重金属指密度大于4.5 g/cm³的金属，例如Cd、Ni、Cu、Zn等。重金属具有难以降解、易溶于水的特点，容易在环境中累积造成污染，已经造成了世界性的环境污染问题^[1-3]。重金属污染的不断加重使得重金属污染修复的研究愈加地受重视，目前对于重金属污染的修复，主要分为物理、化学、生物方法。其中传统的物理和化学方法可以有效的去除重金属污染，但有着容易造成二次污染、成本高等缺点^[4]。而微生物修复方法不仅可以高效地修复重金属污染，还有着成本低、对环境友好等特点^[5-6]，因此成为了如今研究重金属污染修复的热点^[7]。近几年有研究^[8-9]已经开始利用微生物修复土壤、水体等各种环境中的重金属污染，对微生物修复技术的研究具有重要意义。

多数研究^[10-11]选择从重金属污染严重的区域寻找能够去除重金属的微生物，例如金属矿区、污水处理厂等重金属污染严重的区域中常常存在着能够耐受重金属生长并具有去除重金属的潜力的微生物^[12-13]，但这些区域的重金属含量过于丰富，会影响其中微生物的组成，破坏微生物群落^[14-15]。而发达城市周边的红树林，如深圳福田红树林，有一定程度的、长期的重金属污染^[16-17]，在这样长时间、低剂量刺激的重金属污染环境中，微生物群落与网络之间长期相互作用，加强了环境中微生物对重金属的适应性^[18]，也许可以从中自然筛选出与重金属严重污染区域不同的、具有去除重金属潜力的微生物。本研究发现了一株通过重金属胁迫从红树林土壤中筛选出的放线菌新种Agromyces sp. CS16，其分离自长期受重金属污染的红树林土壤中，具有去除重金属的潜力。

微生物繁殖快、成本低，是修复重金属污染的理想材料，但在实际应用微生物处理水体时常面临一个问题，就是如何在去除完重金属离子后将微生物从环境中回收，现有的研究常采用固定化的方法解决。微生物的固定化不仅可以使微生物方便回收，其材料还对微生物菌体提供了保护和支持的功能^[19]。海藻酸钠(sodium alginate, SA)是一种天然的高分子化合物，具有良好亲水性、良好机械强度、接近水的密度、较长耐久等优点^[20]，是良好的微生物固定材料；聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)具有低成本、无毒性、微生物相性好等优点^[21]，两者与微生物结合形成凝胶小球是常见的包埋微生物的方法。

本研究测定了新种Agromyces sp. CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除能力，探究了不同重金属的初始浓度、不同接触时长对CS16去除重金属能力的影响，通过测定CS16对重金属富集部位占比探究了CS16的去除机理，通过全基因组分析从基因层面进一步探究其对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除机理，成功利用海藻酸钠和聚乙烯醇将CS16包埋，测定了包埋有CS16的凝胶小球去除重金属的能力。为微生物去除重金属的机制提供了理论支持，丰富了微生物的基因库，对应用微生物修复重金属污染的研究提供了理论支持。

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌株

Agromyces sp. CS16分离自深圳福田红树林表层土壤，由本实验室筛选并培养。Agromyces kandeliae Q22 (MCCC 1K03340)购自中国海洋微生物菌种保藏中心，由自然资源部第三方海洋研究所提供。

1.1.2 培养基

LB培养基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，5 g/L氯化钠，pH调至7.6±0.2，配制固体培养基需加入18 g/L琼脂粉。

1.2 抗重金属微生物的筛选

使用传统的稀释涂布平板法对抗重金属的微生物进行筛选。取1.0 g土样于9 mL无菌水中，28 ℃、200 r/min振荡30 min，作为土壤悬浊液。将土壤悬浊液梯度稀释得到稀释浓度为10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶的稀释液，分别取100 μL稀释液于含100 μg/mL Cu²⁺和含50 μg/mL Ni²⁺的固体LB平板中，加入小玻璃珠并摇晃平板，使稀释液均匀涂布在平板上。用平板划线法对平板上的单菌落进行分离。

