微生物学报  2023, Vol. 63 Issue (6): 2415-2429   DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20220716.
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220716
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会

文章信息

洪莘, VirkMuhammad Safiullah, 陈福生. 2023
HONG Shen, VIRK Muhammad Safiullah, CHEN Fusheng.
红色红曲菌M7的丝衣霉酸基因簇及其功能研究
Study on the byssochlamic acid gene cluster of Monascus ruber M7 and its function
微生物学报, 63(6): 2415-2429
Acta Microbiologica Sinica, 63(6): 2415-2429

文章历史

收稿日期：2022-09-21
网络出版日期：2022-12-01
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引用本文
洪莘, Virk Muhammad Safiullah, 陈福生. 红色红曲菌M7的丝衣霉酸基因簇及其功能研究[J]. 微生物学报, 2023, 63(6): 2415-2429.
Hong Shen, Virk MuhammadSafiullah, Chen Fusheng. Study on the byssochlamic acid gene cluster of Monascus ruber M7 and its function[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2023, 63(6): 2415-2429.
红色红曲菌M7的丝衣霉酸基因簇及其功能研究
洪莘 , Virk Muhammad Safiullah , 陈福生     
华中农业大学食品科学技术学院, 湖北 武汉 430070
收稿日期：2022-09-21；接受日期：2022-11-27；网络出版日期：2022-12-01
基金项目：国家自然科学基金(31730068，31330059)
摘要：[目的] 明确红色红曲菌(Monascus ruber) M7的基因组中是否存在丝衣霉酸(byssochlamic acid, BA)基因簇，并探讨BA基因簇中聚酮合酶基因mr-Bys及3-羟酰基辅酶A脱氢酶基因mr-hdh对BA产生的影响。[方法] 采用生物信息学方法对M7基因组进行分析，以确定BA候选基因簇；以基因敲除及过表达方法研究mr-Bys和mr-hdh对BA产生的影响；以超高效液相色谱(ultra-performance liquid chromatography, UPLC)和质谱(mass spectrometry, MS)方法分析BA。[结果] 在红色红曲菌M7基因组中发现了BA基因簇，敲除mr-Bys后，BA消失，而敲除和过表达mr-hdh均可影响BA的产生。[结论] 红色红曲菌M7基因组中存在BA基因簇，可产生BA。研究结果不仅丰富了红曲菌次生代谢产物及其合成途径的相关研究，也为以红曲菌为菌种开发新产品奠定了基础。
关键词：红曲菌    丝衣霉酸    次级代谢    聚酮合酶    3-羟酰基辅酶A脱氢酶    
Study on the byssochlamic acid gene cluster of Monascus ruber M7 and its function
HONG Shen , VIRK Muhammad Safiullah , CHEN Fusheng     
College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China
Received: 21 September 2022; Accepted: 27 November 2022; Published online: 1 December 2022
*Corresponding author: CHEN Fusheng, Tel/Fax: +86-27-87282111, E-mail: chenfs@mail.hzau.edu.cn.
Foundation item: This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31730068, 31330059)
Abstract: [Objective] To determine whether the byssochlamic acid (BA) gene cluster exists in the genome of Monascus ruber M7, and to explore the effect of polyketide synthase gene mr-Bys and 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase gene mr-hdh in BA gene cluster on BA production. [Methods] The M7 genome was analyzed by bioinformatics methods to identify the BA candidate gene clusters. The effects of mr-Bys and mr-hdh on BA production were studied by the gene knockout and over-expression methods. BA was analyzed by ultra-performance liquid chromatography (UPLC) and mass spectrometry (MS). [Results] A BA gene cluster was found in the genome of M. ruber M7. After knocking out mr-Bys, BA disappeared, while both knockout and over-expression of mr-hdh affected BA production by M. ruber M7. [Conclusion] There is a BA gene cluster in the genome of M. ruber M7, which can produce BA. The research results enrich the research on the secondary metabolites of Monascus spp. and their synthetic pathways and lay a foundation for the development of new products using Monascus spp.
Keywords: Monascus spp.    byssochlamic acid    secondary metabolites    polyketide synthase    3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase    

