2023, Vol. 63
表1(Table 1)
凡纳滨对虾繁育系统菌群结构及优势菌遗传多样性分析
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220864
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 唐苗苗, 王印庚, 王春元, 张正, 廖梅杰, 李彬, 荣小军, 葛建龙, 于永翔. 2023
- TANG Miaomiao, WANG Yingeng, WANG Chunyuan, ZHANG Zheng, LIAO Meijie, LI Bin, RONG Xiaojun, GE Jianlong, YU Yongxiang.
- 凡纳滨对虾繁育系统菌群结构及优势菌遗传多样性分析
- Microbial community structure and genetic diversity of dominant bacteria in Litopenaeus vannamei breeding system
- 微生物学报, 63(8): 3068-3082
- Acta Microbiologica Sinica, 63(8): 3068-3082
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文章历史
- 收稿日期：2022-11-22
- 网络出版日期：2023-03-03
引用本文 |
唐苗苗, 王印庚, 王春元, 张正, 廖梅杰, 李彬, 荣小军, 葛建龙, 于永翔. 凡纳滨对虾繁育系统菌群结构及优势菌遗传多样性分析[J]. 微生物学报, 2023, 63(8): 3068-3082.
Tang Miaomiao, Wang Yingeng, Wang Chunyuan, Zhang Zheng, Liao Meijie, Li Bin, Rong Xiaojun, Ge Jianlong, Yu Yongxiang. Microbial community structure and genetic diversity of dominant bacteria in Litopenaeus vannamei breeding system[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2023, 63(8): 3068-3082.
凡纳滨对虾繁育系统菌群结构及优势菌遗传多样性分析
1. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306;
2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 山东 青岛 266071;
3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋渔业科学与食品产出过程功能实验室, 山东 青岛 266237
2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 山东 青岛 266071;
3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋渔业科学与食品产出过程功能实验室, 山东 青岛 266237
摘要：[目的] 探讨凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)工厂化繁育系统内发生细菌性玻化症(shrimp postlarva bacterial vitrified syndrome, BVS)时期可培养微生物的菌群特征以及优势病原菌的遗传多样性。[方法] 采用细菌体外培养方法结合基因测序技术对不同育苗阶段的亲虾、受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体、仔虾，及其育苗池水和饵料内可培养细菌菌群的组成与结构特征进行研究，并通过多位点序列分析(multilocus sequence analysis, MLSA)方法解析病原菌的遗传多样性。[结果] 系统内分离纯化的526株具有典型形态差异和群落优势的细菌分属于4门5纲16目24科38属113种。在纲水平上γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)丰度最高，共453株，占总分离株的86.1%；在属水平上弧菌属(Vibrio)丰度最高，共369株，占总分离株的70.2%；在种水平上，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为最优势种，共112株，占总分离株的21.3%，并且分布于整个繁育系统，在饵料中具有最高丰度。多元关联分析表明，随着对虾幼体的发育，饵料对幼体体内可培养细菌的菌群结构影响逐渐增加。对112株潜在溶藻弧菌的MLSA分析表明，其中100株菌株进一步确认为溶藻弧菌。进一步利用MLSA构建系统发育树分析其遗传多样性发现，100株溶藻弧菌分为9个簇，分离自同类样品的菌株广泛分布在不同的簇中。[结论] 在BVS发生时期，凡纳滨对虾工厂化繁育系统中具有丰富的可培养微生物种类。对虾幼体发育过程中，饵料对幼体体内可培养细菌的菌群结构具有重要影响。溶藻弧菌为凡纳滨对虾工厂化繁育系统中的优势弧菌，分布于整个繁育系统，且具有丰富的遗传多样性。本研究为解析对虾繁育系统可培养微生物演替规律提供了数据支撑，也为对虾苗期病原防控和健康养殖提供了科学依据。