1.3 Agromyces sp. CS16的鉴定

Agromyces sp. CS16分离自含50 μg/mL Ni²⁺的LB固体平板中，鉴定采用16S rRNA基因测序的方法。从平板刮取少量CS16菌体，用TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒提取DNA，用1.1×T3 Super Mix酶和通用引物27F (5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′)、1492R (5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′)进行PCR，将PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司进行DNA测序，将测序所得结果上传至NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站的数据库上进行基因序列的比对，获得相似种的相似性。根据CS16的16S rRNA序列，用MEGA-X构建CS16的进化树。

1.4 菌株重金属耐受性的测定

取2.5 mL培养基于6孔细胞培养板中，在含20、40、60、80、100 μg/mL Cd²⁺，100、200、300、400、500 μg/mL Ni²⁺，200、400、600、800、1 000 μg/mL Cu²⁺，200、400、600、800、1 000 μg/mL Zn²⁺的液体培养基中各接种125 μL CS16菌株(接种量5%)，放入酶标仪测定初始OD₆₀₀后用封口膜密封，放置于30 ℃摇床中100 r/min振荡培养，7 d后取出测定OD₆₀₀，对比培养前后OD₆₀₀变化判断CS16是否生长。

1.5 菌株去除重金属离子能力的测定 1.5.1 对不同初始浓度的重金属的去除

参考He等^[22]的方法，测定菌体对重金属的去除。将CS16菌液、Q22菌液按每管20 mL的量分装到50 mL离心管中，4 ℃、8 000 r/min离心3 min后，倒去上清液，再向离心管中加入25 mL高纯水，再次4 ℃、8 000 r/min离心3 min，倒去上清液，以洗去培养基。各取3管CS16菌体、Q22菌体，放入冻干机中冻干，24 h后称量其中菌体干重。用电动移液枪向其余离心管中分别加入25 mL的10、25、40、55、70 μg/mL Cd²⁺溶液，25、50、75、100、125 μg/mL Ni²⁺溶液，30、60、90、120、150 μg/mL Cu²⁺溶液，25、75、100、125 μg/mL Zn²⁺溶液，每个浓度各加3管，将离心管放入摇床中振荡培养2 h后，4 ℃、8 000 r/min离心3 min，取上清液10 mL，用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES)测定上清液中重金属的浓度，即为去除后剩余浓度。

1.5.2 不同接触时长下对重金属的去除

将CS16菌液按每管20 mL的量分装到50 mL离心管中，4 ℃、8 000 r/min离心3 min后，倒去上清液，再向离心管中加入25 mL高纯水，再次4 ℃、8 000 r/min离心3 min，倒去上清液，以洗去培养基。洗去培养基后取3管CS16菌体放入冻干机中冻干，24 h后称量其中菌体干重。用电动移液枪向其余离心管中分别加入40 μg/mL Cd²⁺溶液、125 μg/mL Ni²⁺溶液、150 μg/mL Cu²⁺溶液、75 μg/mL Zn²⁺溶液，将离心管放入摇床中分别振荡培养，分别在振荡15、30、60、120、240、360 min后取3管，4 ℃、8 000 r/min离心3 min，取上清液10 mL，用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES)测定上清液中重金属的浓度，即为去除后剩余浓度。

1.5.3 凝胶小球对重金属的去除

称取3 g湿重的凝胶小球到50 mL离心管中，用电动移液枪向离心管中加入30 μg/mL Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺溶液，每种金属分别加3管，将离心管放入摇床中振荡培养2 h后，4 ℃、8 000 r/min离心3 min，取上清液10 mL，用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES)测定上清液中重金属的浓度，即为去除后剩余浓度。

1.5.4 去除率和去除量的计算

去除率可以表示菌体去除了溶液中多少百分比的重金属，即溶液中重金属离子的去除率(公式1)；去除量(公式2)可以表示每g菌株去除了多少mg重金属。

公式(1)

公式(2)

1.5.5 数据的分析

采用IBM SPSS statistics 25软件进行统计分析。采用t-test分析数据差异显著性，“*”代表有统计学差异，P < 0.05；“**”代表有显著性差异，P < 0.01；“***”代表有极显性差异，P < 0.001。采用单因素方差分析推断不同接触时间对去除率和去除量的影响，其中接触时间为因素，共有15、30、60、120、240、360 min六个因素水平，P < 0.05代表不同因素水平之间有统计学差异。

