幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, HP)是革兰染色阴性、呈螺旋状的微需氧菌。HP持续感染可引发胃部慢性活动性炎症^[1]，其中约15%‒20%会发生消化性溃疡^[2]，5%‒10%发生相关性消化不良^[3]，约1%会发展为胃恶性肿瘤(胃癌、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤)^[4]。HP致病作用广泛，疾病负担重，但致病机制尚未完全明确。

HP的分子伴侣GroEL，是热休克蛋白60 (heat shock protein, HSP60)在原核生物中的同源蛋白，其主要功能是帮助蛋白转运、完成正确折叠及恢复天然构象^[5]。在HP相关研究中发现，GroEL也是一种重要的致病相关抗原成分，超过80%的HP感染人群可产生针对GroEL的抗体^[6-7]，且GroEL抗体的持续存在被认为与HP引起的胃部病变进展为胃癌存在关联^[8-9]，GroEL也可能在HP诱发炎症向胃癌进展过程中发挥重要作用。由于HP的GroEL与人HSP60同源性较高，其抗体介导的交叉反应在动脉粥样硬化的发生中起到一定的作用^[10]。作为一种重要的分子伴侣毒力因子，GroEL在HP生物学中的作用非常广泛和重要，虽然人类对HP的分子生物学研究已经有40年的历史，但目前仍缺乏对GroEL与其他蛋白质相互作用的系统性研究。本研究拟通过表达、纯化获得带有His标签的GroEL蛋白，用免疫沉淀法捕获HP中可能与GroEL结合的蛋白质，通过对可能与GroEL结合的蛋白质组成谱的解析和相互关系网络分析，为GroEL及其相关蛋白在HP致病中的作用机制研究及可能的感染防控靶点探索提供新的思路。

1 材料与方法 1.1 菌株、质粒及试剂

HP标准菌株ATCC 43504购自美国典型微生物菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)并由本实验室保藏，感受态细胞E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)、表达质粒pET-28a(+)及5K DNA Marker购自北京全式金生物技术股份有限公司，基因组提取试剂盒QIAamp DNA Mini Kit购自QIAGEN公司，限制性内切酶BamH I、Xho I和Q5^®超保真2×PCR预混液购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，质粒提取试剂盒E.Z.N.A.^® Plasmid DNA Mini Kit、胶回收试剂盒E.Z.N.A.^® Gel Extraction Kit购自OMEGA公司，T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司，His标签蛋白纯化磁珠HisPur^TM Ni-NTA、免疫沉淀磁珠Dynabeads^TM Protein G Immunoprecipitation Kit购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，鼠抗His标签单抗和鼠抗GST标签单抗购自艾博抗(上海)贸易有限公司，蛋白marker和咪唑(分析纯)购自北京索莱宝科技有限公司，培养基及蛋白纯化、质谱鉴定所用缓冲液等其他试剂均按照需要购买或配制。

1.2 引物设计和合成

从NCBI获取ATCC 43504基因组数据(GCF_900478294.1)，提取groEL基因序列并设计引物，引物序列为groEL-F：5′-CGGGATCC (BamH Ⅰ) ATGGCAAAAGAAATCAAATTTTCA G-3′；groEL-R：5′-CCGCTCGAG (Xho Ⅰ) CATC ATTCCGCCCATGCCT-3′。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.3 groEL基因PCR扩增

刮取培养48 h的新鲜ATCC 43504菌体，提取其基因组DNA用作模板，分别以groEL-F和groEL-R为上、下游引物，进行PCR扩增。25 μL扩增体系：模板(150 ng/μL) 1 μL，上、下游引物各(10 μmol/L) 0.5 μL，2×PCR预混液12.5 μL，ddH₂O 10.5 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测，胶回收试剂盒纯化PCR产物。

