新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)是一类重要的人类条件致病真菌，每年造成超过100万例的感染和超过23万人死亡^[1]。然而迄今为止治疗新生隐球菌感染药物的种类和数量却都非常有限，仅有氟康唑(fluconazole, FCZ)、两性霉素B和氟胞嘧啶3种药物^[2]。氟康唑和两性霉素B影响真菌细胞膜的关键成分麦角固醇，氟胞嘧啶靶向真菌的核酸代谢。随着这些抗真菌药物的长期使用，氟康唑和氟胞嘧啶耐药菌株的比例越来越高，严重限制它们的使用^[1]。虽然两性霉素B耐药菌株非常罕见，然而该药物有严重的毒副作用，如溶血活性和肾脏毒性。因此，迫切需要开发新结构新作用机制的抗真菌药物。

小檗碱(berberine, BBR)亦称黄连素，属于异喹啉生物碱，是一种具有悠久药用历史的传统中药。小檗碱可从许多植物中提取得到，如黄连(黄连、金菊头)、金印草(北美黄连)和刺檗(小檗)等^[3]。小檗碱具有广泛的药理和生物活性，在抗微生物、抗肿瘤、抗炎和抗糖尿病等方面表现出显著的活性^[4]。近年来，研究发现小檗碱对念珠菌和隐球菌等致病真菌具有抑制作用^[5-6]。在白色念珠菌中，小檗碱与氟康唑、两性霉素B等联用能起到协同抑菌效果，并能逆转药物外排泵Mdr1介导的氟康唑耐药^[5-7]。小檗碱通过调控真菌细胞膜麦角固醇含量，影响细胞内活性氧的产生等机制来发挥抗菌作用，然而分子机制有待深入研究。

在本研究中，以重要人类病原真菌新生隐球菌为研究对象，测试小檗碱的体内外抗菌活性，以及小檗碱对隐球菌重要毒力因子表达的影响，并初步探索了抗菌和调控毒力因子表达的作用机制，这些结果为进一步开发小檗碱为新型抗真菌药物奠定坚实的基础。

1 材料与方法 1.1 材料

新生隐球菌H99、KN99a以及7株临床分离株和巨噬细胞J774A.1由实验室保藏。临床分离株分离自艾滋病患者，由重庆市公共卫生医疗救治中心李同心提供，PKA1和HOG1敲除菌株由美国罗格斯大学薛朝阳提供。NRG1敲除菌株和回补菌株由实验室构建和保藏^[8]。大蜡螟购于天津惠裕德生物科技有限公司。实验常规试剂主要购买于大连美仑生物技术有限公司等公司。LPS、γ-干扰素、小鼠补体购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，YPD培养基购赛默飞世尔科技(中国)有限公司，限制性内切酶及连接酶购于纽英伦生物技术(北京)有限公司和赛默飞世尔科技(中国)有限公司公司。质粒提取、片段纯化和胶回收试剂盒购于OMEGA Bio-Tek。常规DNA聚合酶为北京全式金生物技术股份有限公司的EasyTaq酶，高保真扩增酶为南京诺唯赞生物科技股份有限公司(Vazyme)的Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，RNA提取试剂盒购于江苏康为世纪生物科技股份有限公司，反转试剂盒与实时荧光定量试剂盒购于Vazyme公司。

1.2 小檗碱体外抗真菌活性评价

小檗碱、两性霉素B和氟康唑对新生隐球菌抑制活性参照临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的标准，采取微量稀释法进行检测。将隐球菌初始浓度定为1×10³ CFU/mL，分别向其中加入不同浓度的药物(起始浓度为256 µg/mL，96孔板2倍梯度稀释)，于37 ℃培养箱中静置培养，48 h后检测微生物的生长情况。对于小檗碱和两性霉素B，最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)定义为不能够观察到菌生长的最低药物浓度；对于氟康唑，MIC定义为与不加药物对照相比，新生隐球菌生长抑制50%时的药物浓度。2种药物之间的体外相互作用采用棋盘法由分数抑制浓度指数(fractional inhibitory concentration index, FICI)定义。FICI模型表示如下：FICI=FIC_A+FIC_B=(联合使用A的MIC/单独使用A的MIC)+(联合使用B的MIC/单独使用B的MIC)。对FICI的解释是：协同作用FICI≤0.5，相加作用0.5 < FICI≤1.0，拮抗作用FICI > 4.0，无交互作用1 < FICI≤4.0。