1.6 重金属离子在菌体细胞不同部位占比的测定

参考李森等^[23]的方法，测定重金属在CS16上的富集占比。收集接触了重金属离子溶液2 h的CS16菌体，加入25 mL 0.1 mol/L的EDTA·2Na洗脱液，于摇床振荡洗脱30 min，离心取上清液，测定重金属浓度，即为细胞表面吸附重金属的量。倒去多余上清液，再向菌体中加入25 mL 0.1 mol/L的EDTA·2Na洗脱液，于细胞破碎仪中超声破壁8 min，然后于摇床振荡培养30 min，离心取上清液，测定重金属浓度，即为细胞内吸收重金属的量；倒去多余上清，向剩余的细胞残体加入4 mL王水，消解2 h后测定其重金属含量作为菌体对重金属离子的稳定结合量，每组设立3个重复。

1.7 全基因组分析

将Agromyces sp. CS16和Agromyces kandeliae Q22菌体送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因组测序。通过返还数据的注释，从基因组中挑选与Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺去除相关的基因并进行对比。

1.8 海藻酸钠-聚乙烯醇(SA-PVA)凝胶小球的制备

参考徐梦洁等^[24]的方法制备凝胶小球。将400 mL CS16菌液离心浓缩至30 mL，加到100 mL已灭菌的PVA-SA混合物(14%聚乙烯醇+1%海藻酸钠)中，混匀成SA-CS16混合液，与已灭菌的500 mL饱和硼酸和5% CaCl₂溶液同时接到自动滴定装置的两端，控制0.1 mL/min滴速，300 r/min转速，将SA-CS16混合液缓慢滴入饱和硼酸和5% CaCl₂溶液中，得到乳白色弹性的小球颗粒。

菌液浓缩后取5 mL菌液放入冻干机中冻干，24 h后称重，得菌体总干重。凝胶小球制备完成过后称重，得凝胶小球总湿重。通过菌体总干重和凝胶小球总湿重换算每g湿重的凝胶小球包含CS16菌体的重量。

2 结果与分析 2.1 Agromyces sp. CS16的形态和进化树

本研究对深圳福田红树林保护区潮滩处的表层土壤进行耐受重金属微生物的筛选，并从中分离出一株潜在的放线菌新种Agromyces sp. CS16，通过16S rRNA基因测序发现它与Agromyces binzhouensis相似度最高，为98.48%，将两者进一步进行比较发现两者的全基因组平均核苷酸相似度(average nucleotide identity, ANI)结果为89.84% (此值小于95%则界定为新种)，DNA-DNA杂交值为64.80% (此值小于70%则界定为新种)。观察CS16平板发现其单菌落特征表现为圆形、淡黄色、半透明、表面和边缘光滑(图 1A)，扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)观察发现CS16细胞呈长杆状，相互交联(图 1B)。根据16S rRNA基因序列构建进化树，结果如图 2所示，CS16与Agromyces kandeliae Q22在进化树上最为接近。

2.2 Agromyces sp. CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的耐受性

为了探究Agromyces sp. CS16在液体环境中能够耐受的Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺浓度范围，分别将CS16菌株接种在含Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的液体培养基中，并观察其生长状况。结果如表 1所示，培养1周后，含有20 μg/mL Cd²⁺、400 μg/mL Ni²⁺、1 000 μg/mL Cu²⁺、400 μg/mL Zn²⁺的培养基变浑浊，说明CS16能够在其中生长；而更高浓度的含Cd²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺培养基未变浑浊，说明CS16的生长受到了抑制。因此CS16在液体LB培养基中对Cd²⁺的耐受浓度在20–40 μg/mL之间，对Ni²⁺的耐受浓度在400–500 μg/mL之间，对Zn²⁺的耐受浓度在800–1 000 μg/mL之间，对Cu²⁺的耐受浓度 > 1 000 μg/mL。总体而言，Agromyces sp. CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺都有较高的耐受性。

2.3 Agromyces sp. CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除能力 2.3.1 不同初始浓度Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺对Agromyces sp. CS16去除能力的影响

