产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)目前仍是引起低收入国家儿童(特别是年龄小于5岁的婴幼儿)和到这些地方的旅行者腹泻的主要病原菌之一^[1-2]。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)最新统计，每年发生腹泻的儿童有数亿例，30.4%的旅行者也出现腹泻症状^[3]。ETEC每年引起的腹泻病例逾1.28亿例，造成超过84万人死亡^[4]。尽管在一些国家，卫生条件的改善已将风险降低至8%–20%，但是在全球旅行者腹泻病例中，由ETEC引起的病例占到总数的70%^[5]，此外，ETEC也是引起新生幼畜腹泻的主要病原菌。其中ETEC感染所引起的新生仔猪和断奶仔猪腹泻(post-weaning diarrhea, PWD)严重影响仔猪的成活率和生产水平，一直是困扰全球养猪业的主要疾病之一^[6-8]。ETEC表达的众多异质性黏附素和肠毒素(热敏肠毒素和热稳定肠毒素)是其引起腹泻的主要毒力因子。对ETEC致病机理的研究表明，在黏附素的介导下，ETEC首先黏附、定殖至宿主小肠上皮细胞，然后通过释放肠毒素导致肠黏膜通透性增加并刺激肠液过度分泌，最终引起腹泻。ETEC感染所致的腹泻不仅严重威胁着人类的健康，而且也给全球养殖业造成了巨大的经济损失。在很长一段时间内，抗生素在防治ETEC感染中发挥了至关重要的作用。但是，由于长期滥用抗生素而导致的细菌耐药、药物残留、环境污染等问题层出不穷，已经成为了全球公共卫生和食品安全领域关注的焦点^[9]。由于ETEC血清型与毒力因子众多、毒力因子异质性以及分泌的肠毒素本身具有强的毒性等问题，现有的F4/F5/F6三价和F4/F5/F6/F41四价灭活苗，Coliprotec^®F4单价和Coliprotec^®F4/F18二价活疫苗的免疫保护效果均还有待提高^[10]。因此，进一步阐明ETEC的致病机制、研制高效和广谱疫苗、挖掘药物靶点迫在眉睫。

凋亡(apoptosis)是细胞程序性死亡的一种严格控制模式，它包括半胱天冬酶(caspase)依赖性和caspase非依赖性两种途径，其中caspase依赖性途径是体内的细胞凋亡的主要途径^[11]。caspase依赖性途径包括由死亡受体和死亡配体相互作用介导的外源性凋亡途径以及由线粒体介导的内源性凋亡途径。在外源性凋亡途径中，死亡配体与死亡受体结合后，使caspase-8酶原通过自身切割转化为具有活性的caspase-8，并激活下游的caspase-3途径，从而诱导细胞凋亡^[12]。在内源性凋亡途径中，线粒体收到凋亡信号后会向细胞质中释放细胞色素c (cytochrome, Cytc)。Cytc、凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)和caspase-9酶原形成复合体并激活caspase-9，活化的caspase-9切割并激活caspase-3，最终引起细胞凋亡^[13]。机体可以通过诱导自身细胞凋亡来抵御病原体的入侵，但是另一方面，病原体既可以通过诱导过度的细胞凋亡引发机体损伤，也可以干扰细胞凋亡途径实现免疫逃避^[14]。一定程度的细胞凋亡是肠上皮细胞再生、自我修复和维持内环境稳定所必需的，但是过度的细胞凋亡会导致肠黏膜的通透性和渗透性增加，造成肠道黏膜屏障的损伤，从而导致炎症和腹泻。

虽然ETEC属于非侵袭性大肠杆菌，但是越来越多的研究表明，ETEC感染在体内、外模型中，均可诱导宿主肠上皮细胞过度凋亡，造成肠黏膜屏障损伤。本文重点总结了ETEC不同毒力因子诱导肠上皮细胞凋亡的具体分子机制，并就抗凋亡物质在预防ETEC感染的潜在应用进行了分析，旨为临床上有效防治ETEC感染提供新的思路。

