南极洲是世界上海拔最高的大陆，具有高纬度、高辐射、强风、干燥和极寒等特点。南极洲98%的面积被冰雪覆盖，其中冰盖的平均高度有2 000多m (占全球淡水资源的70%)，仅在夏季(11月到3月)露出沿岸地带和冰盖边缘^[1]。尽管南极具备如此极端的气候和环境特征，南极各生境中仍然生活着丰富多样的微生物^[2-3]，因此南极不仅是研究生命耐受之极、生命起源和进化的绝佳天然实验室，也是分离培养新颖极端微生物资源的重要来源。

在南极冰川表面有一种特殊的生态环境被称为冰锥洞，也叫冰锥石、冰尘穴或冰尘洞(cryoconite)，是由低反照率颗粒物沉降在冰川表面融化而成的凹陷。这些沉积物组分类似于地表土壤，但是由大范围风场作用迁移而来，通常包含远距离输送的尘埃和气溶胶等，也有本地来源的各种碎屑和颗粒物^[4-5]。冰锥洞承载着活跃的微生物群落和生物地球化学循环^[6]，是冰川表面微生物活动的热点生境。早在2003年，Christner等^[7]就对南极冰锥洞的细菌和真核生物做了分子生物学鉴定，确定其主要来自于相邻湖冰中，他们推断该类生境可以作为生物避难所，因而冰锥洞生境具备微生物学、生物地球化学和生态学研究的重要性，成为研究南极冰表微生物群落形成、集合和功能的小尺度自然生态系。

极地微生物在地球物质循环及能量流动中扮演着重要的角色，发挥储存物质能量的作用^[8]，同时在它们的细胞内也存在着一些尚未被发现的潜在新型生物活性物质。因此针对极地环境中的微生物开展其多样性的研究更有利于微生物资源的开发和利用。近年来，随着高通量测序技术、宏基因组学等技术的快速发展，研究者们可以在基因水平解析微生物群体多样性，并对一些未培养或难培养微生物的代谢产物进行推测分析^[9]。但基于非培养的技术局限性也很明显，无法从中获取可培养的菌株，致使研究者们无法准确了解其外在形态、生理代谢特性、生态功能等，且分子生物学方法产生的数据如果缺乏基本的生理学实验数据支撑难以被解释。

微生物培养组学为未培养和难培养微生物的培养提供了可能的解决方法和思路。据称，自然环境中有99%以上的微生物处于活的非可培养(viable but non-culturable, VBNC)状态^[10]，这一类微生物通常都在休眠状态，靠极低的代谢活动提供生存所必需的物质和能量。限制培养的因素主要有以下几种：原位环境难以复刻、培养基的富营养化、微生物间的互作关系被破坏以及绝大多数微生物物种丰度低、生长速度慢等^[11]。因此改变培养基或设置新型培养基组合，发展微生物培养组学以提高环境中微生物的可培养率，成为微生物研究中的一项重要任务，是后续开展生理代谢和功能等研究的基础，也是微生物及其产物资源开发的前提。

近年来多数研究者通过改变培养基组分或通过不同培养基组合的方式^[12]，提高了可培养微生物的多样性，获得了很多新的微生物种群。Nichols等^[13]通过在普通培养基中添加5个氨基酸的短肽LQPEV，从海洋砂坪中分离得到了MSC33类型的未培养细菌。岳秀娟等^[14]在培养基中加入甜菜碱、丙酮酸钠或过氧化氢酶等化合物，使从土壤中分离到的微生物种类及菌落总数明显增加。Connon等^[15]采用高通量培养法对贫营养细菌进行培养和计数，使微生物可培养性较常规培养法高出1.4–120.0倍，并从海水分离到多株未培养的浮游细菌。这些研究的成功为之后合理设计培养条件得到更多未培养微生物提供了可借鉴的方法。

本研究采用了涵盖富营养、寡营养的4种普通培养基平行加入藤黄微球菌复苏促进因子(resuscitation promoting factor, Rpf)活性蛋白共8种培养基，旨在促进提升微生物可培养性。Rpf活性蛋白是由藤黄微球菌在对数期后期分泌的一种使自身从VBNC状态复苏的因子^[16-17]，其还能使部分处于VBNC状态的近缘高GC革兰氏阳性杆菌等菌种复苏生长^[18]。本研究展示了在不同营养条件下培养的南极乔治王岛冰川表面冰锥洞微生物的多样性。这一结果为优化多培养基组合，提高南极冰锥洞生境微生物的可培养性提供参考依据，同时也为可能存在的潜在新种研究提供了菌株资源，为进一步了解该特殊环境中可培养微生物多样性提供数据基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 采样点选择