将新生隐球菌H99培养至对数生长期，调节菌浓度为5×10³ CFU/mL用于杀菌曲线测试。将稀释好的菌液和小檗碱或氟康唑孵育，药物终浓度分别为1×、5×和10×MIC。培养不同时间后取样，梯度稀释后涂布平板，置于37 ℃培养箱培养48 h，统计菌落数。

1.3 新生隐球菌荚膜检测

从平板中沾取少许菌体接种至3 mL YPD液体培养基中，220 r/min、30 ℃培养12 h。从培养后的菌液中取1 mL，4 500 r/min离心4 min，弃上清，向沉淀中加入1 mL蒸馏水重悬菌体，4 500 r/min离心4 min，弃上清，此步骤重复2次。再向沉淀菌体中加1 mL蒸馏水重悬，取其中100 µL滴至含有不同浓度药物的DEME平板，于30 ℃培养箱中培养，3 d后观察结果。

1.4 新生隐球菌有性生殖检测

从平板中沾取少许H99 MATα和KN99 MATa菌体分别接种至3 mL YPD液体培养基中，220 r/min，30 ℃培养14 h；从培养后的菌液中取1 mL，4 500 r/min离心4 min后弃上清；向沉淀菌体中加入1 mL蒸馏水重悬，4 500 r/min离心4 min后弃上清，此步骤重复2次；然再向沉淀菌体中加100 µL蒸馏水重悬，将H99 MATα与KN99 MATa混合，取混合后的50 µL菌液滴至含有不同浓度药物的MS培养基；待菌液晾干后放在25 ℃避光培养。

1.5 隐球菌与巨噬细胞互作

参照Han等^[9]的方法，在48孔培养板中进行了隐球菌与巨噬细胞的相互作用试验。在48孔培养板的每个孔中加入总共5×10⁴个J774 A.1细胞的0.5 mL新鲜DMEM，并在37 ℃和5%的二氧化碳中培养过夜。为了激活巨噬细胞，在每个孔中加入50单位/毫升γ干扰素(IFN-γ)和1 μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。1×PBS缓冲液洗涤隐球菌2次后，加入20%的小鼠补体。然后在每个孔中加入2×10⁵个隐球菌细胞，使真菌与J774细胞的比例为4:1。共孵育2 h后，用新鲜的DMEM清洗非黏附的细胞外酵母细胞，加入不同浓度的小檗碱，并将培养物再培养24 h，以评估药物新隐球菌的细胞内增殖的影响。培养结束后用蒸馏水在室温下裂解巨噬细胞30 min。将裂解液涂布在YPD平板上，培养2 d后计算平板中的隐球菌数。

1.6 新生隐球菌黑色素生成能力的检测

将活化后的新生隐球菌转移至YPD液体培养基中，220 r/min培养2 h后收集菌体，稀释至OD₆₀₀=1.0，10倍稀释滴至含有不同浓度药物的Niger Seed培养基上，于30 ℃培养箱中培养3 d后观察结果。

1.7 新生隐球菌RNA提取和RT-qPCR分析

RNA提取和RT-qPCR分析参照已发表论文的方法^[10]。按照说明书进行反转录和qPCR。基因表达差异倍数通过与TEF1的表达水平进行均一化进行计算，并通过取Log₂确定基因表达的表达倍数。

1.8 小檗碱体内抗真菌活性评价

将大蜡螟分为7组，每组10只，前6组注射10 µL浓度为1×10⁷ CFU/mL H99菌液，第7组注射等体积生理盐水。孵育3 h后，注射药液10 µL，第1组为氟康唑(14 mg/kg)，第2组为BBR (10 mg/kg)，第3组为BBR (20 mg/kg)，第4组为BBR(40 mg/kg)，第5组为联合用药组(BBR 20 mg/kg+FCZ 14 mg/kg)，第6、7组注射生理盐水，注射后37 ℃培养，每隔24 h观察大蜡螟死亡数目，至实验组所有大蜡螟死亡。