关键词：凡纳滨对虾 工厂化繁育 细菌性玻化症(BVS) 菌群结构 多位点序列分析(MLSA) 溶藻弧菌
Microbial community structure and genetic diversity of dominant bacteria in Litopenaeus vannamei breeding system
1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, Shandong, China;
3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, Shandong, China
2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, Shandong, China;
3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, Shandong, China
Abstract: [Objective] To investigate the characteristics of culturable microorganisms and the genetic diversity of dominant pathogens during shrimp postlarva bacterial vitrified syndrome (BVS) of Litopenaeus vannamei in the factory breeding system. [Methods] The composition and structural characteristics of culturable bacterial communities in shrimp (parent shrimp, fertilized egg, nauplius, zoea, mysis, and postlarva), water, and bait samples at different breeding stages were studied by in vitro bacterial culture method combined with gene sequencing technology, and the genetic diversity of the pathogenic bacteria was studied by multilocus sequence analysis (MLSA). [Results] The 526 isolates with typical morphological differences and community dominance belonged to 113 species, 38 genera, 24 families, 16 orders, 5 classes, and 4 phyla. At the class level, Gammaproteobacteria had the highest abundance, with 453 isolates (86.1% of the total isolates). At the genus level, Vibrio had the highest abundance, with 369 isolates (70.2%). At the species level, V. alginolyticus was the most dominant species, with 112 isolates (21.3%). V. alginolyticus was distributed in the whole breeding system and had the highest abundance in the baits. The multiple correlation analysis showed that the influence of baits on the structure of culturable bacterial community increased gradually with the development of larvae. The MLSA confirmed 100 out of the 112 potential isolates as V. alginolyticus. MLSA was further employed to construct a phylogenetic tree for revealing the genetic