1.4 groEL原核表达系统构建

用BamH I和Xho I分别酶切1 μg的pET-28a(+)质粒和1 μg的胶回收纯化groEL，经1.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，测量浓度后将groEL片段和线性化的pET-28a(+)按3:1比例混合，加入T4 DNA连接酶16 ℃过夜，连接产物热激转化E. coli DH5α，挑取阳性单克隆菌落，37 ℃过夜培养，经菌液PCR鉴定groEL基因阳性后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。选择测序结果正确的E. coli DH5α克隆，提取重组表达质粒pET-28a(+)-groEL后热激转化E. coli BL21(DE3)，挑选阳性单克隆，培养过夜，经菌液PCR鉴定groEL基因阳性后，即完成原核表达重组菌E. coli BL21(DE3)^{pET-28a(+)-groEL}的构建。

1.5 GroEL诱导表达

将E. coli BL21(DE3)^{pET-28a(+)-groEL}置于LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6‒1.0时，加入1.0 mmol/L IPTG，37 ℃、180 r/min振荡培养4 h，诱导GroEL蛋白表达。离心收集菌体，用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline, PBS)重悬，冰浴超声裂解，高速离心，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。

1.6 GroEL纯化及鉴定

将500 mL诱导后的菌液离心后，用25 mL含50 mmol咪唑的平衡缓冲液重悬菌体，冰浴超声裂解，高速离心收集上清，即为待纯化样品，按400 μL待纯化样品用40 μL HisPur^TM Ni-NTA磁珠的比例进行纯化。将待纯化样品加入磁珠中，涡旋10 s，孵育30 min，用含100 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液洗涤磁珠2次，用含300 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱2次，分别收集洗脱液，采用二辛可宁酸(bicinchonininc acid, BCA)法测定洗脱液中蛋白浓度并经SDS-PAGE检测纯化效果。40 μL含GroEL的洗脱液经50 mmol/L碳酸氢铵(NH₄HCO₃) 3次超滤换液后，加入1 μL 200 mmol/L三(2-羧乙基)膦[tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP]室温静置1 h，加入1 μL 375 mmol/L碘乙酰胺(iodoacetamide, IAA)室温避光静置30 min，加入1 μg胰酶37 ℃过夜，用Pierce^® C₁₈ Spin Columns脱盐柱脱盐后，4 ℃真空离心浓缩，用10 μL 0.1%甲酸(formic acid, FA)重悬后，经高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)获取原始谱图。用Proteome Discoverer (V. 2.4)软件对原始谱图进行蛋白库(UniProtKB/Swiss-Prot)搜索，分析鉴定相应肽段及所匹配到的蛋白质。

1.7 HP ATCC 43504中可能和GroEL结合的蛋白质的鉴定及分类

将2 μg鼠抗His单抗与50 μL (1.5 mg) Protein G磁珠室温孵育10 min，结合至Protein G磁珠上；将新鲜培养的ATCC 43504用PBS洗涤2次，离心收集菌体，按1 g湿重菌体/10 mL PBS的比例重悬，冰浴超声裂解，高速离心后收集上清，即为ATCC 43504蛋白提取液。向500 μL ATCC 43504蛋白提取液中加入5 μg纯化后的GroEL蛋白，室温孵育1 h，加至结合了鼠抗His单抗的Protein G磁珠中，室温孵育10 min，用200 μL洗涤液洗涤磁珠3次，加入20 μL洗脱液振荡孵育2 min，收集洗脱液用于下游质谱鉴定。将2 μg鼠抗GST单抗结合至50 μL (1.5 mg) Protein G磁珠上，用作阴性对照，其他条件与实验组一致。洗脱液中蛋白质的质谱鉴定方法同1.6所述。在Uniprot蛋白数据库(https://www.uniprot.org/)中查阅鉴定出的蛋白质信息，并根据主要功能进行分类。

1.8 GroEL及可能和其结合的蛋白质的相互关系网络分析

在STRING (search tool for the retrival of interacting genes/proteins)数据库(https://string-db.org/, version 11.5)中，首先选择“Protein by name”功能，“Protein name”输入”GroEL”，“Organisms”选择“Helicobacter pylori 26695”，查询数据库中预测的GroEL功能伙伴蛋白，然后选择“Multiple proteins”功能，“List of names”中导入实验中鉴定出的蛋白质列表，“Organisms”选择“Helicobacter pylori 26695”，进行多个蛋白质的相互关系网络分析。