乔治王岛(King George Island)是西南极南设得兰群岛最大的岛屿，位于62°23ʹS，58°27ʹW。柯林斯冰盖位于乔治王岛上，其面积约1 250 km²，平均厚度约2 000 m。在柯林斯冰盖上存在大量天然形成的冰锥洞，选取其中一处冰雪覆盖层较厚的地点作为本次研究的样品采集点。

1.1.2 样品处理和培养基选择

使用无菌铲将表面冰雪覆盖层刮去，取大约50 g冰锥洞样品，存于无菌密封袋中，–80 ℃保存，运输回国内实验室进行菌株分离培养。

设计富营养和寡营养两类培养基。富营养培养基主要是：胰酪大豆胨液体培养基(TSB培养基)和肉汤培养基(lysogeny broth培养基，LB培养基)，这2种培养基的营养成分丰富，可以给微生物提供丰富的营养物质，供给它们分解消耗；寡营养培养基是：R2A琼脂培养基(酵母浸出粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，酪蛋白水解物0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氢二钾0.3 g，无水硫酸镁0.024 g，丙酮酸钠0.3 g，添加ddH₂O至1 L)，其中可溶性淀粉能够吸附细菌有毒的代谢副产物，丙酮酸钠的抗氧化作用有利于受损微生物的修复。在R2A培养基基础上将用量减半(1/2 R2A培养基)进一步减少培养基中营养物质的含量。平行加入含Rpf活性蛋白的藤黄微球菌发酵液到上述4种培养基中，共设计了8种培养基。藤黄微球菌发酵液经0.22 μm针孔过滤器过滤后以1:10的比例加入到培养基中。

1.2 菌株分离纯化

–80 ℃样品冰上融化，取出5 g到50 mL离心管中，加入无菌水至20 mL，振荡混匀，冰浴超声30 min，再次振荡10 min，静置30 min。取上清进行不同浓度梯度(1:10、1:50、1:100)稀释，与未稀释上清一起涂布于设置的培养基上，15 ℃培养。平板上生长出的菌落进一步划线分离纯化，直到长出单一形态菌落。挑取单菌落于加入相应液体培养基的试管中进行后续培养，用于菌液PCR和菌种保藏。

1.3 菌种鉴定

对于上述操作得到的菌株进行物种鉴定，以菌株基因组DNA为模板对16S rRNA基因序列进行体外扩增。具体步骤如下：使用试剂盒(TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0)对已经活化的菌株提取基因组DNA，随后进行16S rRNA基因PCR扩增^[19]。上、下游引物分别为27F：5ʹ-AGAGTTT GATCMTGGC TCAG-3ʹ，1492R：5ʹ-GGTTACCT TGTTACGACT T-3ʹ。将1 500 bp的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。采用Chromas软件分析测序结果，去除质量不佳的测序碱基后，将拼接后约1 350 bp长度的序列在EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/)数据库中进行序列比对。参考Kim等^[20]基于基因组平均核苷酸相似性(average nucleotide similarity, ANI)进行物种分类的研究，发现95%左右的ANI值对应16S rRNA相似性为98.65%，可以作为潜在新种的判断标准。因此比对结果若相似度大于98.65%，则认为该菌株与其最相近菌株是同种；若相似度小于等于98.65%，则认为该菌株为潜在新种。

1.4 菌株系统发育分析

基于EzBioCloud数据库比对结果，下载数据库中与分离菌株最相似的标准菌16S rRNA基因序列，将所有分离菌株及其最相近标准菌的16S rRNA基因序列整合到FASTA文件中用于后续进化分析。将FASTA数据导入MEGA X软件中用邻接法设置运算次数为1 000构建系统发育树。

2 结果与分析 2.1 菌株多样性分析

本研究共分离纯化细菌407株，上述培养基分别分离得到的菌株个数以及潜在的菌种数见表 1。

经16S rRNA基因序列鉴定及系统发育分析，这407株菌株分属于5个门，18个科，29个属。门水平上，放线菌门(Actinomycetota)占总数的72.73%，其次是变形菌门(Proteobacteria)占总数的23.10%，厚壁菌门(Firmicutes)占总数的1.97%，拟杆菌门(Bacteroidota)占总数的1.47%，异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)占总数的0.74% (图 1A)。科水平上，共培养了18个科，数量最多的3个科分别是微杆菌科(Microbacteriaceae)，丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)和微球菌科(Micrococcaceae)，共占总数的58% (图 1B)。属水平上，共培养了29个属，冷杆菌属(Cryobacterium)和Lacisediminihabitans属占主要地位，每个属所占比例都在15%以上。其中Lacisediminihabitans属占比最高，约占总数的46%。以下几个属仅各分离获得了一株菌：Hymenobacter属、Janibacter属、Paracoccus属、Pseudarthrobacter属、Roseomonas属和Haematobacter属(图 1C)。以上结果证明，本研究冰锥洞样品中可培养的微生物具有较高的多样性。