为了探究不同初始浓度的Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺对Agromyces sp. CS16去除重金属离子能力的影响，分别测定了CS16在接触了不同浓度Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺溶液2 h后的去除率和去除量。图 3B、D、F、H分别显示了CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除率，发现CS16对低浓度Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除率分别可达到83.71%、80.96%、80.11%、88.91%，这意味着在低浓度的重金属溶液中，CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺都有着较高的去除能力。图 3A显示了CS16对Cd²⁺的去除量，发现CS16对Cd²⁺的去除量随Cd²⁺的初始浓度上升而下降，在Cd²⁺浓度为10 μg/mL时最高，为32.95 mg/g；当Cd²⁺的初始浓度达到70 μg/mL时，去除量下降到18.37 mg/g。对Cd²⁺去除量的下降可能是由于高浓度的Cd²⁺对CS16产生了毒害作用，使得CS16生物量下降，进而导致了去除量下降。图 3B–D分别显示了CS16对Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除量，发现CS16对Ni²⁺ (最高去除量为25.09 mg/g)、Cu²⁺ (最高去除量为30.69 mg/g)、Zn²⁺ (最高去除量为36.29 mg/g)的去除量随重金属浓度而先升高后略微浮动，可能是CS16随着溶液中重金属含量的增加而去除更多的重金属，而后达到一定浓度时，CS16对重金属的去除趋于饱和。

Agromyces kandeliae Q22分离自红树林土壤，是一株在进化上以及生存环境上均与CS16相近的菌株，Q22可以作为CS16的阳性对照，比较二者可以初步验证CS16是否具有较强的去除重金属能力，因此本研究将Q22与CS16同步培养进行实验。图 3显示，在大多数浓度条件下，CS16具有比Q22更高的去除量和去除率，可见在某些条件下，CS16能够去除比Q22更多的重金属离子。而在一些浓度下Q22与CS16的去除量无显著性差异，并且在Q22具有较大生物量时可以具有更高的去除率，说明Q22也具有相当可观的去除能力。图 3A显示，在10 μg/mLCd²⁺溶液中，CS16对Cd²⁺的去除量比Q22高了8.81 mg/g，是Q22去除量的1.36倍；图 3C显示，在30 μg/mL Cu溶液中，CS16对Cd²⁺的去除量比Q22高了8.36 mg/g，是Q22去除量的1.49倍。说明在低浓度时，CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除能力可能相对更高。

2.3.2 不同接触时长对Agromyces sp. CS16去除能力的影响

为了探究不同接触时长对Agromyces sp. CS16去除重金属离子能力的影响，分别测定了CS16在Cd²⁺ (40 μg/mL)、Ni²⁺ (125 μg/mL)、Cu²⁺ (150 μg/mL)、Zn²⁺ (75 μg/mL)溶液中振荡接触了不同时长后的去除率和去除量。结果如图 4所示，CS16对Cd²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除率和去除量未随接触时长的增加而上升，说明CS16对Cd²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除可能在15 min内就基本完成了，是一个较快的过程。而对于Ni²⁺，CS16的去除率和去除量随接触时间的增加而升高，说明CS16对Ni²⁺的去除是一个持续性的、较慢的过程。

2.4 Agromyces sp. CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除机制 2.4.1 重金属离子在菌体细胞不同部位的占比

为了探究CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除机理，分别试验了CS16在Cd²⁺ (40 μg/mL)、Ni²⁺ (50 μg/mL)、Cu²⁺ (50 μg/mL)、Zn²⁺ (25 μg/mL)溶液中接触了2 h后胞内吸收和胞外吸附的重金属离子的占比。结果如图 5所示，CS16对Cd²⁺ (胞外吸附占83.64%)、Ni²⁺ (胞外吸收占62.63%)、Cu²⁺ (胞外吸附占86.70%)、Zn²⁺ (胞外吸附占81.57%)的富集大部分为胞外吸附，少部分为胞内吸收，极少部分为稳定结合量，说明CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除主要是通过胞外吸附的机制进行的。图 5C显示，CS16对Ni²⁺的去除与其他3种金属离子略有不同，其胞内吸收占35.68%，而对Cd²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺三种离子的去除中胞内吸收分别仅占15.73%、12.88%、15.60%，说明胞内吸收机制可能在CS16去除溶液中Ni²⁺时占有重要作用。