diversity of the isolates. The 100 V. alginolyticus isolates were classified into 9 clusters, and the isolates from the same type of samples showed dispersed distribution in different clusters. [Conclusion] During the occurrence of BVS, abundant culturable microorganisms existed in the factory breeding system of L. vannamei. The baits exerted effect on the structure of culturable bacterial community in the larvae. V. alginolyticus was the dominant species of Vibrio in the factory breeding system of L. vannamei, with wide distribution and high genetic diversity in the breeding system. The results of this study provide data support for analyzing the succession rules of culturable microorganisms in shrimp breeding system and lays a foundation for pathogen prevention and control and healthy breeding of shrimp.
Keywords:
Litopenaeus vannamei factory breeding shrimp postlarva bacterial vitrified syndrome (BVS) microbial community structure multilocus sequence analysis (MLSA) Vibrio algolyticus
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国乃至全世界对虾养殖产量最高的种类[1]。据统计，2020年我国对虾总产量为215.3万t，其中186.3万t为凡纳滨对虾，占总对虾养殖产量的86.5%，同时凡纳滨对虾苗种产量高达1.56万亿尾，比2019年增加了3.61%[2]。健康优质苗种的持续供应是保障我国对虾养殖产业可持续发展的首要因素。但随着对虾大规模集约化繁育与养殖技术的不断发展，对虾苗种繁育过程中细菌病、病毒病、寄生虫病等病害问题也日趋严重[3-4]。对虾育苗过程中，育苗系统相对封闭，幼体密度高；同时由于饵料、残骸和排泄物积累，细菌大量滋生，极易造成育苗期幼体细菌性疾病暴发[5]。近年来，对虾育苗期间细菌性疾病频发，导致对虾苗种大量死亡，从而造成巨大的经济损失。例如，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、新喀里多尼亚弧菌(V. neocaledonicus)或副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)感染可导致虾苗细菌性玻化症(shrimp postlarva bacterial vitrified syndrome, BVS)，虾苗出现症状后24 h内便大部分死亡，该疾病在北部湾发生以后，在我国自南向北沿海呈现暴发性蔓延趋势，导致春季虾苗供应严重不足，使得我国沿海对虾养殖区遭受到严重的经济损失[6-7]。可见，对虾苗种细菌性疾病问题逐渐成为限制对虾苗种产业健康发展的重要因素。
微生物是水产养殖生态系统的重要组成部分，在物质循环、能量流动、水质控制和维持生态平衡中起着至关重要的作用[8-10]。在对虾养殖系统中，环境菌群的组成对对虾体内的微生物群落有很大影响[11]。而对虾和细菌共享同一水环境，对虾体内的细菌组成受到水中菌群的影响[12]。此外，以饵料为主的外源投入品可通过对虾摄食进而影响对虾体内的菌群组成，并且，过量或残余饵料的积累也会进一步影响水体菌群结构[13]。目前，关于对虾育苗系统菌群的研究主要集中在幼虾肠道[13]和水体菌群[14]，但对于整个育苗系统包括不同发育时期的虾苗、水体、饵料等可培养微生物菌群特征进行的研究报道很少。因此，全面了解对虾繁育系统中不同培育阶段和环境中可培养细菌的群落组成及优势菌株在不同样品中的遗传多样性，对于深入了解对虾苗种健康水平及潜在病原菌的防控具有重要意义。
本研究选择海南和广东省正值发生BVS的2家大型对虾苗种场为采样点，以凡纳滨对虾工厂化繁育系统中种虾培育、苗种繁育、养殖环境系统及外源投入品为调查对象，通过细菌体外培养并结合细菌鉴定与遗传关联分析等研究方法，对对虾繁育系统内可培养细菌菌群的组成与结构特征进行研究，比较分析不同繁育阶段虾苗体内菌群与环境菌群(饵料及繁育用水)的相关性，并解析了对虾繁育系统中溶藻弧菌的遗传多样性。相关研究结果为对虾育苗期疾病的防控和优质苗种培育提供了理论依据。