1 ETEC全菌诱导肠上皮细胞凋亡

肠黏膜是肠道病原微生物的主要栖息地和最初定殖的场所。肠道病原菌常通过诱导宿主肠上皮细胞凋亡的方式来帮助其入侵和免疫逃逸，从而有利于它们在宿主体内的生存和扩散^[15]。Johnson等^[16]研究表明，尽管猪源ETEC感染可以激活仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2细胞凋亡信号途径中的caspase-3信号通道，但是用TUNEL染色后并没有观察到明显的DNA双链断裂现象。DNA双链断裂现象是细胞凋亡后期的主要特征，以上结果表明，ETEC感染主要诱导肠上皮细胞早期的凋亡，在细胞凋亡后期作用有限。越来越多的研究也表明，不管是在体外细胞模型还是体内，ETEC感染均可以诱导肠上皮细胞凋亡，导致肠道黏膜屏障的破坏，从而有利于ETEC的定殖和毒素输入。Zhou等^[17]在仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2体外细胞模型中通过转录组学分析F4ac⁺ ETEC感染组和未感染组差异表达基因发现，主要差异表达基因均与细胞凋亡过程相关，表明ETEC感染可以诱导体外肠上皮细胞凋亡。Wang等^[18]利用蛋白质组学分析F4ac⁺ ETEC感染组和未感染组中仔猪空肠中差异表达蛋白发现，两组主要差异表达蛋白均与细胞凋亡和细胞代谢相关，表明ETEC感染在体内同样可以诱导肠上皮细胞凋亡。进一步研究表明，F4ac⁺ ETEC感染仔猪后可以激活caspase-8和caspase-3信号通道，并且抑制caspase-9信号通道，表明ETEC在体内诱导仔猪小肠上皮细胞凋亡主要是通过激活外源性凋亡途径^[19]。为防止宿主细胞死亡，确保病原体在体内增殖、传播和存活，病原体已经进化出多种方法来干扰细胞凋亡途径。例如肠致病性大肠杆菌的NleF蛋白能够抑制caspase-8和caspase-9的活化，从而有利于其在机体内的存活^[14]。因此，ETEC感染后抑制caspase-9信号通路或许同样与其免疫逃避有关。Liu等^[20]虽然同样证明了ETEC感染在体内可以诱导仔猪肠道上皮细胞凋亡，但是认为其主要是通过激活内源性细胞凋亡途径。而在另一项研究中则表明，ETEC感染仔猪后可以同时激活外源性和内源性途径，从而诱导仔猪空肠和回肠上皮细胞的凋亡，加剧仔猪腹泻^[21-22]。不同ETEC菌株诱导仔猪小肠上皮细胞凋亡信号途径有所差异可能主要与它们表达的毒力因子不同相关，具体原因有待深入研究。当前关于ETEC感染诱导肠上皮细胞凋亡的研究主要集中于F4⁺ ETEC感染诱导仔猪小肠上皮细胞凋亡，人源ETEC感染是否可以诱导人小肠上皮细胞凋亡，以及表达不同菌毛黏附素的猪源ETEC感染是否也能够诱导小肠细胞凋亡均有待进一步的研究。