丝状真菌红曲菌(Monascus spp.)又称红曲霉，是在我国有近2 000年应用历史的传统发酵产品——红曲(米)的生产菌种[1-2]。红曲菌可产生红曲色素(Monascus pigments, MPs)[3-5]和莫纳可林K (monacolin K, MK)[6-7]等多种有益的次级代谢产物(secondary metabolites, SMs)。同时，某些红曲菌株也可产生真菌毒素桔霉素(citrinin, CIT)[8-12]。近年来，围绕红曲产品中MPs和MK含量的提高[13-14]以及CIT含量的控制[15-16]，已有很多相关研究报道。目前，我国红曲产品中的CIT问题已经得到很好解决[17]。关于红曲菌MPs和CIT的基因簇(gene cluster)及其生物合成途径也已明确[18-20]。

基因组分析发现，在红曲菌基因组中，除合成MPs、MK和CIT的相关基因外，在红色红曲菌(M. ruber) M7的基因组中还发现了丝衣霉酸(byssochlamic acid, BA)聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)基因mr-Bys (byssochlamic acid PKS gene from M. ruber M7)[21]。这预示着红曲菌还可能产生BA。BA是由C7–C9碳环和1个或2个马来酸酐(maleic anhydride)组成的马来酰亚胺(maleidrides)类SMs中的一种[22]。它于1933年首次从纯黄丝衣霉(Byssochlamys fulva)的代谢产物中分离得到[23]，由1个九元(C9)碳环和2个马来酸酐组成[24]。由于马来酰亚胺类化合物的结构独特性[25]以及有望开发成抗真菌剂和除草剂等[26]，所以这类真菌SMs的基因簇与生物合成途径已成为近年来的研究热点[27-28]。

本实验室前期在红色红曲菌M7基因组中发现了BA的PKS基因mr-Bys[21]，但关于BA基因簇及其功能目前仍不清楚。本研究首先分析了红曲菌M7基因组中的BA基因簇，然后分别构建了BA基因簇中mr-Bys和3-羟酰基辅酶A脱氢酶基因mr-hdh (3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase gene from M. ruber M7)的敲除菌株以及mr-hdh的过表达菌株，并分析了这些敲除与过表达菌株的形态特征及产BA能力的变化。研究结果丰富了红曲菌产SMs的种类及其产生机理，也为研发红曲新产品奠定了理论基础。

1 材料与方法 1.1 菌株和培养基

红色红曲菌M7[29]：出发(原始)菌株，保存于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)斜面上。

诱导培养基(inducing media, IM)和潮霉素与新霉素筛选培养基：用于BA基因簇中相关基因敲除和过表达菌株的筛选。PDA、麦芽提取物琼脂培养基(malt extract agar, MA)、察氏酵母提取物琼脂培养基(Czapek yeast extract agar, CYA)和25%甘油硝酸盐琼脂培养基(25% glycerol nitrate agar, G25N)，用于红曲菌M7及其基因敲除和过表达菌株的形态学研究。米饭培养基用于红曲的制备。这些培养基的详细配方见参考文献[30]。

1.2 丝衣霉酸基因簇的生物信息学分析

基于NCBI截至2022年7月已发布的微生物基因组信息与纯黄丝衣霉中BA聚酮合酶Bfpks1的氨基酸序列[26]，采用MEGA 7.0[31]分析并绘制了来自于不同真菌与Bfpks1同源(同源性 > 40%)的BA聚酮合酶系统发育树。以antiSMASH[32]预测了红曲菌M7基因组中的BA基因簇，并以Clinker绘制基因簇图谱[33]。

1.3 基因敲除及过表达菌株的构建

分别对红曲菌M7的BA基因簇中的mr-Bys和mr-hdh进行敲除并对mr-hdh进行过表达。基因敲除与过表达的步骤详见本实验室已建立的方法[34, 30]。主要过程如下：

以潮霉素抗性基因(hyg)通过定点同源重组替代目的基因，分别构建敲除菌株Δmr-Bys和Δmr-hdh。首先，将mr-Bys或mr-hdh基因的2个侧翼序列插入hyg的5′和3′端，并通过double-joint PCR分别构建mr-Bys和mr-hdh的敲除盒pM-mr-Bys和pM-mr-hdh (数据已提交到国家微生物科学数据中心NMDC，见NMDCX0000154中的图S1)。以Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切pM-mr-Bys和双元载体pCAMBIA3300，将敲除盒连接到质粒pCAMBIA3300中构建mr-Bys的敲除载体pC-mr-Bys (见NMDCX0000154中的图S2)，以限制性内切酶验证其正确性(见NMDCX0000154中的图S3)。同时，以Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切pM-mr-hdh和pCAMBIA3300，将敲除盒连接到质粒pCAMBIA3300中构建mr-hdh的敲除载体pC-mr-hdh (见NMDCX0000154中的图S4)，以限制性内切酶验证其正确性(见NMDCX0000154中的图S5)。随后，将mr-Bys和mr-hdh敲除载体，分别导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105中，并以农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium-mediated transformation method)转移到红曲菌M7的细胞中[30]，并在含有30 μg/mL潮霉素B的PDA上筛选可能的基因敲除子Δmr-Bys和Δmr-hdh。