2 结果与分析 2.1 groEL基因PCR扩增

以ATCC 43504基因组DNA为模板进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物条带介于1 500–2 000 bp之间(图 1)，产物大小符合预期(1 655 bp)。

2.2 GroEL表达系统构建、表达和纯化

经菌液PCR鉴定groEL基因阳性，并通过测序确认目的片段与参考序列完全一致，成功构建了原核表达重组菌并命名为E. coli BL21(DE3)^{pET-28a(+)-groEL}。通过加入1.0 mmol/L IPTG，在37 ℃、180 r/min振荡培养的诱导条件下，SDS-PAGE显示目的蛋白条带介于63–75 kDa，大小符合预期，目的条带在沉淀中占较大比重，上清中也有一定表达(图 2)，表明目的蛋白在诱导过程中能大量表达，表达后的目的蛋白能以可溶性形式存在，但主要形成包涵体。可溶性蛋白经Ni-NTA磁珠亲和纯化后，SDS-PAGE显示洗脱液中目的蛋白条带明显，且纯度较高(图 3)。

2.3 GroEL蛋白的质谱鉴定

纯化后的目的蛋白经质谱鉴定，结果显示其与HP的GroEL蛋白相匹配并且获得极高的质谱评分，表明原核表达重组菌E. coli BL21(DE3)^{pET-28a(+)-groEL}表达目的蛋白GroEL成功。

2.4 HP ATCC 43504中可能和GroEL结合的蛋白鉴定及分类

从ATCC 43504的蛋白提取液中捕获了可能与GroEL结合的蛋白质，经质谱鉴定出59种蛋白，具体信息见表 1。对蛋白做功能分类发现，主要包括19种代谢酶类(参与氧化还原相关酶类7种，包括KatA、GltA、AhpC等；肽酶5种，PepA、RocF、HtrA等；参与脂肪代谢酶类2种；参与ATP合成酶类2种；尿素酶2种)、15种外膜蛋白(黏附素BabA、SabA、HapA及其他膜蛋白等)、8种转录翻译相关蛋白(Tuf、RpoBC等)、5种分子伴侣(DnaK、GroES等)、3种细胞毒素相关蛋白(CagA等)、3种氧化还原相关蛋白(TrxA等)、2种信号转导蛋白(TlpB、TlpD)和4种功能不明蛋白，具体如表 2所示。

2.5 GroEL和其可能结合蛋白的相互关系网络分析

STRING数据库中预测的GroEL功能伙伴蛋白有10种，其中7种为分子伴侣，另外3种为柠檬酸合酶(GltA)、F0F1 ATP合酶亚基β (AptD)和DNA导向的RNA聚合酶亚基β/β (RpoBC) (图 4)。本研究鉴定出的59种蛋白，30种在STRING数据库中有收录，其中8种是数据库中预测的GroEL功能伙伴蛋白。STRING数据库分别从基因邻接、基因融合、基因共现、基因共表达、实验数据、数据库数据、文本挖掘数据和同源性8个方面对蛋白的相互关系进行评分，高评分表示蛋白之间发生相互作用的可能性越大，本研究中鉴定出的蛋白质与GroEL的关系紧密度评分详见表 3。相互关系网络分析发现GroEL处于中心节点，整个网络可形成3个较为明显的分簇，如图 5所示，最大的簇是以绿色节点表示的16种蛋白所形成的网络，主要包括分子伴侣、尿素酶(UreA、UreB)、硫氧还蛋白(TrxA)、硫氧还蛋白二硫化物还原酶(TrxB)、过氧化氢酶(KatA)、黏附素HpaA和细胞毒素相关蛋白CagA等；其次是以红色节点表示的10种蛋白所形成的网络，主要是转录和翻译相关的蛋白；最小的簇是以蓝色节点表示的5种蛋白所形成的网络，包括3种与三羧酸循环相关的酶(GltA、FrdC、Mqo)和2种与ATP合成相关的酶(AtpA、AtpD)。