2 ETEC黏附素诱导肠上皮细胞凋亡

黏附素是介导ETEC最初黏附、定殖至宿主小肠上皮细胞的重要毒力因子。ETEC表达的黏附素种类众多，人源ETEC表达的定殖因子种类就多达20多种，猪源ETEC表达的菌毛黏附素包括5种(F4、F5、F6、F18和F41菌毛)。此外，ETEC还能表达多种非菌毛黏附素。ETEC黏附、定殖于宿主小肠上皮细胞是其感染的第一步，也是随后毒素分泌入细胞内的必须条件。对ETEC致病机理深入研究发现，黏附素除了介导ETEC与宿主小肠上皮细胞的黏附和定殖外，也是引起小肠上皮细胞凋亡的重要毒力因子^[23-24]。F4菌毛黏附素是猪源ETEC表达的主要黏附素，在体外仔猪肠上皮细胞模型IPEC-J2中研究表明，与野生株相比，F4acΔfaeG缺失株感染的IPEC-J2细胞中caspase-3、caspase-8和caspase-9的酶活性均显著降低，致使小肠上皮细胞凋亡和肠道黏膜屏障损伤程度均减轻，表明了F4菌毛是ETEC感染诱导肠上皮细胞凋亡的重要毒力因子^[25]。在最新的研究中，Li等^[26]发现F4⁺ ETEC感染可以刺激IPEC-J2细胞中肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-8和IL-6炎性基因表达显著升高。TNF-α是细胞凋亡通路外源性途径中经典的死亡配体。因此，F4菌毛可能是通过刺激肠上皮细胞TNF-α的产生，从而诱导宿主肠上皮细胞凋亡。但是F4菌毛在体内是否也能诱导仔猪小肠上皮细胞凋亡，以及诱导细胞凋亡的具体分子机制均有待进一步的研究。鞭毛作为一种黏附素，在介导F4⁺ ETEC和F18⁺ E. coli与仔猪肠道上皮细胞的黏附过程中发挥重要的作用^[27-28]。同时作为一种重要的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAPMs)，鞭毛蛋白在胞内可以激活NLRC4信号途径，刺激IL-1β和IL-18细胞因子的分泌，从而诱导细胞凋亡^[29-31]。鞭毛是否参与了ETEC感染引起肠上皮细胞凋亡目前还没有相关报道。

3 肠毒素诱导肠上皮细胞凋亡 3.1 热敏肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT)诱导的细胞凋亡

依据LT的抗原性和基因序列的不同，LT肠毒素可以分为LTI (通常表述为LT)和LTII (LTIIa、LTIIb和LTIIc)两种血清型^[32]。LT肠毒素是ETEC分泌的两类肠毒素之一，属于典型的AB₅毒素，全毒素包括一个A亚基和5个B亚基组成的五聚体。LT肠毒素与霍乱弧菌分泌的霍乱毒素(cholera toxin, CT)在结构、免疫原性、生物学活性以及作用机理上均高度相似^[33]。已有研究表明，CT毒素可以诱导CD8⁺ T细胞、人肺癌细胞、鼠骨髓单核白细胞病细胞和小鼠脾细胞等多种细胞发生凋亡^[34-35]。此外，AB₅家族毒素的另一成员，由志贺氏菌分泌的志贺毒素(Shiga toxins, Stxs)也可以通过激活多种信号途径诱导内皮细胞等多种细胞凋亡，但是在不同的细胞中的机制并不完全相同^[36-37]。以上结果揭示AB₅家族毒素可以通过诱导细胞凋亡而促进病原菌感染，LT肠毒素也可能与ETEC诱导的肠上皮细胞凋亡相关。

近年来研究发现，LT肠毒素不仅具有强的细胞毒性，在促进细菌黏附、免疫调节等方面同样发挥重要的作用^[38-39]。已有研究表明，ETEC分泌的LT肠毒素可以诱导淋巴细胞凋亡。LT肠毒素在体内可以诱导B淋巴细胞和T淋巴细胞凋亡，并且LT肠毒素诱导未成熟淋巴细胞和成熟淋巴细胞凋亡的机制不相同^[40-44]。LT诱导未成熟淋巴细胞凋亡是通过激活线粒体caspase依赖性凋亡途径，并且在糖皮质激素的参与下完成的。LT诱导成熟淋巴细胞凋亡则是依赖于其B亚基与GM1受体的结合。LTB亚基与GM1受体结合后会激活CD8⁺ T细胞的caspase-3和NF-κB信号途径，使Myc蛋白的表达量升高，进而诱导Cytc释放和激活caspase蛋白水解级联反应，从而诱导细胞凋亡。LT毒素诱导未成熟淋巴细胞和成熟淋巴细胞凋亡的机制的不同主要是因为不同成熟期的淋巴细胞表面表达的分子不一样。