以同样方法构建mr-hdh的过表达菌株。依次将mr-hdh的5′侧翼序列、G418抗性基因、trpC启动子与mr-hdh的3′侧翼序列(含mr-hdh目的基因)融合连接，构建mr-hdh的过表达盒pM-OE-mr-hdh (见NMDCX0000154中的图S6)，并以Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切pM-OE-mr-hdh和pCAMBIA3300 (见NMDCX0000154中的图S7)，将过表达盒导入pCAMBIA3300中构建过表达载体pC-OE-mr-hdh，通过限制性酶切验证其正确性(见NMDCX0000154中的图S8)，然后将mr-hdh过表达载体导入根癌农杆菌EHA105中，并转移到红曲菌M7中后，在含有G418 (15 μg/mL)的PDA平板上筛选可能的基因过表达子M7:: PtrpC-mr-hdh。

以上实验采用的相关引物见表S1 (NMDCX0000154)。

1.4 基因敲除与过表达子的鉴定

以1.3中得到的可能基因敲除子与过表达子的基因组DNA为模板，以相应引物(表 1)扩增mr-Bys、mr-hdh、hyg和G418，以Southern杂交验证基因敲除子与过表达子的正确性。如不能扩增出mr-Bys或mr-hdh的DNA片段但可扩增hyg的DNA片段，则表明基因敲除成功，得到基因敲除子Δmr-Bys或Δmr-hdh；如可同时扩增mr-hdh和G418的DNA片段，则表明基因过表达成功，得到基因过表达子M7:: PtrpC-mr-hdh。

表 1. Southern杂交验证中使用的引物 Table 1. Primers used in Southern hybridization validation
Primer Sequence (5′→3′) Description
mr-Bys-F GCTCAGTGGTGTGGAATGGG For amplification of the partial mr-Bys gene which was used as probe 2 to calculate the validity of the gene knockout
mr-Bys-R ACGCTGGATGGGCTGTTGAC
mr-Bys-UP CCGTTCAGATTGCCATTGTCG For amplification of the partial mr-Bys gene which was used as probe 8 to calculate the validity of the gene over-expression
mr-Bys-DO CCAGTATGTGTTAGTGTGATTC
mr-hdh-F TCAGTTCCACCCTGTCTA For amplification of the partial mr-hdh gene which was used as probe 3 to calculate the validity of the gene knockout
mr-hdh-R CTCTTGCTCTTGTTGCTC
mr-hdh-UP CAAGAGTCCTTGCTGGAT For amplification of the partial mr-hdh gene which was used as probe 5 to calculate the validity of the gene over-expression
mr-hdh-DO ACACCGTTAATCACTCCC
表选项

1.5 菌株形态学观察

将出发菌株红曲菌M7及其基因敲除子(Δmr-Bys或Δmr-hdh)和过表达子(M7:: PtrpC-mr-hdh)分别接种于PDA斜面上，28 ℃培养10 d后，以适量无菌水洗涤并收集分生孢子，调整孢子浓度为1×105个/mL[35]。分别将1 μL孢子液点接于PDA、CYA、G25N和MA培养基平板的中心，28 ℃倒置培养11 d后，观察菌落颜色、大小以及气生菌丝生长情况等。同时，将无菌盖玻片以45°插片于采用涂布法接种了M7及其基因敲除子和过表达子孢子后的PDA、CYA、G25N和MA平板培养基中，28 ℃倒置培养11 d后，观察闭囊壳与分生孢子等显微形态。

1.6 丝衣霉酸分析 1.6.1 丝衣霉酸提取

按4%的接种量，将孢子浓度为1×105个/mL[35]的红曲菌M7及其基因敲除子和过表达子孢子液分别接种于米饭培养基中，28 ℃静置培养11 d，每隔2 d取样，40 ℃干燥至恒重后，粉碎并过40目筛得红曲米粉。将3 g红曲米粉置于20 mL石油醚(30–60 ℃)中，充分混合后，过滤，滤液于40 ℃真空蒸发至干，以2 mL乙腈溶解浓缩物，备用。