2 结果与分析 2.1 小檗碱对新生隐球菌具有抑制活性

为了测试小檗碱对新生隐球菌的抑制活性，采用肉汤稀释法测定了小檗碱(BBR)对标准菌株H99和7株临床分离菌株的最小抑菌浓度，以一线抗真菌药物氟康唑作为对照。结果显示小檗碱对所有测试菌株均有抑制活性，其MIC范围为8−16 μg/mL (表 1)。为了进一步确定小檗碱对新生隐球菌是抑菌还是杀菌作用，以抑菌药物氟康唑作为对照，测定不同药物处理下标准菌株H99的存活率。结果显示，小檗碱(5×MIC和10×MIC)处理12 h后隐球菌全部被杀灭，而在相同的MIC倍数甚至更高倍数时氟康唑仍然是抑菌效果，并且小檗碱的最低杀菌浓度是最低抑菌浓度的2倍，这表明小檗碱对隐球菌具有杀菌作用(图 1)。药物联用是治疗真菌感染的重要策略，不仅有望缩短治疗周期，降低药物毒副作用和使用剂量，还能拓展新的抗真菌药物，避免耐药菌株的出现^[11]。因此，我们进一步测试了小檗碱与氟康唑或两性霉素B联用的抗菌效果，结果显示小檗碱与氟康唑或两性霉素B的联用为相加作用，FICI值分别为0.625和1.000，表明小檗碱具有与其他抗真菌药物联用的潜力。

2.2 小檗碱抑制荚膜和黑色素等重要毒力因子的合成

荚膜是新生隐球菌的重要毒力因子，荚膜不仅能削弱宿主的免疫反应，同时还能提供重要的抗氧化防御，从而极大提高了新生隐球菌在感染中的存活机会^[12]。小檗碱处理(1×MIC和4×MIC)显著抑制新生隐球菌的细胞体大小以及荚膜大小(图 2A−2C)。黑色素是新生隐球菌另一个重要毒力因子，在维持新生隐球菌细胞壁和荚膜结构，以及抗氧化功能中发挥了重要的作用^[2]。小檗碱处理(4×MIC)显著抑制了新生隐球菌黑色素的产生(图 2D)。

2.3 小檗碱抑制新生隐球菌有性生殖

有性生殖是新生隐球菌进化的关键策略，通过该过程产生的孢子能通过呼吸进入体内，进而感染肺，并可能突破血脑屏障而感染脑部，造成致命的隐球菌脑膜炎^[13]。为了检测小檗碱对新生隐球菌的有性生殖产生影响，将KN99a与H99α菌株等体积混匀后滴至未加小檗碱及添加不同浓度小檗碱的MS培养基上，于25 ℃培养，并分别在培养第5天和第15天观察新生隐球菌是否正常产生菌丝。结果显示，当小檗碱浓度为1×MIC时抑制了菌丝形成，当小檗碱浓度达到4×MIC时几乎完全抑制了菌丝形成(图 2E)。

2.4 小檗碱抑制巨噬细胞内新生隐球菌的增殖

新生隐球菌的一个关键特征是它能在巨噬细胞的吞噬溶酶体内存活和复制，并进而从巨噬细胞逃逸，造成进一步的感染^[12]。为了研究小檗碱对巨噬细胞中新生隐球菌生长的影响，我们开展了新生隐球菌与巨噬细胞互作的实验。结果显示，当小檗碱浓度仅为2.5 µg/mL时就能限制抑制巨噬细胞内(图 3A)、巨噬细胞外(图 3B)新生隐球菌的生长，这表明小檗碱有效抑制巨噬细胞内外新生隐球菌的生长，从而抑制新生隐球菌在巨噬细胞间的传播和逃逸。

2.5 NRG1在新生隐球菌抗小檗碱过程中发挥重要作用

NRG1编码一个真菌中保守的锌指家族转录因子^[14]。在新生隐球菌中，NRG1缺失导致突变株荚膜变小、合成黑色素能力下降、有性生殖受到抑制^[15]，这些都与小檗碱对新生隐球菌的影响类似，暗示NRG1可能在小檗碱抗菌过程中发挥重要作用。为了测试Nrg1的功能，我们通过同源双交换替换手段得到了新生隐球菌的NRG1敲除菌株和回补菌株。敲除菌株的表型与文献报道一致(数据未呈现)。小檗碱(20 µg/mL)显著抑制了NRG1敲除菌株的生长，回补菌株则恢复至与野生型表型一致，这表明NRG1缺失后新生隐球菌抗小檗碱能力大幅下降(图 4A)。转录分析发现，小檗碱处理导致NRG1转录上调(图 4B)。这些结果表明NRG1是新生隐球菌抗小檗碱的重要基因。