LT肠毒素不仅可以诱导淋巴细胞凋亡，还可以诱导机体小肠上皮细胞凋亡。Johnson等^[16]在体外仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2模型中研究发现，LT肠毒素刺激虽然可以激活caspase-3，但是并未观察到细胞DNA断裂现象。以上结果表明，在ETEC感染诱导的小肠上皮细胞凋亡过程中，LT肠毒素在细胞凋亡早期发挥作用。最近的一项研究发现，LT肠毒素在体外还可以诱导人结直肠腺癌细胞HCT-8和人结肠腺癌细胞Caco-2发生细胞凋亡^[45]。LT肠毒素诱导肠上皮细胞凋亡依赖于激活内质网应激信号通路(PERK-eIF2-ATF4-CHOP)。而利用RNA干扰技术抑制CHOP蛋白的表达后，LT诱导肠上皮细胞凋亡也明显得到抑制。本课题组前期在利用转录组学分析F4ac⁺ ETEC野生株和F4acΔeltAB缺失株感染IPEC-J2细胞前后基因表达的变化发现，感染缺失株的IPEC-J2细胞中多种与细胞代谢和细胞凋亡信号通路相关的基因表达量显著降低，进一步表明LT肠毒素是F4ac⁺ ETEC感染诱导仔猪小肠上皮细胞凋亡的重要毒力因子。

此外，LTII肠毒素也能够诱导多种细胞发生凋亡。LTII肠毒素诱导不同细胞凋亡的能力主要依赖于其LTB亚基与细胞表面表达的受体的结合能力。Arce等^[46]证明LT-IIa肠毒素可以诱导CD8⁺ T淋巴细胞凋亡。LT-IIa诱导CD8⁺ T细胞凋亡主要依赖于LTB亚基与CD8⁺ T细胞表面的GD1b受体的结合。LT-Ⅱb由于与GD1b受体的亲和力较低，所以并不引起CD8⁺ T淋巴细胞凋亡。最近，Masso-Welch等^[47]证明LT-Ⅱc刺激可以激活三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)细胞BT549和MDA-MB-231细胞中caspase 3/7信号通路，从而诱导细胞凋亡。虽然LTII可以诱导CD8⁺ T淋巴细胞和TNBC细胞凋亡，但是其是否可以诱导肠上皮细胞凋亡还不清楚。此外，不同血清型LT肠毒素诱导不同细胞凋亡的具体分子机制，LT的2个亚基在诱导细胞凋亡中的作用，以及LT肠毒素诱导细胞凋亡与ETEC致病机制的关系等均有待深入研究。

3.2 热稳定肠毒素(heat-stable enterotoxin, ST)诱导的细胞凋亡

ST肠毒素是ETEC分泌的一种少于50个氨基酸的多肽分子，具有热稳定性，包括STa (猪源的STp和人源的STh)、STb和EAST1。STa通过结合和激活肠上皮细胞上的鸟苷酸环化酶C (GC-C)，使细胞内环一磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)浓度升高，从而激活cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ (cGMPKII)，导致囊性纤维化跨膜传导因子(cystic fibrosis transmembrane conduction factor, CFTR)磷酸化进而诱导Cl^–和HCO₃^–以及肠腔内的净液体分泌，最终引起腹泻^[6]。除引起腹泻外，STa肠毒素的产生也可引起细胞凋亡。Zhou等^[48]研究发现，STp肠毒素刺激可以引起小鼠小肠上皮细胞系MODE-K和仔猪小肠上皮细胞系IPEC-J2细胞凋亡。STp肠毒素可以通过抑制Wnt/β-catenin的膜受体Frizzled7 (FZD7)的表达水平，阻断Wnt/β-catenin信号途径，从而诱导细胞凋亡。因为Wnt/β-catenin信号通路是肠上皮细胞的有序更新的重要信号通路，该研究为我们临床上有效防治ETEC感染引起的肠损伤提供了一种新的靶点和策略。最近另一项研究表明，利用人源的尿鸟苷素(STa类似物)处理人源的结肠癌腺细胞T84，可以刺激细胞内cGMP升高，进而诱导细胞发生凋亡，并且激活cGMP信号级联的激素和神经递质都能使靶细胞发生凋亡^[49]。因此，STa诱导细胞凋亡的机制可能与其刺激细胞内cGMP升高有关。