1.6.2 丝衣霉酸检测

以超高效液相色谱(ultra-performance liquid chromatography, UPLC, Waters ACQUITY)检测BA的含量，具体参数为：C18柱(Waters, 2.1 mm× 100 mm, 1.7 μm)，柱温40 ℃，进样量2 μL，流速0.3 mL/min，梯度洗脱。梯度洗脱程序为：先将乙腈: 超纯水: 0.1%甲酸水溶液按35:55:10的比例保持3 min，然后按75:15:10比例保持15 min，再按90:0:10比例保持5 min，最后，按35:55:10比例平衡色谱柱3 min。采用二极管阵列检测器。

1.6.3 丝衣霉酸的分离及鉴定

采用半制备高效液相色谱通过Inertsil ODS-3色谱柱(10 mm×250 mm×5 μm，岛津)分离1.6.1的BA提取物，柱温30 ℃，流速为3 mL/min，流动相为80:20的乙腈: 0.1%甲酸水溶液，检测波长为249 nm。

采用Acquity TQD串联四重质谱仪(Waters)，以电喷雾电离源在负离子模式下分析BA的质量分布图。

1.7 转录水平分析

分别将红色红曲菌M7、M7:: PtrpC-mr-hdh、Δmr-hdh和Δmr-Bys的孢子液(105个/mL)涂布接种于铺有玻璃纸的PDA平板上，28 ℃静置培养，于第3天和第7天时刮取菌丝，参照全式金高纯度RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA。

按照Hiscript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转试剂盒的说明书配制体系合成cDNA。

对红曲菌M7、M7:: PtrpC-mr-hdh、Δmr-hdh和Δmr-Bys中的BA基因簇内全部基因进行转录水平分析，以beta-actin基因为内参，利用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, RT-qPCR)反应。所用引物如表 2所示。

表 2. RT-qPCR所用引物 Table 2. Primers used in real-time quantitative PCR
Gene Upstream primer (5′→3′) Downstream primer (5′→3′)
beta-actin TCTGGCACCACACATTCTACAA CGAAGACGATCTGGGTCATCT
mr-nuc GGATCTACTCACCTCGCCTC GAGGGCGTGAATTCATCCAC
mr-oxo CTCTCCTCGAAATTGCAGCC CATGAACTCGAAGCGACAGG
mr-tf2 TCTCCGATCCACATCTCAGC AGATCTCTTCGCCCACTCTG
mr-hdh AACCTCCGGATCAACACCAT CGAGACGGGTGAGACTATCC
mr-tf1 GACTATCTCAACCCGGCTGA CGTAACAGGCAAGAACACCC
mr-Bys TTTGGAACCGTCGACAACAC TCTGGTGGCCTGCATTAAGA
mr-hd CTTCGGGCTTCTTGGTTCAC CAGCGCCAGAGAAAACTTGT
mr-cs ACTGTCCTGTTTCCGACGAT TTCCCGTCTTCACTTCCTCC
mr-amp AGGGTTTCAAGACGGTCGAT GCAATCCCAGTACGACGTTC
mr-md TCCCTCGGATAACATCGGTG CCCGAATTCATGGAACGCAT
mr-pho ACACTGACCGAATAAACGCG GGGATTTCGTATCGGGTTGC
mr-pt GAACATGAGGTCCCTGGTGA CTTCGTTCATGTGCCGGTAG
mr-mfs CGGTCTGATCACGCTTCTTG TGTACTTCCCGGACATGACC
mr-hy GCATAATCGGCCCTTTCTCG GTACGTGCCGGTGTAGTAGA
表选项

其中，目的基因与内参基因相对表达水平根据2–ΔΔCt计算[36]。

A=Ct (目的基因，待测样本)–Ct (内参基因，待测样本)

B=Ct (目的基因，对照样本)–Ct (内参基因，对照样本)

相对表达水平=2–(A–B)