2.2 不同培养基分离得到的微生物多样性比较

本研究8种培养基所分离出的菌中，不同培养基的优势种群不尽相同。以属水平举例：R2A培养基的优势属是Lacisediminihabitans属，1/2 R2A培养基的优势属是Cryobacterium属和Sphingomonas属，TSB培养基只分离出一个属Parafrigoribacterium属，LB培养基中没有比较明显的优势属，R2A+Rpf培养基的优势属是Polaromonas属，1/2 R2A+Rpf培养基中的优势属是Lacisediminihabitans属，TSB+Rpf培养基中的优势属是Parafrigoribacterium属。其中LB+Rpf培养基未分离到菌株(图 2)。

分离得到的菌株数量由高到低的顺序是：R2A培养基(188株)，1/2 R2A+Rpf培养基(144株)，1/R2A培养基(46株)，R2A+Rpf培养基(14株)，TSB+Rpf培养基(9株)，TSB培养基(3株)，LB培养基(3株)，LB+Rpf (0株) (表 1)。

可以看出R2A培养基和1/2 R2A+Rpf培养基分离得到的细菌明显多于其他培养基(图 2)。LB培养基和TSB培养基只各培养出3株，其中TSB培养基中培养到的3株菌都来自同一个属(Parafrigoribacterium)。R2A培养基中分离出的Lacisediminihabitans属的细菌最多，其余各属的分布比较少且均匀。其中一些培养基能分离出其他培养基分离不到的属，如LB培养基中分离出的3个属(Janibacter、Pseudarthrobacter、Micrococcus)未在其他培养基分离得到。

2.3 冰锥洞可培养微生物中的潜在新种

本研究所分离的407株细菌进化关系如图 3所示，其中69株菌与其最相似物种的16S rRNA基因相似度低于98.65%，为潜在新菌，占总分菌16.95%，大多数都是Lacisediminihabitans属以及Parafrigoribacterium属，分别属于12个属(图 4)。根据16S rRNA基因比对结果，初步确定此69株潜在新种的分类地位，包括放线菌门52株，变形菌门11株，拟杆菌门5株以及异常球菌-栖热菌门1株。另外对最相似的标准菌株分离所在环境研究后发现，这些菌株主要分离自各种土壤、冰川的冰芯、海水以及人体和动物临床标本等多种环境，而非来自冰锥洞生境。其中以非极地环境来源的为主(共34种)，部分来自极地环境(共6种)、人体和动物临床标本(共6种)。

按照培养基划分，69株潜在新种有44株分离自R2A培养基，8株分离自1/2 R2A培养基，7株分离自1/2 R2A+Rpf培养基，4株分离自R2A+Rpf培养基，3株分离自TSB培养基，3株分离自TSB+Rpf培养基。新菌率最高的是R2A培养基(12.29%)，其次是1/2 R2A培养基(1.97%)，最低的是TSB培养基和TSB+Rpf培养基(0.73%)。

3 讨论与结论

冰锥洞生境中的微生物来源比较多样且复杂，Millar等^[21]对来自北极和南极共15个地点的冰锥洞生境中的生物群落进行调查，在对其进行16S和18S rRNA序列分析后得到约24个细菌门和11个真核生物门，并发现南极冰锥洞生境中微生物种群较北极更为丰富。另外Poniecka等^[22]对来自南极洲、格陵兰岛和斯瓦尔巴群岛3个地方的共9个地点冰锥洞生境的样品中的生物群落进行调查，通过分离培养的方法成功得到了44株菌株，其中从南极样品中分得的有10种不同的细菌，并发现分离得到的菌株大多数与放线菌有关(79%)，其次是拟杆菌(18%)和变形杆菌(3%)。本研究中所得菌株大多数也属于放线菌，与其结果相似。Poniecka等^[22]在南极样品中分离得到的Cryobacterium属和Actimicrobium属的菌株，在本研究中也被分离得到。