2.4.2 Agromyces sp. CS16的重金属耐受相关基因

为了进一步探究CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除机理，对比CS16与Q22之间的差异，对CS16和Q22做了全基因组分析。结果表明Agromyces sp. CS16基因组全长34 561 bp，GC含量为71.43%，通过基因元件预测出总计3 744个基因，其中共有3 672个基因被成功注释。对CS16和Q22基因组中与Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺相关的重金属耐受基因进行筛选，结果如表 2所示，CS16全基因组中共有37个预测与Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺相关的重金属耐受基因，大多数基因的功能与重金属的转运相关。关于Cd²⁺，CS16有4个基因与Cd²⁺的耐受有关，包含CmtR、CzcD、FieF，其中CzcD预测为Cd²⁺和Zn²⁺的外排系统的组成部分，FieF预测为Fe²⁺的外排泵，二者都涉及Cd²⁺的转运^[25-26]，CmtR预测为转运的调节子，涉及Cd²⁺稳态的调节^[27]；Q22有6个基因与Cd²⁺的耐受有关，除未确认基因外基因的种类与CS16相同，也包含CmtR、CzcD、FieF。关于Ni²⁺，CS16有DdpF、DppB、DppC等9个基因与Ni²⁺的耐受有关，功能预测全部都涉及Ni²⁺的转运，DdpF、DppB、DppC等预测为ABC型寡肽、二肽、镍的转运系统的组成部分，MgtE预测为Mg、Co、Ni的转运蛋白；Q22有11个基因与Ni²⁺的耐受有关，功能预测全部涉及Ni²⁺的转运，与CS16相比缺少1个DdpF基因，但多出了OppB、OppD 2个基因。关于Cu²⁺，CS16有CopC、CopZ、CsoR等14个基因与Cu²⁺的耐受有关，CopC、CopZ预测为铜离子的抗性蛋白和分子伴侣，CsoR预测为铜感应转录阻遏物，可能在铜耐受起重要作用^[28-30]；Q22有12个基因预测与Cu²⁺的耐受有关，除未确认基因外基因种类与CS16相同，同样包含CopC、CopZ、CsoR等。关于Zn²⁺，CS16有FurA、MntB、YusV、ZupT等13个基因与Zn²⁺的耐受有关，FurA预测为转录调节因子，在锌耐受中起作用，MntB预测为锰转运的膜组成部分，YusV预测为铁载体转运系统的组成部分，ZupT预测为锌转运蛋白，三者功能都预测与锌的转运相关；Q22有13个基因预测与Zn²⁺的耐受有关，除未确认基因外基因种类与CS16相同。

2.5 海藻酸钠-聚乙烯醇包埋对重金属离子吸附的影响

本实验室通过调整SA浓度、PVA浓度、加菌量、硼酸浓度、CaCl₂浓度最终确定14% PVA、1%海藻酸钠、5%硼酸、5% CaCl₂、30 mL加菌量的配比能够成功制备出包埋有Agromyces sp. CS16的凝胶小球。为了验证包埋后对CS16去除能力是否会造成影响，对比了CS16包埋前后对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺ (浓度均为30 μg/mL)的去除率和去除量。结果如图 6所示，在去除Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺时，对比单纯的菌株CS16，经过SA-PVA包埋后的CS16的去除量分别提高了4.74、12.26、11.72 mg/g，说明SA-PVA包埋CS16不仅不会降低CS16对Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除能力，反而还能加强。而在去除Cd²⁺时，在包埋过后小球的去除量降低了6.03 mg/g，说明包埋可能影响到了菌株CS16对Cd²⁺的吸收。