1 材料与方法 1.1 不同对虾苗种繁育阶段样品的采集和处理2021年4–6月，以海南和广东省正值发生BVS的2家大型对虾苗种场为采样点，以凡纳滨对虾工厂化繁育系统为研究对象，分别采集不同发育阶段的对虾、繁育用水和饵料共3种类别样品。其中对虾样品包括种虾(parent shrimp, PS)、受精卵(fertilized egg, FE)、无节幼体(nauplius, NP)、蚤状幼体(zoea, ZA)、糠虾幼体(mysis, MS)和仔虾(postlarvae, PL)；繁育用水样品包括种虾繁育用水(parent shrimp breeding water, PSW)、受精卵孵化水(fertilized egg incubation water, FEW)、无节幼体繁育用水(nauplius breeding water, NW)、蚤状幼体繁育用水(zoea breeding water, ZW)、糠虾幼体繁育用水(mysis breeding water, MW)和仔虾繁育用水(postlarvae breeding water, PLW)；饵料样品包括生物饵料[种虾饵料沙蚕(clam worm, CW)和冰冻鱿鱼(frozen squid, FS)、幼体饵料微藻(microalgae, MA)和卤虫(brine shrimp, BS)]和虾苗配合饲料[虾片(XP)]。
用灭菌筛绢网从种虾繁育池随机选取5尾种虾，从不同繁育阶段的孵化池和幼体繁育池随机采集一定量的受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体和仔虾，同步采集繁育系统内的繁育用水样品以及各阶段投喂的饵料样本，包括生物饵料(沙蚕、冰冻鱿鱼、微藻、卤虫)和虾苗配合饲料(虾片)。对虾和生物饵料样品用无菌1.5% NaCl溶液冲洗3–5次后，用无菌纱布吸干表面水分，低温带回基地实验室进行分析。无菌条件下对采集到的种虾样品进行解剖，取出肝胰腺和肠道并分别进行混合。
随机称取对虾(亲虾肠道和肝胰腺、受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体和仔虾)和饵料(沙蚕、冰冻鱿鱼、微藻、卤虫和虾片)样品各0.5 g，加入1 mL无菌1.5% NaCl溶液，在无菌条件下，研磨成匀浆原液，然后依次进行10倍梯度稀释，同步对繁育用水样品进行10倍梯度稀释。吸取每个样品稀释液各100 μL进行胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptic soy broth, TSB)和硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium, TCBS)琼脂平板涂布，每个样品设置3组平行试验，于28 ℃培养箱内培养。
1.2 菌株的分离纯化和鉴定将涂布后的TSB和TCBS平板置于28 ℃条件下培养24 h后，参照孙创等[15]的方法并进行改良后，进行菌株的分离纯化。具体操作如下，根据菌落形状、颜色、大小、透明度、边缘特征等，挑取不同类别的单菌落重新接种于TSB琼脂平板进行细菌纯化培养。将纯化3次的菌株用灭菌枪头刮取，与保种液(含有1.5% NaCl的20%甘油溶液)混合，反复吹打至均匀状态，用封口膜密封后，置于–80 ℃保藏。
挑取纯化培养的细菌单菌落重悬于100 µL无菌去离子水内并反复吹打均匀，99 ℃金属浴15 min后，置于4 ℃、12 000 r/min条件下离心5 min，吸取上清，使用分光光度计(NanoDrop 1000)测定上清中DNA浓度并用无菌去离子水将其调整至100 ng/μL，用作PCR模板DNA，并用通用引物27F/1492R[16]进行16S rRNA基因序列扩增。PCR反应体系(50 µL)为：2×Master Mix 25.0 µL，上下游引物各1.0 µL，模板DNA 1.0 µL，dd H2O 22.0 µL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环30次；72 ℃温育10 min，4 ℃保存。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后进行测序，并通过EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/)和NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对分析，最后对各样品中的菌株进行汇总及鉴定分类。
1.3 可培养微生物菌群特征分析依据细菌鉴定结果，分析对虾繁育体系中可培养细菌在纲(class)、属(genus)、种(species) 3个分类水平上的相对丰度，解析凡纳滨对虾工厂化繁育系统中可培养细菌的多样性特征；统计不同类别样品中分离菌株在纲、属和种水平上的相对丰度，分析不同类别样品中可培养微生物的群落组成及差异。所有统计工作、饼状图和柱状图均通过Excel完成，热图和Upset图通过omicshare云平台(https://www.omicshare.com/)中的相关工具完成。