2 结果与分析 2.1 丝衣霉酸基因簇的生物信息学分析

以纯黄丝衣霉(B. fulva)丝衣霉酸(BA)聚酮化合酶Bfpks1[26]的氨基酸序列为参考，采用BLASTp对NCBI的蛋白质数据库进行比对，共发现了相似度大于40%的Bfpks1的同源蛋白74个(见NMDCX0000154中的表S2)。以MEGA 7.0构建了Bfpks1及其同源蛋白的系统发育树(图 1)。

图 1 丝衣霉酸聚酮合酶及其同源蛋白的系统发育树 Figure 1 Phylogenetic tree of polyketide synthases of byssochlamic acid and its homologous proteins.
图选项

由图 1可知，BA的PKS同源蛋白广泛存在于真菌的基因组中，它们聚为4个簇(Ⅰ–Ⅳ)。其中，15株红曲菌(红色字体部分)中的紫色红曲菌(M. purpureus) GB-01、YJX-8和红色红曲菌FWB13中BA的PKS同源蛋白，与柱顶孢霉(Scytalidium album)及小梅衣属(Imshaugia aleurites) BA的PKS同源蛋白聚为一个簇(Ⅱ)，而其他12株红曲菌的BA的PKS同源蛋白与曲霉属(Aspergillus)等的BA聚酮合酶聚为另一个簇(Ⅰ)。这表明，不同红曲菌株中BA的PKS同源蛋白可能来源不同。

基于红曲菌BA的PKS同源蛋白，以antiSMASH对15株红曲菌基因组中BA基因簇进行预测，以Clinker比对BA基因簇中各基因编码蛋白质的同源性，并绘制比对图(图 2)。

图 2 红曲菌丝衣霉酸基因簇中各基因编码蛋白的同源性比对 Figure 2 Homology alignment of the proteins encoded by each gene in the Monascus BA gene cluster.
图选项

从图 2可知，不同红曲菌中BA基因簇的基因数量不一，最多的达15个基因，例如紫色红曲菌9903-01和R6；少的则仅为8个基因，如紫色红曲菌HQ1。在红曲菌BA基因簇中相同基因的同源性也存在差异(详情见NMDCX0000154中的表S3)。另外，在所有红曲菌BA基因簇中均未发现产生BA所必需的二聚化相关基因，即与酮类固醇异构酶(ketosteroid isomerase, KI)和磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein, PEBP)类似的基因[26] (见NMDCX0000154中的表S3)。这预示着红曲菌必须由BA基因簇之外的KI和PEBP同源基因参与，才可能合成BA。

2.2 基因敲除及过表达子的验证

以农杆菌介导的基因重源重组方法，共获得mr-Bys的可能敲除子3株，mr-hdh敲除与过表达子各2株。以表 1中相关引物对上述可能的mr-Bys敲除菌株和mr-hdh敲除与过表达子，进行Southern杂交验证，分别获得mr-Bys的敲除子(Δmr-Bys) 3株，mr-hdh敲除(Δmr-hdh)与过表达子(M7:: PtrpC-mr-hdh)各2株。其中，1株mr-Bys的敲除子、1株mr-hdh敲除子与1株mr-hdh过表达子的Southern杂交结果如图 3所示。

图 3 基因敲除及过表达菌株的Southern blotting验证 Figure 3 Southern blotting validation of gene knockout and over-expression strains. M: Marker; A: Identification of mr-Bys knockout strains by Southern blotting. Lane 1: Presence of hyg in Δmr-Bys strain; Lane 2: Absence of mr-Bys in the mutant; Lane 3: Presence of mr-Bys in M. ruber M7; Probe 1: Digoxin labeled hyg gene; Probe 2: Digoxin labeled mr-Bys gene. B: Identification of mr-hdh knockout strain by Southern blotting. Lane 1 and 2 represent M. ruber M7 and Δmr-hdh strain, respectively; Probe 3: Digoxin labeled mr-hdh gene; Probe 4: Digoxin labeled hyg gene. C: Identification of mr-hdh over-expression strain by Southern blotting. Lane1 and 2 represent M. ruber M7 and M7:: PtrpC-mr-hdh strain, respectively; Probe 5: Digoxin labeled mr-hdh gene; Probe 6: Digoxin labeled G418 gene.
图选项

从图 3可以看出，基因敲除子(图 3A、3B)中没有目的基因(mr-Bys和mr-hdh)条带，但存在抗性基因hyg条带，而过表达子(图 3C)中显示出目的基因(mr-hdh)，且存在抗性基因G418条带。这些结果表明，mr-Bys敲除子和mr-hdh敲除与过表达子构建成功。

