微生物学报  2023, Vol. 63 Issue (8): 3173-3186   DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20220893.
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220893
中国科学院微生物研究所,中国微生物学会

文章信息

张蕾, 赵志鑫, 赵飞燕, 孙志宏. 2023
ZHANG Lei, ZHAO Zhixin, ZHAO Feiyan, SUN Zhihong.
不同地区人初乳中细菌多样性研究
Bacterial diversity in human colostrum samples from different regions
微生物学报, 63(8): 3173-3186
Acta Microbiologica Sinica, 63(8): 3173-3186

文章历史

收稿日期:2022-12-02
网络出版日期:2023-02-24
不同地区人初乳中细菌多样性研究
张蕾 , 赵志鑫 , 赵飞燕 , 孙志宏     
内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室 农业农村部奶制品加工重点实验室 内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室, 内蒙古 呼和浩特 010018
摘要:初乳中的微生物在婴儿生长发育过程中具有多种有益作用。[目的] 本研究分析了影响初乳微生物组成的多个因素,为后续探讨人初乳菌群的相关研究提供新思路。[方法] 通过PacBio SMRT测序技术对37份采集自湖北恩施地区人初乳样本中细菌16S rRNA基因序列进行测序,并结合公共数据库中已公布的来自内蒙古、海南、广西、河北、黑龙江和江苏等地区的62份人初乳中微生物组数据,探究不同地区人初乳中菌群组成与结构特点。[结果] 99份人初乳样本共注释到345个属,937个种,其中乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、Ralstonia insidiosa、溶血孪生球菌(Gemella haemolysans)等是人初乳中的优势菌种。基于jaccard距离的主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)显示,不同地区之间的人初乳菌群呈现显著分离趋势。同时比较影响初乳微生物组成因素的R2大小发现:地区 > 婴儿喂养方式 > 妊娠期健康状态 > 分娩方式 > 胎次。[结论] 本研究通过比较多个因素对人初乳中细菌菌群的影响,发现不同地区是影响人初乳微生物组成的主要因素。
关键词初乳    地区    16S rRNA基因    PacBio SMRT测序    细菌多样性    
Bacterial diversity in human colostrum samples from different regions
ZHANG Lei , ZHAO Zhixin , ZHAO Feiyan , SUN Zhihong     
Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Ministry of Education, Key Laboratory of Dairy Products Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Inner Mongolia Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia, China
Abstract: The microorganisms in colostrum have a variety of beneficial effects on the growth and development of infants. [Objective] We analyzed several factors affecting the flora composition of colostrum, aiming to provide a new idea for the follow-up study of human colostrum flora. [Methods] We used PacBio SMRT sequencing platform to complete the bacterial 16S rRNA gene sequencing of 37 colostrum samples collected from Enshi, Hubei Province. We then used the sequence data and the published data of 62 human colostrum samples from other regions in the public database to explore the composition and structure of bacterial flora in the human colostrum samples from different regions. [Results] There were 345 genera and 937 species in 99 colostrum samples. Lactococcus lactis, Ralstonia insidiosa, and Gemella haemolysans were the dominant species in human colostrum. The principal coordinate analysis (PCoA) based on jaccard distance showed a significant separation trend of flora in human colostrum samples between different regions. The R2 of the factors affecting the composition of colostrum flora followed the trend of region > infant feeding modes > maternal health during pregnancy > mode of delivery > parity. [Conclusion] Region was the main factor affecting the flora composition of human colostrum.
Keywords: colostrums    regions    16S rRNA gene    PacBio SMRT sequencing    bacterial diversity    

母乳是婴儿成长最自然、最安全和最完整的天然食物,并且母乳中的微生物还有助于孕妇抵抗妊娠期炎症等疾病[1]。母乳共分为3个阶段:初乳、过渡乳与成熟乳,母亲分娩后5 d内产下的母乳叫作初乳[2]。相比其他阶段的母乳,初乳中含有更加丰富的营养物质,较少的脂肪和乳糖有助于刚出生的婴儿进行消化吸收,大量的免疫球蛋白A (immunoglobulin A)可以降低炎症的发生率,是新生儿的第一剂“疫苗”[3-4]。此外,徐燕荣等[5]研究显示母亲初乳是刚出生的婴儿肠道内菌群的主要来源之一。

母乳中微生物受众多因素影响,例如母亲的分娩方式、对婴儿的喂养方式和母亲生活的地理位置等[6-7]。Kumar等[8]发现相较于顺产分娩的母亲,剖宫产分娩的母亲母乳中含有更高水平的变形菌门(Proteobacteria)。刘婉欣[9]通过研究发现,相较于单纯用母乳喂养婴儿与用母乳和奶粉交替喂养婴儿这两种喂养方式,单纯用奶粉喂养婴儿会促使母乳中有害菌增多。Wan等[2]收集了来自北京、杭州和兰州的117名产妇的母乳,发现来自不同地区的人母乳菌群结构有显著的分离趋势,且母乳中的葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和不动杆菌属(Acinetobacter)均存在显著差异。

基于上述,本实验利用PacBio SMRT测序技术解析了37份来自恩施地区的人初乳样本数据,并结合数据库中已公开的62份其他地区人初乳16S rRNA数据,比较不同地区人初乳中的微生物组成,同时讨论婴儿的喂养方式、母亲的分娩方式、母亲分娩前健康状态和胎次对人初乳菌群的影响程度,探究影响人类初乳菌群的主要因素,为日后对人初乳的研究提供重要依据。