3 讨论

近年来重金属污染越来越严重，人们对重金属污染修复的问题也越来越重视，微生物修复方法具有成本低、效率高、对环境友好的优势，成为了近几年研究修复重金属污染的热点。本研究从深圳福田红树林表层土壤筛选分离出了一株放线菌Agromyces sp. CS16，初步分析了CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的耐受能力，并测定了CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除能力。早前已经有许多报道介绍了放线菌对重金属离子的去除能力，Yous等^[31]利用Streptomyces rimosus去除溶液中的Cd²⁺和Ni²⁺，达到平衡时分别去除了22.8 mg/g Ni²⁺、9.86 mg/g Cd²⁺，与CS16比较，CS16对Ni²⁺的去除量提高了2.29 mg/g，对Cd²⁺的去除量提高了23.09 mg/g。Mattuschka等^[32]发现Streptomyces noursei在水中对铜的结合能力最强，最大吸附量为9 mg/g，相比CS16要低了21.69 mg/g。总而言之，CS16对于Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺有着相当强的耐受性和去除能力。CS16的全基因组分析发现其具有镉抗性基因CzcD，其编码的CzcD蛋白属于阳离子扩散促进子(cation diffusion facilitator, CDF)家族，在镉抗性中起重要作用^[25]，本研究也发现CS16能够耐受浓度高达20 μg/mL的Cd²⁺，并且在Cd²⁺浓度为10 μg/mL时，CS16可以去除其中83.71%的Cd²⁺ (图 3B)。其次，CS16具有同属于阳离子扩散促进子(CDF)家族的FieF基因编码蛋白^[33]，另外，CS16还具有一个属于一种Zn²⁺摄取系统ZupT基因编码蛋白，这个蛋白介导Zn²⁺的吸收^[34]，这些基因都与锌的转运和抗性有关，相应地也发现CS16能够耐受浓度高达400 μg/mL的Zn²⁺，并且在Zn²⁺浓度为25 μg/mL时，CS16对Zn²⁺的去除率可达到88.91% (图 3H)。然后，CS16具有Mg²⁺转运蛋白MgtE，有研究推测此基因与Ni的转运有关^[35]，而本研究也发现CS16能够耐受浓度高达400 μg/mL的Ni²⁺，并且在Ni²⁺浓度为25 μg/mL时，CS16对Ni²⁺的去除率可达到70.27% (图 3D)。同时，CS16还具有铜的抗性蛋白CopC、CopZ，这些抗性蛋白在铜抗性中起重要作用，使CS16能够耐受浓度超过1 000 μg/mL的Cu²⁺，并且在Cu²⁺浓度为30 μg/mL时，CS16可以去除其中83.71%的Cu²⁺ (图 3F)。对比已有的研究，CS16的去除能力并不是最高的，但其优势是对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺都有着较高的去除能力。但是，要将CS16应用于真实废水的处理，其在包含多种重金属环境下的耐受性以及富集能力仍有待研究。

微生物去除重金属的机制复杂，但主要还是分为两种机制。一种是胞外吸附机制，当微生物接触到重金属溶液时，细胞壁首先与重金属发生相互作用，细胞壁上具有羧基、羟基、氨基和磷酸基等官能团，这些官能团可以通过离子交换、氧化还原、络合等方式将重金属吸附在表面。许多微生物还会分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)，EPS通常由多糖、蛋白质组成，其中包含丰富的官能团，能够将重金属吸附在细胞外。例如，Bacillus subtilis和Pseudomonas putida表面EPS的存在被发现有利于Cd²⁺的吸附^[36]，Aspergillus fumigatus EPS上的羧基、酰胺基和羟基官能团可以与Cd²⁺进行离子交换，有利于对Cd²⁺的吸附^[37]。胞外吸附的过程往往耗时较短，与微生物和重金属的接触面积有关。另一种机制是胞内吸收，微生物通过细胞膜上的离子通道或转运蛋白将重金属吸收到细胞内，吸收到胞内的重金属通常被隔离储存在细胞器或细胞质中，以防止重金属的毒害作用。例如有的微生物会分泌植物螯合蛋白(phytochelatins, PCs)，结合重金属并将其区隔在液泡进行储存^[38]。有的微生物还会对部分重金属进行氧化还原，减少重金属的毒性，例如Euglena gracilis可以吸收Cr⁶⁺，并将较高毒性的Cr⁶⁺还原为较低毒性的Cr³⁺，提高了其积累Cr的能力^[39]。胞内吸收的过程受到离子转运的限制，通常耗时较长，是一个较缓慢的过程。本研究发现Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺主要被吸附在CS16的胞外(图 5)，并且CS16的去除在较短时间内就完成了(图 4)，说明CS16主要是用过胞外吸附的机制去除水体中的Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺。