本研究采用8种培养基，完成了407株菌的分离和鉴定，获得涵盖5个门，18个科，29个属的可培养菌株，且可能存在69个代表12个潜在新种的菌株，分离获得的菌株数量和新颖性远超过只使用单一培养基。其中放线菌门是最主要的微生物类群，而厚壁菌门、拟杆菌门和异常球菌-栖热菌门则占比较低。根据先前的研究，在南极地区微生物的主要优势种大多来自变形菌门和拟杆菌门^[23]，Poniecka等^[22]的实验中提到冰锥洞生境中的主要优势种为放线菌门，说明冰锥洞生境中的优势类群与南极地区其他环境中的优势类群不完全一致。本次研究站点分离出的优势种大多来自放线菌门，与Poniecka等^[22]的实验结果相一致，且Lacisediminihabitans属的含量最高。该属自2019年于韩国水库沉积物中首次被分离发现^[24]，随后2021年^[25]在南极长城站附近的沼泽地泥中也被分离到该属的一株新种。本研究获得多个菌株均与该属有较高16S rRNA基因序列相似性(98.65%)，但可能不同于已经鉴定的2个种，意味着这个属可能在南极低温环境中适应能力很好，且可能进一步经历了物种分化。此外，从最相似的标准菌株来源环境分析，本研究获得的菌株绝大多数跟来自非极地环境的标准菌株具有较高相似性，意味着有两种可能性：第一种，这些类群的微生物属于全球分布的物种(cosmopolitan taxa)，因此不存在显著的地域差异；第二种，这些类群是由风等大气运动从非极地环境搬送到南极冰川表面，跟冰锥洞的形成是吻合的。

与原位环境更相近的寡营养培养基，更容易分离得到一些可培养但未培养的微生物种群。本研究所用的R2A培养基及1/2 R2A培养基与LB培养基、TSB培养基相比，不同程度减少了培养基中的营养物质含量。在本研究中，Rpf在TSB这种富营养培养基中，有较好地提高菌株多样性和获得菌株数量的作用，但在R2A这种寡营养条件下并没有显著作用，说明Rpf活性因子在特定条件下可以激活细胞VBNC状态，使其复苏。极地极端环境属于典型的寡营养环境，在培养过程中，一些竞争力小、丰度低的微生物种群在营养物质丰富的环境中往往被压制。针对这类微生物，一般会通过样品稀释或培养基营养成分稀释来解决^[26]。本研究中R2A培养基和1/2 R2A培养基相较于TSB培养基和LB培养基属于寡营养培养基，但分离出的菌数量却更多，说明该生境下的微生物更偏好于寡营养的环境。可见，营养条件对于获得更多的可培养菌十分重要，以往利用富营养培养基这种单一的培养条件可能会使极地可培养细菌的多样性被大大低估。因此，在分离极地环境样品中的微生物时，降低培养基中的营养物质含量，有利于得到更为丰富和新颖的菌株资源^[27]。本研究采取贫营养培养基并添加Rpf的策略，得到了此前并未在冰锥洞生境分离得到的菌株。

微生物的VBNC状态是可复苏的，但对于这一状态的研究主要集中在流行病医学领域，对于环境微生物的研究相对较少^[28]。在极端环境中，很多微生物为了能够存活下去，会利用自身保护机制使自身处于休眠状态，复苏这一类微生物需要在培养基中加入一些活性因子，最常见的方式就是加入藤黄微球菌Rpf活性蛋白^[29]。本研究中，Rpf的加入对于富营养培养基TSB的促进作用是非常明显的，未加入Rpf的TSB培养基分离出的菌株有3株，潜在新种有1种，但在加入Rpf后分离菌株有9株，潜在新种有6株。另外加入Rpf的培养基中能够分离得到普通培养基中无法分离得到的菌株。例如Rhodanobacter属只在加入Rpf的培养基中分离得到。由此可见，添加该类复苏因子可以培养得到常规培养方式下得不到的微生物种类。

本研究通过不同的培养基及添加活性因子等方式，分离出一些常规培养方式无法分离得到的微生物种类，为后续培养“微生物暗物质^[30]”提供了借鉴思路和方法，后续可以通过设置更多的培养温度或改变分离时的上清稀释浓度等条件获得更丰富的微生物种类。在未来的研究中可以将高通量培养技术与传统的培养技术相结合，达到获得更多新菌种的目的。同时，对未培养微生物培养结果的分析可以指导和改进纯培养的方法和技术，设计针对性的分离方案，富集培养策略和检测技术，形成一系列模型化的增菌培养方法，形成多类型的“增菌培养基”^[31]，获得更多的可培养极地微生物，为深入研究微生物多样性、起源和进化^[32]、生理生态学等提供新理念和新机遇。