环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)途径对新生隐球菌毒力表达至关重要，negative regulator of glucose-repressed genes 1 (Nrg1)是新生隐球菌cAMP途径的重要成员^[16]。为了分析cAMP途径在小檗碱抗隐球菌中的作用，我们检测了位于Nrg1上游的protein kinase A 1 (PKA1)敲除菌株、位于Nrg1下游的high osmolarity glycerol response 1 (HOG1)敲除菌株的抗隐球菌活性，结果显示PKA1和HOG1缺失不影响新生隐球菌的生长，仅NRG1缺失菌株对小檗碱敏感(图 4C)，这些结果表明Nrg1可能通过非cAMP途径调控抗小檗碱活性。

2.6 小檗碱在真菌感染动物模型中具有活性

体外实验结果表明小檗碱不仅能够抑制隐球菌的生长，还能够降低多种重要毒力因子的表达，这些结果推动我们进一步测定小檗碱在新生隐球菌感染大蜡螟模型中的活性。无药物处理的组中，所有动物在96 h时全部死亡；10 mg/kg BBR组的动物也在96 h全部死亡；20 mg/kg BBR组则在120 h全部死亡；40 mg/kg BBR组在168 h全部死亡；注射14 mg/kg FCZ组在144 h全部死亡；联合用药组存活时间最长，在192 h才全部死亡(图 5)。这些结果表明小檗碱处理显著提高了大蜡螟的生存率，并且小檗碱与氟康唑联用使用具有较好的协同效果。

3 讨论与结论

随着各种原因造成免疫力低下人群的快速增加，新生隐球菌等病原真菌给人类健康带来日益严重的威胁。更为严重的是，病原真菌的耐药性日益严重，造成临床上能够使用的抗真菌药物非常有限。开发新型抗真菌药物是应对病原真菌威胁的重要策略。传统中药中蕴含丰富的抗真菌活性物质，小檗碱是其中的典型代表。已有文献报道小檗碱与氟康唑联用通过多种机制逆转白色念珠菌的氟康唑耐药性，比如通过促进细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生；作用于药物外排泵基因的表达，下调药物外排泵的功能，促进细胞内药物积累。下调编码唑类药物靶标-羊毛甾醇14-α-脱甲基酶(ERGosterol biosynthesis 11, Erg11)的基因表达，减少细胞膜麦角甾醇的合成，造成细胞膜完整性被破坏和细胞死亡^[5-7]。然而，小檗碱自身的杀菌活性及其机理尚不明确。本研究表明小檗碱在体内外都具有良好的抗菌效果。除了直接杀灭隐球菌外，亚致死浓度的小檗碱还能够抑制新生隐球菌多种毒力因子的表达，如荚膜和黑色素的形成，还能够促进巨噬细胞对于隐球菌的杀灭作用。

作用机制研究发现，新生隐球菌转录因子Nrg1介导了小檗碱的抗隐球菌活性。Nrg1是一种真菌中保守分布的锌指转录因子。酿酒酵母的Nrg1控制芽殖酵母生物膜形成，协调细胞适应碳水化合物，参与pH响应等。白色念珠菌中Nrg1调控菌丝特异性基因的表达，敲除菌株在小鼠感染模型中毒力减弱^[14]。新生隐球菌中NRG1缺失后也导致在小鼠感染模型中毒力减弱。本研究中，NRG1缺失导致菌株对于小檗碱更加敏感，回补NRG1后，对小檗碱敏感的表型消失。在野生型菌株过表达NRG1后，过表达菌株并未增加对小檗碱的耐药性。此外小檗碱也不改变Nrg1在细胞内的亚细胞定位(数据未呈现)。cAMP途径中位于Nrg1上下游调控基因的敲除也不影响对小檗碱的敏感性，这些结果表明Nrg1可能通过新颖的机制来发挥抗隐球菌活性。鉴于小檗碱良好的体内外抗新生隐球菌活性，深入解析小檗碱通过Nrg1介导的抗菌作用机制，将为开发小檗碱作为新型抗真菌药物奠定坚实的基础。