2.3 菌落与显微形态观察

分析比较了出发菌株M7、M7:: PtrpC-mr-hdh、Δmr-hdh和Δmr-Bys在4种红曲菌常用培养基上[30]培养11 d后的菌落和显微形态(图 4)。

图 4 红曲菌M7、M7:: PtrpC-mr-hdh、Δmr-hdh和Δmr-Bys在不同培养基上的菌落与显微形态观察 Figure 4 Colonial and microscopic morphologies observation of Monascus ruber M7, M7:: PtrpC-mr-hdh, Δmr-hdh and Δmr-Bys on different media.
图选项

从图 4A可以看出，培养11 d后，M7的菌落与其基因敲除和过表达子的均有一定差别。在PDA培养基上，M7:: PtrpC-mr-hdh比M7长得更不规则一些，气生菌丝也多一些；在CYA培养基上，M7:: PtrpC-mr-hdh的白色气生菌丝比M7要多，菌落中心颜色更深；在G25N及MA培养基上，两者差别不大。Δmr-hdh与M7相比，在所有培养基上的菌落整体上偏小，在G25N培养基上尤其明显，说明其可能对高渗透压耐受性更差。Δmr-Bys与M7相比，在所用培养基上，菌落直径比M7的略小且颜色偏白，其气生菌丝比M7的偏多。

而从图 4B可以看出，在PDA和MA上所有菌株都可产生闭囊壳，闭囊壳从大到小依次排列为：M7:: PtrpC-mr-hdh、红曲菌M7、Δmr-Bys和Δmr-hdh，且M7在PDA和MA上的闭囊壳数量明显多于其他3株菌。在CYA以及G25N上4个菌株都能产生分生孢子，其中，Δmr-hdh产生的分生孢子数量最少。

2.4 丝衣霉酸分析

将红曲菌M7、M7:: PtrpC-mr-hdh、Δmr-hdh和Δmr-Bys的孢子液接种至米饭培养基中，28 ℃培养11 d后，以UPLC分析BA及中间体含量，结果如图 5所示。

图 5 M7、M7:: PtrpC-mr-hdh、Δmr-hdh和Δmr-Bys与红曲米的UPLC分析 Figure 5 UPLC analysis of Hongqu of M7, M7:: PtrpC-mr-hdh, Δmr-hdh and Δmr-Bys. A: 315 nm. B: 249 nm.
图选项

由图 5A可知，在315 nm下，除Δmr-Bys外，其他3株菌株的红曲米，在6.704 min处均观测到BA前体物C9-马来酸酐单体的色谱峰[26]；Δmr-hdh、红曲菌M7和M7:: PtrpC-mr-hdh的峰面积分别为269.54、445.82和560.89 AU/mg，表明敲除mr-hdh可抑制BA前体物的产生，而过表达该基因可促进BA前体物的产生。

由图 5B可知，除Δmr-Bys外，其他3株红曲菌的红曲米中，在13.167 min处均观测到BA色谱峰[21, 26]；Δmr-hdh、红曲菌M7和M7:: PtrpC-mr-hdh的BA峰面积分别为8 664.8、9 573.58和11 569.88 AU/mg，表明敲除mr-hdh可抑制BA产生，而过表达该基因可促进BA产生。以UPLC-MS/MS分析BA的质谱(mass spectrometry, MS) (图 6)与文献[26]报道一致。

图 6 丝衣霉酸的UPLC-MS/MS分析 Figure 6 UPLC-MS/MS detection of byssochlamic acid. A: Primary mass spectrometry. B: Secondary mass spectrometry.
图选项

2.5 红曲菌丝衣霉酸基因簇中相关基因转录水平的分析

采用RT-qPCR检测了红曲菌M7及其基因过表达与敲除子(M7:: PtrpC-mr-hdh、Δmr-hdh和Δmr-Bys)中BA基因簇内各基因的转录水平，以M7中BA相关基因的转录水平为1，以基因的相对表达量为纵坐标，分析了红曲菌M7及其基因敲除与过表达子中BA基因簇内相关基因在不同培养时间(3 d和7 d)的相对转录水平(图 7)。

图 7 丝衣霉酸基因簇内基因转录水平的检测 Figure 7 Detection of gene transcription levels in byssochlamic acid gene cluster. A: 3 d. B: 7 d.
图选项