Agromyces kandeliae Q22在进化上以及生存环境上均与CS16相近，通过测定不同浓度下CS16和Q22对重金属的去除能力，本研究发现Q22和CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺都具有相当可观的去除能力，这与全基因组的分析发现相对应，CS16和Q22都具有丰富的重金属耐受基因。大部分基因与重金属离子的外排有关，CzcD预测为钴、锌、镉转运系统的组成部分，通过外排Cd²⁺和Zn²⁺提供抗性^[25]，MgtE预测为镁、钴、镍转运体，可能通过转运调节胞内Ni²⁺稳态^[40]，还有不少未确认基因推测功能为编码介导铜输出P型ATP酶。这些基因大多编码阳离子扩散促进因子(CDF)和ABC转运体的组成成分，这些转运蛋白通过外排离子维持胞内的重金属稳态为菌株提供抗性，主要功能是提高了菌株对重金属的耐受性^[41-42]，使菌株在高中金属浓度环境下依然能进行去除重金属的活动。还有些基因功能预测与重金属的吸收有关，例如DdpF、DppB、DppC等，这些基因均是ABC型寡肽、二肽、镍的转运系统的组成部分，而本研究也发现CS16对的胞内吸收占比明显比其他3个金属要高(图 5)。在重金属的去除实验中，发现对比Q22，CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除能力要更高，但二者在重金属耐受基因的种类和数量上差别都不大，说明二者对重金属的去除机制之间的差别可能并不集中特异性的耐受基因上，而更多地集中在非特异性胞外组分上。Q22和CS16相似度很高，重金属耐受基因种类和数量也相近，Q22很可能机制上与CS16也相近，偏向于通过胞外吸附的机制去除水体的重金属，因此，要探明Q22与CS16对重金属去除能力之间的差异，可能还需要对其他非特异性组分作进一步研究。

Agromyces sp. CS16在水体中能够耐受高浓度Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺生长，并且拥有去除水体中重金属的能力，是用于处理水样中重金属污染的理想微生物材料。本研究探索条件后，成功利用SA-PVA将CS16包埋后制备出成型的凝胶小球，通过小球的重金属去除实验发现，包埋未降低CS16对Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的去除能力反而有所提高(图 6)。SA给CS16提供机械支撑和保护的同时，提高了CS16对重金属的去除能力。本研究成功探索出了用SA-PVA将CS16包埋成凝胶小球的配比，确认了包埋后的去除能力，是一次成功的包埋，为以后实际应用CS16处理重金属污染水体提供了理论基础。本研究在利用SA-PVA包埋CS16去除浓度30 μg/mL的Cd²⁺时，去除率对比CS16单纯菌体低了34.99%，虽然成功地将CS16固定了，但是影响到了其对Cd²⁺的去除，没能保持或者提高CS16对Cd²⁺的去除能力(图 6)。想要在固定CS16的同时还提高其对重金属的去除能力，仍需要进一步实验尝试其他的固定化的方法。例如制作固定化生物膜，MA等^[43]分别采用聚苯乙烯和海绵作固定化载体制作Scenedesmus obliquus FACHB-12生物膜，在去除3 μg/mL的Cd²⁺时，成功将对Cd²⁺去除率分别提高了58.58%、77.66% (对比FACHB-12悬浮菌体)，是一个可行的实验参考。

总之，本研究测定了一株新菌Agromyces sp. CS16对Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的耐受能力与去除能力，通过不同条件的实验进一步研究了CS16去除重金属的影响因素，通过胞内胞外实验和全基因组分析从细胞和基因层面分析了其去除机理，并通过SA-PVA包埋初步探究了CS16的实际应用。本研究丰富了放线菌基因库，为重金属耐受机制的研究和微生物修复水体重金属污染的研究提供了理论基础。

致谢

感谢深圳大学生命与海洋科学学院大型仪器设备公共服务平台的支持。感谢广东省深圳市福田红树林自然保护区和广东省深圳市福田红树林生态公园对采样的支持。