1.4 不同繁育阶段虾体内菌群和环境菌群相关性分析通过主成分分析(principal component analysis, PCA)，研究不同繁育阶段对虾体内菌群与环境菌群各样本的相关性。通过不同繁育阶段虾体样品与环境样品之间的距离，比较分析不同时期对虾苗种培育系统中虾体与环境中可培养细菌的相关性。PCA分析通过omicshare云平台(https://www.omicshare.com/)内动态PCA工具完成。
1.5 优势弧菌MLSA鉴定和遗传相似性分析以在不同阶段的凡纳滨对虾繁育系统中广泛分布的优势菌—溶藻弧菌为研究对象，根据Rahman等[17]报道的弧菌鉴定技术，选取gyrB、pyrH、recA和atpA，并参考Sawabe等[18]的研究结果，选取topA和gapA，共计6个管家基因为目的基因，对不同来源的溶藻弧菌做进一步的多位点序列分析(multilocus sequence analysis, MLSA)鉴定，引物信息和扩增条件见表 1。选取V. alginolyticus ATCC 17749以及哈维氏簇群(Harveyi clade)中的V. azureus DSM23306、V. campbellii ATCC 25920、V. harveyi ATCC35084、V. jasicida JCM16453、V. mytili LMG19147、V. natriegens ATCC 14048、V. parahaemolyticus ATCC 17802、V. rotiferianus DSM 17186共9株标准菌株为参考菌株。通过MEGA 7.0内的clustal W进行基因序列对齐[19]，然后使用PhyloSuite[20]串联管家基因gyrB-pyrH-recA-atpA-gapA-topA。采用邻接(neighbor-joining, NJ)法[21]，以kimura 2-pammeter为核苷酸替代模型，bootstrap (1 000次重复)为检验方法[22]，构建系统发育树，并通过iTOL (https://itol.embl.de/)进行可视化处理[23]。
表 1. 引物信息
Table 1. Primer information of this study
| Primer | Sequence (5′→3′) | Amplicon length (bp) | Annealing temperature (℃) | Reference |
| 16S rRNA | F: GAGTTTGATCCTGGCTCAG | 1 500 | 55 | [16] |
| R: GGTTACCTTGTTACGACTT | ||||
| gyrB | F: GAAGGTGGTATTCAAGCGTT | 570 | 52 | [17] |
| R: CGGTCATGATGATGATGTTGT | ||||
| pyrH | F: CCCTAAACCAGCGTATCAACGTATTC | 501 | 59 | [17] |
| R: CGGATWGGCATTTTGTGGTCACGWGC | ||||
| recA | F: TGCGCTAGGTCAAATTGAAA | 462 | 55 | [17] |
| R: GTTTCWGGGTTACCRAACATYACACC | ||||
| atpA | F: CTDAATTCHACNGAAATYAGYG | 489 | 51 | [17] |
| R: TTACCARGWYTGGGTTGC | ||||
| topA | F: GAGATCATCGGTGGTGATG | 800 | 55 | [18] |
| R: GAAGGACGAATCGCTTCGTG | ||||
| gapA | F: AACTCACGGTCGTTTCAAC | 750 | 51 | [18] |
| R: CGTTGTCGTACCAAGATAC |
2 结果与分析 2.1 凡纳滨对虾繁育系统中可培养细菌的多样性分析
本研究共分离纯化可培养细菌526株，其中213株分离自对虾，167株分离自繁育用水，146株分离自生物饵料，虾苗配合饲料中未分离到任何细菌。经16S rRNA基因测序鉴定，分离的526株细菌分属于4门5纲16目24科38属113种。在纲水平上，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和放线菌纲(Actinobacteria)是丰度最高的3个纲，分别为453、56和11株，占总分离株的86.1%、10.6%和2.1% (图 1A)。在属水平上，隶属于γ-变形菌纲的弧菌属为主导优势属，共计369株，分属于34个种，占总分离菌株数量的70.2%；芽孢杆菌纲的芽孢杆菌属(Bacillus)为第二优势属，共计25株，分属于9个种，占总分离菌株的4.8%；γ-变形菌纲的交替单胞菌属(Alteromonas)为第三优势菌属，共计19株，分属于3个种，占总分离菌株的3.6% (图 1B)。种水平上，溶藻弧菌为最优势种，共计112株，占总分离菌株的21.3%；其次为哈维氏弧菌(V. harveyi)和巴西弧菌(V. brasiliensis)，分别占总分离菌株的9.3%和6.5% (图 1C)。
