mL异养硝化培养基的锥形瓶中，以没有接种菌液的培养基作为空白。在30 ℃、180 r/min的摇床中培养48 h后取样，在波长600 nm处检测细菌生长情况，然后10 000 r/min离心2 min，用纳氏比色法测定上清液中NH₄⁺-N的浓度，设置3个平行。氨氮去除率计算公式如下：

μ：氨氮去除率；w₁：培养基初始氨氮浓度；w₀：培养基最终氨氮浓度。

1.4 除臭微生物除硫效果测定

取100 mL硫氧化菌筛选培养基于250 mL的锥形瓶中，接种1 mL种子液，以没有接种菌液的培养基作为空白。在30 ℃、180 r/min的摇床中培养48 h后取样，在波长600 nm处检测细菌生长情况，然后10 000 r/min离心2 min，用亚甲基蓝比色法测定上清液中S^2–的浓度，设置3个平行。S^2–去除率计算公式如下：

μ：S^2–去除率；w₁：培养基初始S^2–浓度；w₀：培养基最终S^2–浓度。

1.5 微生物除臭剂复配方法

(1) 拮抗试验：采用牛津杯法。(2) 复合菌剂的组合试验：将互不拮抗的5个菌株进行组合，共组建了14个处理组，然后按照1:1的比例根据复筛的方法测定其对氨氮和硫的去除率，选出效果最好的菌株组合。

1.6 复合微生物除臭剂的堆肥应用实验 1.6.1 实验场地

张掖金马肥料厂。

1.6.2 实验设计

堆肥原料有牛粪和玉米秸秆，其具体理化性质见表 1。添加玉米秸秆将牛粪堆肥的C/N调节至24左右，物料含水率控制在65%–70%。试验组接入微生物除臭剂，对照组接入等量高温灭活的除臭剂。实验组和对照组分别堆放在不同的塑料大棚里，每个堆体长1 m，堆底宽1 m，高1 m，堆体间隔为3 m。将堆肥质量5%的微生物除臭剂喷洒于配置好的物料中，搅拌均匀后发酵，每个处理3个重复，试验期为20 d，第4天、第7天、第10天、第15天翻堆1次，每个处理堆肥环节保持一致。

1.6.3 堆肥样品采集及测定采样方法

各发酵堆体试验开始和结束时，翻堆混合均匀后，分别在5个点各取样150 g (四角和中心)，取样深度30 cm，用四分法留样。样品有机质和全氮含量参考NY 525—2012标准测定，氨氮的含量采用纳氏试剂比色法测定，每个样品3次重复。

1.6.4 堆肥现场温度检测

使用数字电子温度计(国产)插入距离堆体顶部0.5 m处测量温度，下午14:00测量，测量3次后取平均值作为当天堆体的温度，同时记录周围环境的温度。

1.6.5 堆肥现场氨气硫化氢浓度

使用手持式泵吸氨气检测仪和硫化氢检测仪(深圳无眼界科技有限公司)检测。测量时将检测仪放置在堆体上方0.5 m处(距离地面1.5 m)，围绕堆体检测3处后取平均值作为当天氨气和硫化氢浓度。

1.7 数据处理和统计分析

试验数据经Microsoft Excel进行统计分析，利用OriginPro 9.0进行绘图分析。

2 结果与分析 2.1 除臭微生物的筛选鉴定 2.1.1 除氨菌的筛选结果

从沼渣样品中共分离到12株具有除氨效果的细菌，测序结果表明这些菌株主要属于短杆菌属(Brevibacterium)、节细菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、泛菌属(Pantoea)。从图 1可以看出，12株细菌中有5株可以在以100 mg/L NH₄⁺-N为唯一氮源的异养硝化液体培养基中培养48 h后，OD₆₀₀达到1.5以上，其中N-6和N-11长势较好，分别达到了1.98和2.16。同时，如图 1所示，N-2、N-5、N-11这3株菌的氨去除能力较强，其中菌株N-11对氨的去除能力最强，达到了83.41%。

2.1.2 除硫菌的筛选结果

从硫铁矿场土壤样品中共分离得到5株具有除硫效果的微生物，测序结果表明这些菌株主要属于链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节细菌属(Arthrobacter)。如图 2所示，5株微生物均可以在添加50 mg/L S^2–的液体培养基中生长。其中，菌株S-3的长势较好，除硫能力也最突出。在培养48 h后，其OD₆₀₀达到了1.75，硫去除率达到了85.55%。

2.2 最佳除臭微生物组合的确定

通过分析除臭微生物的初筛结果，选出除氨细菌N-2、N-5、N-6、N-11以及除硫细菌S-3共5株细菌进行复配组合实验，表 2为5株细菌分子鉴定结果。采用牛津杯法确定用于复配的5株菌之间无拮抗作用(表 3)，可进一步组合。

如图 3所示，将5种菌株进行组合后共有14种组合。其中N-5+N-6+N-11+S-3组合对NH₄⁺-N和S^2–去除率最高，分别为82.46%和84.84%，说明这4株菌相互协调，组合在一起除臭效果较好。有N-11菌株的组合，NH₄⁺-N去除率都在70%以上，说明N-11菌株去氨氮的效果较好。另外，并不是组合的菌株越多除臭效果越好，如N-2+N-5+N-6+N-11+S-3菌株组合，其除氨率为77.80%，除硫率为76.98%，并不是最高。