除了STa肠毒素，STb肠毒素也可以诱导细胞凋亡。利用纯化的STb肠毒素处理人回盲肠癌细胞系HRT-18和大鼠回肠细胞系IEC-18后，可以刺激细胞内caspase-9和caspase-3的表达量增加，而caspase-8的表达量没有变化，表明了STb肠毒素是通过激活内源性细胞凋亡途径诱导细胞凋亡^[50]。EAST1肠毒素是否可以诱导细胞凋亡目前还没有相关报道。

4 抗凋亡物质在预防ETEC感染中的潜在应用

ETEC感染诱导的肠上皮细胞大量凋亡会损伤宿主肠道黏膜屏障，从而有利于菌株的定殖和肠毒素分泌进入胞内，使其致病性增强。在畜牧业中，大多数国家都限制在ETEC感染中预防性使用抗生素，越来越多的抗生素替代品正在开发中，以减轻肠道炎症，保护肠道健康^[26]。目前一些研究发现，在饲料中添加某些抗凋亡物质可以有效减轻ETEC感染过程中引起的机体肠道损伤。Gong等^[51]的研究表明，在仔猪饲料中添加l-茶氨酸(LTA; γ-谷氨酰胺)能够显著提高肠道细胞中抗凋亡分子Bcl-2的表达水平，同时降低促凋亡分子Bax和caspase-3切割产物蛋白的表达，从而抑制ETEC感染诱导的肠道上皮细胞凋亡。Wan等^[21]的研究表明，海藻酸寡糖(alginate oligosaccharide, AOS)能抑制TNFR1、caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达，同时抑制内源性和外源性细胞凋亡途径，从而减轻ETEC引起的断奶仔猪肠道黏膜损伤，保护肠道黏膜屏障。AOS作为一种多糖，本身具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和抗微生物作用。因此，其可能具有作为“替抗”产品添加于仔猪饲料的潜力，以用于防治ETEC感染引起的仔猪腹泻。此外，该团队发现在基础日粮中添加100 mg/kg的另一种寡糖低分子量的壳聚糖(LMWC)同样能抑制仔猪空肠和回肠细胞的凋亡率，减轻肠上皮细胞损伤，从而保护仔猪肠道的屏障功能，减轻仔猪的腹泻症状^[52]。厚朴皮质是一种用于治疗胃肠功能障碍的中药，它的功能性成分厚朴酚与和厚朴酚被报道可以通过抑制炎症细胞因子过度产生而延缓细胞凋亡过程，从而保护肠道黏膜完整性和调节胃肠功能紊乱^[24]。此外，Liu等^[20]报道在饲料中添加黑水虻幼虫可以抑制ETEC感染引起的仔猪回肠细胞凋亡，保护肠道屏障不受损害。越来越多证据表明，饲料中添加抗凋亡物质能有效拮抗ETEC感染诱导的肠上皮细胞凋亡，保护肠道黏膜屏障的完整性，减轻ETEC感染引起的腹泻症状。因此，利用抗凋亡治疗来防治ETEC感染可能是临床上的一种新策略。

5 小结与展望

一定程度的细胞凋亡是机体抵御外源性病原体侵袭的一种“自我保护”反应，但是另一方面过度的细胞凋亡会损伤机体肠道黏膜屏障，破坏机体的免疫防御屏障。目前还不明确，ETEC感染诱导肠上皮细胞凋亡到底是机体的一种自我防御行为，还是ETEC逃避宿主免疫反应一种策略。另外，虽然已经发现ETEC产生的多种黏附素和肠毒素均可以诱导细胞凋亡，但是具体哪种毒力因子发挥主导作用、各种毒力因子诱导细胞凋亡的信号通路和具体分子机制等仍不清楚。明确ETEC诱导细胞凋亡的机制和意义，有利于进一步深入阐明ETEC与宿主细胞相互作用的机理和致病机制。在当前全国饲料中全面禁止添加抗生素、人ETEC感染无疫苗可用和兽用ETEC疫苗免疫保护效果不佳的大背景下，抗凋亡治疗可能为研制防治ETEC感染的高效药物和新型菌苗提供了一种新的靶点和策略。