由图 7可以看出，在Δmr-Bys中没有检测到mr-Bys的转录，Δmr-hdh中没有检测到mr-hdh的转录，这再次证明，相关基因敲除成功。对相同培养天数(3 d或7 d)的4种菌株，在M7:: PtrpC-mr-hdh的BA基因簇中，mr-hdh以及簇内绝大部分基因的转录水平都比M7的高，这既说明mr-hdh基因过表达成功。这与过表达mr-hdh可促进BA及其前体物的产生结果一致(图 5)。对于Δmr-Bys，培养至第3天时，除mr-md外，BA基因簇其他基因的转录水平都略高于M7的(图 7A)，但培养至第7天时，除mr-tf1外，其他基因的转录水平都低于M7，这与敲除mr-Bys后BA及其前体物消失的结果一致(图 5)。

这些分析结果表明，mr-Bys作为产生BA的核心(PKS)基因，对BA及其中间产物的产生起着决定性作用，而mr-hdh对BA及其中间产物的产生具有一定正调控作用。

3 讨论与结论

由图 2可知，在红色红曲菌M7等红曲菌的BA基因簇中均没有发现合成BA所必需的二聚化相关酮类固醇异构酶(KI)和磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)的类似基因[26]，但是M7却可产生BA (图 5和图 6)。为此，以来自纯黄丝衣霉BA基因簇中的KI (bfL6和bfL10)和PEBP (bfL5和bfL9)[26]为参考，对M7的全基因组进行了BLAST，并在其基因组中发现1个KI的同源基因A5602，2个PEBP的同源基因A5601和A5605 (表 3)。

表 3. 红色红曲菌M7基因组中与KI及PEBP同源的基因 Table 3. Genes homologous to KI and PEBP in the genome of Monascus ruber M7
Matching gene Homologous gene Query coverage
(%)		 Identity
(%)
A5601 bfL5 72.00 44.97
A5602 bfL6 74.00 52.49
A5605 bfL9 99.00 54.03
表选项

丝状真菌中特定SMs合成相关的基因存在于基因簇之外是比较常见的现象[37]。例如，在拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)和禾谷镰刀菌(F. graminearum)基因组中，参与合成单端孢菌素(trichothecene)的基因就存在于基因簇外[38-39]。因此，我们认为存在于红色红曲菌M7的BA基因簇之外的KI和PEBP同源基因(表 3)可能参与了BA合成。目前我们正通过基因敲除和过表达方法进一步验证它们的功能。

在本研究中，我们曾尝试过回补和表达红色红曲菌M7的BA基因簇中的PKS基因mr-Bys，但回补一直没有成功，而过表达似乎构建“成功”了(图 8A)。因为以probe 7探针(表 1)进行杂交，发现在红曲菌M7中无杂交带(泳道1)，而过表达子有一条杂交带(泳道2)；以probe 8探针(表 1)进行杂交，在红曲菌M7和过表达子中也均出现一条杂交带，过表达子的杂交带的分子量大小高于M7的，与预期相符合，且mr-Bys为单拷贝(图 8A)。但是，在“mr-Bys过表达子”的发酵产物中并没有检测到BA，且与M7相比较，“过表达子”中mr-Bys的转录水平在第5天以后不仅没有升高，反而降低了(图 8B)。进一步分析发现，可能是由于“过表达子”中的强启动子(PtrpC)的第350个碱基由C变成A所致(图 8C)。目前我们正更换强启动子基因，继续构建mr-Bys基因的过表达子，以提高BA的生产能力。

图 8 mr-Bys过表达菌株的验证及分析 Figure 8 Validation and analysis of mr-Bys over-expression strains. A: Identification of mr-Bys over-expression strain by Southern blotting. Lane1 and 2 represent M. ruber M7 and M7:: PtrpC-mr-Bys strain, respectively; Probe 7: Digoxin labeled G418 gene; Probe 8: Digoxin labeled mr-Bys gene; M: Marker. B: Transcriptional level analysis of mr-Bys in different days. C: Schematic diagram of promoter mutation sites.
图选项

本研究首次报道了红色红曲菌M7可产生BA，并发现了其基因簇，研究结果丰富了红曲菌次级代谢产物的种类，也为以红曲菌为菌种开发新产品奠定了基础。未来需进一步研究BA基因簇内其他基因，特别是存在于基因簇外的KI及PEBP同源基因(表 3)的功能。

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