3 讨论与结论

在进行免疫沉淀或者Pulldown实验时，降低本底非特异性结合非常重要。本研究选择Protein G磁珠结合抗His标签抗体免疫沉淀的方法，可以从以下几个方面降低非特异性结合。首先，利用纯化后的GroEL蛋白与HP全菌蛋白提取液进行相互作用，可最大限度减少可能存在的高丰度E. coli蛋白的影响；其次，经过抗His标签抗体预先与Protein G磁珠结合，可以起到封闭磁珠及Protein G的作用，降低杂蛋白与磁珠及Protein G的非特异性结合。因此，当实验组中加入的GroEL蛋白含量占绝对优势时，极少量的E. coli杂蛋白及HP蛋白提取液中的非特异性结合蛋白对实验结果的影响是较为有限的。

作为分子伴侣，GroEL通常在细胞质中形成具有2个空腔的圆柱形寡聚体，并在GroES的协助下完成对底物蛋白的重新折叠。在大肠杆菌中，GroEL只能折叠其蛋白质组10%的蛋白^[11]，说明其折叠的底物存在一定的偏好性。进一步的研究发现，大肠杆菌中GroEL结合底物中丰度最高的52种蛋白主要为氨基酸、糖等代谢相关的酶类及参与转录翻译的蛋白质^[12]。本研究较为系统地鉴定出了HP中可能与GroEL结合的59种蛋白质，初步揭示了HP中分子伴侣GroEL的底物蛋白种类和数量，这为深入了解GroEL的生物学功能提供了重要的参考。

本研究鉴定出的蛋白质中，有19种参与各种代谢的酶类，8种参与转录翻译的蛋白，表明GroEL在维持代谢和蛋白质转录翻译中扮演着重要角色。本研究发现15种外膜蛋白，包括BabA、HpaA、SabA等重要黏附素，可能与GroEL结合。先前的研究表明，GroEL可定位在HP外膜上^[13]，也可出现在HP产生的膜外囊泡中^[14]，这都提示GroEL可能与外膜蛋白存在广泛的关联，但目前GroEL通过何种途径从胞质转位到外膜，以及其在外膜和膜外囊泡中的作用尚不明确。有研究报道，在斑疹伤寒立克次体中，外膜蛋白OmpB与GroEL在胞质内结合后共同转位到外膜^[15]，对于HP中的GroEL，是否也是外膜蛋白与之结合后共转位到外膜上，需要进一步研究证实。此外，有研究报道，GroEL与外膜蛋白OMPc是支气管败血博德特氏菌(Bordetella septicaemia)来源的膜外囊泡中的主要抗原，可以诱导小鼠产生保护性免疫反应^[16]，HP膜外囊泡中的GroEL能否发挥类似的作用，值得进一步探索。本研究发现，有10种与氧化还原相关的酶和蛋白可能与GroEL结合，提示GroEL在HP面临氧化应激时对于维持这些酶和蛋白的活性可能起作用，已有研究报道GroEL可协同亚砜还原酶(sulfoxide reductase)修复因氧化受损的过氧化氢酶(KatA)并恢复其活性^[17]。本研究发现，维持HP生存至关重要的尿素酶(UreA和UreB亚单位)可能与GroEL结合，提示GroEL在帮助HP适应严苛的胃内环境方面发挥着作用，其中UreA与GroEL的相互作用已经得到实验证实^[18-19]。此外，HP最重要的毒力因子CagA也可能与GroEL结合，提示GroEL可能参与CagA引起的机体病理损伤过程。

综上所述，本研究报道了HP中可与GroEL相互作用的蛋白质组成谱，功能分类和相互关系网络分析发现GroEL结合的蛋白质种类繁多，功能涉及HP代谢、转录翻译、氧化还原和黏附等，并参与HP生存适应、定殖及致病过程。GroEL有望成为一种新的研究HP致病性及发展感染干预策略的重要靶点。