2.3 复合微生物除臭剂在牛粪堆肥中的应用

牛粪堆肥应用实验结果表明，微生物除臭剂按堆体质量5%喷洒加入，不仅没有影响牛粪堆肥正常起温，而且使得堆肥温度高于与对照组(图 4)。图 4中箭头表明翻堆时间节点，堆肥过程中翻堆后堆肥温度出现短暂的持平后迅速起温。如图 5所示，在整个堆肥过程中实验组的NH₃释放量均低于对照组，尤其是在第4天和第7天，NH₃的去除率分别达43.61%和62.84%。在微生物除臭剂处理组中，堆肥第7天H₂S的释放量降低了53.12%。同时，与对照组相比，实验组H₂S的释放量均在1.00 mg/m³以下。图中第4天、第7天、第10天及第15天NH₃和H₂S浓度出现明显的上升趋势与翻堆有关。牛粪堆肥过程中营养元素含量变化见表 4。堆肥结束时，对照组和实验组处理有机质含量分别为19.38%和17.15%，相比于堆肥开始时分别降低了62.00%和67.14%。全氮含量略微有所增加，但氨氮的含量降低明显，对照组氨氮降低了9.00%，实验组氨氮降低了39.82%，远高于对照组。

3 讨论 3.1 除臭微生物的筛选和除臭效果

除臭微生物是生物除臭技术的关键，已有研究表明，能够有效进行脱臭的主流功能菌群有芽孢杆菌类、乳酸菌类、光合细菌类、放线菌类、酵母类等^[6]。目前对于除臭微生物的筛选方法主要是通过感观法定性初筛，使用NH₃和H₂S选择性培养基复筛除臭微生物，例如李彪等筛选的ZY-1的NH₃去除率达47.70%，WJ-2的H₂S去除率为62.5%^[13]；张生伟等筛选的菌株BX3对NH₃和H₂S的去除率分别达到80.07%和76.92%^[14]；曾苏等配制的复合菌剂对NH₃和H₂S的最大去除率为83.56%和70.25%^[15]。本研究使用NH₄⁺-N和S^2–选择性培养基分别来进行除氨微生物和除硫微生物的筛选，再将二者结合复配，获得的复合微生物除臭剂NH₄⁺-N和S^2–去除率分别为82.46%和84.84%，相对于已报道的研究，保持了较高的除氨效率的同时提高了除硫效率。

3.2 除臭微生物在堆肥中的应用

本研究获得的微生物除臭剂应用于牛粪堆肥后的第7天NH₃释放量减少了62.84%，H₂S释放量减少了53.12%。刘标等筛选的除臭菌株YX-3 [暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensi)]，在30 d的病死猪堆肥实验中NH₃和H₂S的去除率分别为56.9%和8.6%^[16]；张生伟等获得的复合微生物除臭剂在猪粪和鸡粪堆肥中应用后，在堆肥的前20 d对NH₃和H₂S的去除率高达70%和60%以上^[17]。由于堆肥原料和堆肥时间的不同，我们无法定量地比较微生物除臭剂的效果，相对比较之下张生伟等获得的微生物除臭剂除臭效果较好。同时，已有报道中微生物除臭剂的应用效果均在80%以下，还存在很大的进步空间，微生物除臭剂的商品化和市场化仍然存在挑战。

粪便堆肥过程中，尤其是堆肥开始的一周，随着有机物的降解，堆肥温度的上升，氨气的释放达到最大值，与本研究结果相似。氨气的释放不仅给堆肥场所造成臭气的困扰而且还是氮元素损失的主要原因。总氮损失的90%由NH₃挥发造成^[18]。堆肥过程中，气体排放量主要受翻堆的影响。有研究表明，堆肥过程中加入除臭菌剂可以增加微生物群落多样性，同时降低肥料pH值，促进硝化作用，减少NH₃的排放，兼顾除臭、保氮2个要求^[19-20]。H₂S在堆肥过程中由厌氧细菌降解含硫有机物产生硫化物进一步转化而成，其阈限值为16.6 mg/m³，但大多数人在0.22 mg/m³时即可嗅到硫化氢，严重影响工作人员身心健康^[21]。张生伟等的研究结果表明在堆肥结束后，除臭微生物添加组的SO₄^2–含量显著高于自然堆肥^[14]，由此推断除臭微生物促进含硫恶臭气体向SO₄^2–形式的转换。研究表明，只有含硫物先转换成SO₄^2–形式才能转换为地土壤中可利用的有机硫作为植物有效硫的重要来源^[22]。

在国际上，堆肥倾向于封闭容器内堆肥，在管道末端处理臭气，常见除臭方法有生物过滤器、生物洗涤器和生物滴滤器^[23-24]。目前，较新的技术是生物滴滤器，其氨气和硫化氢的生物降解效率通常达到95%–99%^[24]；但是，生物滴滤器反应器体积大，设备要求高，需精确控制，同时填料需要定期更换^[7]。我国大量的中小型畜禽养殖场中，由于场地和技术的限制，微生物除臭制剂因操作简单无需复杂设备，环境适应力强除臭效果持久，所以较生物滴滤器更广受欢迎。粪便堆肥过程中，除臭菌剂不仅降低了氨气和硫化氢的释放量同时减少了氮元素的损失，并促进硫离子向有机硫转化^[10]，这对有机肥的生产具有重要意义。

4 结论

(1) 从沼渣和硫铁矿土壤中分离获得12株除氨微生物和5株除硫微生物，挑选出5株效果较好的微生物N-2、N-5、N-6、N-11和S-3进行拮抗实验和复配组合后，由N-5+N-6+N-11+ S-3组成的微生物除臭剂对NH₄⁺-N和S^2–去除率最高，分别为82.46%和84.84%。

(2) 本研究复配得到的微生物除臭剂应用到牛粪堆肥中，在堆肥前期的第7天翻堆的过程中氨气和硫化氢释放量相对于对照组减少了62.84%和53.12%，堆肥结束后，微生物除臭剂组氨氮含量低于对照组33.62%，证明其有良好的除臭功效，可广泛推广应用。