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| 图 1 凡纳滨对虾工厂化繁育系统可培养细菌群落组成 Figure 1 Culturable bacterial community composition of Litopenaeus vannamei breeding system. A: Class level. B: Genus level. C: Species level. |
2.2 不同类别样品中可培养微生物的群落组成
在对虾、繁育用水和生物饵料样品中，γ-变形菌纲和芽孢杆菌纲均是占主导优势的菌纲，相对丰度分别达到82.0%–92.0%和7.5%–16.2% (图 2A)，并且γ-变形菌纲和芽孢杆菌纲在各繁育系统均有分布。在属水平上，对虾、繁育用水和生物饵料样品各分离到18、17和24个属，其中弧菌属分布于整个繁育系统，在对虾体内具有最高相对丰度(78.4%)，在生物饵料中的相对丰度最低(64.4%) (图 2B)。第二优势属为芽孢杆菌属，在繁育用水中相对丰度最高(9.0%)。在种水平上，生物饵料样品包含最多数量的种(63)，其次为对虾(54)和繁育用水(53)，不同类别样品的优势种具有一定差异(图 2C)。对虾样品的优势种为哈维氏弧菌(19.2%)和溶藻弧菌(17.4%)，繁育用水为溶藻弧菌(19.8%)和巴西弧菌(9.6%)，生物饵料为溶藻弧菌(28.8%)和V. hyugaensis (4.1%)，其中溶藻弧菌分布于整个繁育系统，在生物饵料中具有最高相对丰度。
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| 图 2 不同类别样品可培养微生物多样性 Figure 2 Culturable microbial diversity of different types of samples. A: Bar diagram of class level community structure of culturable microbiota from different types of samples. B: Bar diagram of genus level community structure of culturable microorganisms of different types of samples. C: Heatmap diagram of species level community structure of culturable microorganisms of different types of samples (Top 17 species in relative abundance). |
2.3 不同繁育阶段对虾体内菌群与环境菌群相关性
在属水平上进行各样本相关性的PCA分析(图 3)。第1主成分(PC1)对样品差异的贡献值为62.6%，第2主成分(PC2)对样品差异的贡献值为20.1%。根据不同发育期各样本所处的位置可以看出，相比于PC1，PC2对亲虾、受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体和仔虾时期差异均具有较大贡献。根据相同时期幼体与繁育用水和饵料所处的位置可以看出，受精卵阶段和无节幼体时期，幼体与繁育用水菌群相距较远；随着幼体发育，幼体与繁育用水的距离变小，蚤状幼体后幼体与繁育用水菌群之间的距离无明显变化；蚤状幼体时期，幼体菌群与繁育用水菌群相距小于其与饵料(MA)菌群的距离，表明繁育用水对蚤状幼体菌群影响较大；随着幼体的发育，当发育到糠虾幼体时，幼体菌群与饵料(BS)菌群相距小于其与繁育用水菌群的距离，表明饵料对糠虾幼体菌群影响较大；当发育到仔虾时，幼体菌群与饵料(BS)菌群相距小于其与繁育用水菌群的距离，且幼体菌群与饵料距离变小，表明幼体菌群受饵料影响逐渐增加。
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| 图 3 不同繁育阶段对虾体内菌群与环境菌群差异的主成分分析 Figure 3 Principal component analysis of the microflora difference between the shrimp bodies and environment at different breeding stages. PS: Parent shrimp; FE: Fertilized egg; NP: Nauplius; ZA: Zoea; MS: Mysis; PL: Postlarvae; PSW: Parent shrimp breeding water; FEW: Fertilized egg incubation water; NW: Nauplius breeding water; ZW: Zoea breeding water; MW: Mysis breeding water; PLW: Postlarvae breeding water; CW: Clam worm; FS: Frozen squid; MA: Microalgae; BS: Brine shrimp. |
2.4 不同来源溶藻弧菌遗传多样性分析
为进一步研究对虾繁育过程中种虾培育、仔虾繁育、外源投入品和养殖环境中的微生物遗传多样性，以可培养微生物中检出率最高的溶藻弧菌为对象，对来源于不同样品中的溶藻弧菌遗传多样性进行比较分析。
经16S rRNA基因鉴定，弧菌属的369株菌株中，共获得112株潜在溶藻弧菌。基于gyrB-pyrH-recA-atpA-gapA-topA的MLSA系统发育分析表明，其中有100株与溶藻弧菌标准菌株ATCC 17749 (Val)聚为一支(图 4)。然后通过溶藻弧菌特异性引物gyrB[24]对这100株菌株进行PCR扩增，通过凝胶电泳进行检测均为阳性，进一步证明这100株菌为溶藻弧菌。其中29株来自对虾，32株来自繁育用水，39株来自生物饵料。
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图 4 基于gyrB-pyrH-recA-atpA-gapA-topA构建的112株潜在溶藻弧菌系统发育树 Figure 4 Phylogenetic tree of 112 potential Vibrio alginolyticus isolates based on gyrB-pyrH-recA-atpA-gapA-topA.    |
随后参考Kawaguchi等[25]和曾德乾[26]的方法，进一步对鉴定为溶藻弧菌的100株菌株，构建基于gyrB-pyrH-recA-atpA-gapA-topA的系统发育树，分析其遗传多样性。结果表明这100株溶藻弧菌菌株形成了9个不同的簇(a–i) (图 5)。簇a包含11株菌株，其中8株分离自对虾，1株分离自繁育用水，2株分离自生物饵料；簇b包含11株菌株，6株分离自对虾，4株分离自繁育用水，1株分离自生物饵料；簇c包含5株菌株，2株分离自对虾，3株分离自繁育用水；簇d仅包含1株菌株FEW1，分离自繁育用水；簇e包含19株菌株，4株分离自对虾，9株分离自繁育用水，6株分离自生物饵料；簇f包含5株菌株，3株分离自对虾，2株分离自繁育用水；簇g包含8株菌株，2株分离自对虾，4株分离自繁育用水，2株分离自生物饵料；簇h包含5株菌株，1株分离自对虾，2株分离自繁育用水，2株分离自生物饵料；簇i包含35株菌株，4株分离自对虾，6株分离自繁育用水，25株分离自生物饵料。
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图 5 基于gyrB-pyrH-recA-atpA-gapA-topA的100株溶藻弧菌系统发育树 Figure 5 Phylogenetic tree of 100 Vibrio alginolyticus isolates based on gyrB-pyrH-recA-atpA-gapA-topA.          |
就分离样品而言，分离自对虾的溶藻弧菌在簇a–c和簇e–i的8个簇中均有分布，主要分布在簇a和簇b中；分离自繁育用水的溶藻弧菌在簇a–i的9个簇中均有分布，主要分布在簇e和簇i中；分离自生物饵料的溶藻弧菌分布在簇a、簇b、簇e和簇g–i的6个簇中，主要分布在簇i中。可见，分离自不同类别样品的菌株可以聚为同一簇，分离自相同类别样品的菌株也可以分布在不同的簇中。进一步分析分离自相同时期幼体和繁育用水的溶藻弧菌在各簇中的分布发现，分离自受精卵的溶藻弧菌分布在簇a (FE2)、簇c (FE5)和簇i (FE1、FE4、FE6)中，而分离自受精卵孵化水的溶藻弧菌菌株FEW1独自形成簇d；分离自蚤状幼体的溶藻弧菌分布在簇a (ZA4)、簇b (ZA6、ZA8、ZA9)、簇c (ZA5)、簇f (ZA2、ZA10)、簇g (ZA3、ZA7)和簇h (ZA1)中，分离自蚤状幼体繁育用水的溶藻弧菌分布在簇b (ZW4)、簇c (ZW7)、簇e (ZW9)、簇f (ZW2)、簇g (ZW3、ZW5、ZW8)和簇h (ZW1、ZW6)中；分离自糠虾幼体的溶藻弧菌分布在簇a (MS1、MS5、MS7)、簇b (MS4)、簇e (MS2、MS3)和簇f (MS6)中，分离自糠虾幼体繁育用水的溶藻弧菌分布在簇b (MW1、MW5)和簇e (MW2、MW3、MW4)中；分离自仔虾的溶藻弧菌分布在簇a (PL6、PL7、PL8)、簇b (PL5)、簇e (PL1、PL3)和簇i (PL2)中，分离自仔虾繁育用水的溶藻弧菌分布在簇a (PLW1)、簇b (PLW4)、簇c (PLW13、PLW14)、簇e (PLW2、PLW8、PLW10、PLW11、PLW15)、簇f (PLW16)、簇g (PLW5)和簇i (PLW3、PLW6、PLW7、PLW9)中。可见，分离自同一发育时期幼体或繁育用水的溶藻弧菌菌株未聚类在同一簇中，分离自相同时期幼体和繁育用水的溶藻弧菌菌株也并未全都聚类在同一簇中。以上结果表明，来源不同的溶藻弧菌分离株可以具有相似的基因型，而来源相同的溶藻弧菌分离株的基因型也会存在差异。
3 讨论与结论对虾苗种培育的成败关乎对虾养殖产业发展的可持续性，健康稳定的繁育生态系统才可能保证苗种的健康。对虾生活在水体环境中，与水体中的微生物种群直接接触，且对虾摄入饵料中的细菌也会影响对虾肠道微生物菌群的结构特征[27]，同时，饵料投喂时要先接触水，残留的饵料也积累在水中影响水体菌群[13]。深入研究对虾繁育不同阶段的微生物组成及其遗传多样性，对于系统了解对虾繁育过程中菌群结构变化情况及其主要的外源干扰因子，建立对虾病原防控技术具有重要的指导意义。
本研究通过传统细菌学培养方法和基因测序技术研究了凡纳滨对虾工厂化繁育系统发生BVS时期可培养细菌的菌群特征。结果表明，凡纳滨对虾工厂化繁育系统内不同培育阶段样品内分离的526株菌株隶属于4门5纲16目24科38属113种，表明凡纳滨对虾工厂化繁育系统内微生物种类丰富。Zheng等[28]对不同健康状况和生长期的凡纳滨对虾幼体和水样中的可培养细菌研究发现，健康对虾幼体和水样的优势属分别为南海海杆菌属(Meridianimaribacter)和Nautella属。而本研究发现患BVS对虾繁育系统中的最优势属为弧菌属，芽孢杆菌属为第二优势属。此外，杨坤杰等[14]的研究发现，患病幼虾消化道中弧菌属的分类操作单元(operational taxonomic unit, OTU)平均丰度高于健康幼虾。因此，本研究中对虾繁育系统中弧菌属的大量存在可能是对BVS发生的响应。芽孢杆菌是水产养殖行业应用最广泛的益生菌之一，常常作为微生态制剂在水产养殖中用于促进生长、提高存活率、改善水质和提高免疫力等[29]。芽孢杆菌属具有较大优势的原因可能是在对虾繁育过程中大量使用了芽孢杆菌类微生态制剂。在种水平上，溶藻弧菌为最优势种，且分布于整个繁育系统，在生物饵料中具有最高相对丰度。王印庚等[6]的研究发现溶藻弧菌、新喀里多尼亚弧菌或副溶血弧菌是BVS的主要致病菌。此外，生物饵料中溶藻弧菌检出率最高，表明生物饵料可能是对虾繁育系统中溶藻弧菌的重要来源，对此需要作进一步研究进行证实。
本研究通过PCA分析不同繁育阶段对虾体内菌群与养殖系统中繁育用水和饵料菌群的相关性发现，在蚤状幼体前，随着幼体的发育幼体菌群与繁育用水的相关性变大。随着对虾的发育到蚤状幼体后体内菌群与饵料之间的相关性大于繁育用水，且随着幼体的发育，相关性变强。对虾无节幼体阶段之后，开始以生物饵料为食，这使得来自外部的细菌开始在宿主肠道中繁衍[30]，之后幼体体内细菌组成随着每个阶段所需的饮食变化而剧烈变化[31]。因此，在对虾幼体发育过程中，饵料会对幼体的菌群产生重要影响。在其他水生生物中也发现了相似的报道，史秀清等[32]对大菱鲆(Scophthalmus maximus)仔稚鱼发育期消化道的可培养细菌菌群进行研究发现，在大菱鲆整个育苗生产过程中，生物饵料中的细菌对仔稚鱼消化道中可培养菌群结构的形成产生的影响比水中的细菌相对较大。李靖等[33]对早期发育阶段刺参(Apostichopus japonicus)的研究结果表明，在海参幼体发育初期，其体内菌群与繁育用水的相关性较大，而随着幼体发育的进行，其体内菌群结构与饵料的相关性逐渐增加。但也有学者通过研究发现，养殖水体中菌群对水生动物消化道菌群具有显著影响。Tanasomwang等[34]研究牙鲆(Paralichthys olivaceus)仔稚鱼时发现，水中的菌群组成会明显影响仔稚鱼消化道的菌群组成。
利用管家基因进行MLSA鉴定的技术具有良好的分辨率、可积累性与重复性，已被越来越多地应用于弧菌属的系统进化与分类鉴定上[35]。本研究发现，溶藻弧菌是不同繁育阶段对虾繁育系统中均存在的优势弧菌种类。且现有报道也表明溶藻弧菌是BVS的重要致病源[6]。为进一步研究对虾繁育系统中溶藻弧菌的遗传多样性，本研究对112株潜在溶藻弧菌进一步进行了MLSA鉴定，共100株溶藻弧菌被进一步确认为溶藻弧菌。随后通过MLSA方法构建系统发育树，分析了其遗传多样性，结果显示100株溶藻弧菌分为9个簇，而且分离自同类样品的菌株广泛分布在不同的簇中，表明我国凡纳滨对虾工厂化繁育系统内溶藻弧菌具有丰富的遗传多样性。同样地，Warmer等[36]认为包括溶藻弧菌在内的多种弧菌具有很强的遗传多样性。此外，陈偿等[37]通过随机扩增DNA多态性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)技术对三亚、陵水等热带海区养殖场内溶藻弧菌的遗传多样性进行研究发现，我国热带海区养殖场内的溶藻弧菌具有非常高的遗传多样性，本研究结果与之一致。
综上所述，本研究对凡纳滨对虾工厂化繁育系统内发生细菌性玻化症(BVS)时期可培养微生物的菌群特征以及优势病原菌的遗传多样性进行分析，结果表明对虾繁育系统中具有丰富的可培养微生物种类。对虾幼体发育过程中，饵料对幼体体内可培养细菌的菌群结构具有重要影响。溶藻弧菌为对虾繁育系统中的优势弧菌，且具有丰富的遗传多样性。相关研究结果为对虾繁育系统中病原菌的控制和预防提供了数据支撑，为对虾疾病防控、健康养殖发展提供了理论依据。
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