1 材料与方法 1.1 材料和试剂 1.1.1 试验对象

本研究中的37份初乳样本均采自中国湖北省恩施市,具体志愿者信息见表 1。其中,母亲妊娠期的健康状态分为健康组和疾病组(健康组母亲妊娠期不患有任何疾病,疾病组母亲妊娠期患有高血压或子宫肌瘤);对婴儿的喂养方式分为单纯用母乳喂养(表中为母乳喂养)、单纯用奶粉喂养(表中为奶粉喂养)、母乳奶粉交替喂养(表中为混合喂养)。本研究人体样本的使用得到了内蒙古农业大学伦理委员会的批准,伦理审批号为:NO.KY (2020011),所有志愿者均同意参与本次试验,具体信息见表 1

表 1. 37名志愿者信息 Table 1. The information of 37 subjects
Sample No. Mode of delivery Infant feeding modes Parity Maternal health during pregnancy Nation
EF1 Cesarean section Mixed feeding First child Healthy Tujia nationality
EF2 Cesarean section Mixed feeding Second child Healthy Tujia nationality
EF6 Cesarean section Mixed feeding First child Healthy Tujia nationality
EF9 Natural childbirth Bottle feeding Second child Healthy Han nationality
EF10 Natural childbirth Bottle feeding First child Diseased Tujia nationality
EF11 Natural childbirth Bottle feeding Second child Diseased Han nationality
EF15 Natural childbirth Bottle feeding First child Diseased Han nationality
EF17 Natural childbirth Mixed feeding Second child Healthy Tujia nationality
EF19 Natural childbirth Bottle feeding First child Diseased Tujia nationality
REF4 Cesarean section Mixed feeding First child Diseased Han nationality
REF5 Natural childbirth Mixed feeding Second child Healthy Han nationality
REF13 Cesarean section Mixed feeding First child Healthy Tujia nationality
REF14 Natural childbirth Mixed feeding Second child Healthy Tujia nationality
EY1 Natural childbirth Mixed feeding First child Healthy Tujia nationality
EY2 Cesarean section Breast feeding Second child Healthy Han nationality
EY3 Cesarean section Breast feeding First child Diseased Tujia nationality
EY4 Natural childbirth Breast feeding Second child Healthy Han nationality
EY5 Natural childbirth Breast feeding Second child Healthy Han nationality
EY7 Natural childbirth Breast feeding First child Healthy Han nationality
EY10 Cesarean section Breast feeding First child Healthy Han nationality
EY11 Natural childbirth Breast feeding First child Healthy Han nationality
EY15 Cesarean section Breast feeding Second child Healthy Han nationality
EY16 Natural childbirth Breast feeding First child Healthy Han nationality
EY17 Cesarean section Mixed feeding First child Diseased Han nationality
EY18 Natural childbirth Breast feeding First child Healthy Han nationality
EY19 Natural childbirth Breast feeding Second child Healthy Han nationality
EY20 Cesarean section Breast feeding First child Healthy Han nationality
EY22 Natural childbirth Mixed feeding First child Healthy Han nationality
EY23 Natural childbirth Breast feeding Second child Healthy Han nationality
EY24 Cesarean section Mixed feeding Second child Healthy Han nationality
EY25 Natural childbirth Breast feeding First child Healthy Han nationality
EY27 Natural childbirth Mixed feeding First child Healthy Tujia nationality
EY28 Cesarean section Mixed feeding First child Healthy Han nationality
EY29 Cesarean section Mixed feeding Second child Diseased Tujia nationality
EY30 Cesarean section Breast feeding Second child Diseased Han nationality
EY31 Cesarean section Mixed feeding Second child Healthy Han nationality
EY40 Cesarean section Breast feeding Second child Healthy Tujia nationality

1.1.2 试剂

OMEGA EZNA®Soil微生物宏基因组DNA提取试剂盒,OMEGA公司;KAPA HiFi HotStart ReadyMIX PCR体系试剂,KAPA生物系统公司;5×Tris-硼酸电泳缓冲液(TBE,Tris碱54 g、Na2EDTA·2H2O 3.72 g、硼酸27.5 g,定容至1 L,pH 8.0),天津基准化学试剂公司;0.8%的琼脂糖胶(0.56 g琼脂糖溶于70 mL 0.5×TBE缓冲液),天津基准化学试剂公司;SMRT建库试剂盒(DNA Template Prep Kit 1.0),太平洋生物科学公司;PacBio SMRT测序试剂盒(DNA/Polymerase Bingding Kit P6 v2和DNA Sequencing Bundle 4.0),太平洋生物科学公司。

1.2 仪器和设备

PacBio RS Ⅱ三代测序仪,Pacific Bio-sciences公司;HA-300MII1高压蒸汽灭菌锅,HIRAYAMA公司;PCR仪,Bio-Rad公司;ND-1 000紫外分光光度计,NanoDrop公司;GDS-8 000凝胶成像仪,uvp公司;DYY-6D电泳仪,北京六一生物科技有限公司。

1.3 样品采集及保存

志愿者产妇戴好无菌手套,并用无菌生理盐水浸泡的纱布对产妇的乳头及乳晕进行擦拭消毒,手动采集初乳,为排除人乳腺管中细菌的干扰,舍弃初始的500 μL初乳,取10–15 mL至无酶无菌采样管中,即刻放入干冰盒中,后放入–80 ℃冰箱冷冻保存,样品置于干冰转运箱中运送至内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室进行DNA提取及测序。

1.3.1 母乳样品中细菌DNA提取

本实验取600 μL初乳样品,采用OMEGA EZNA®Soil试剂盒,依照说明书的提取步骤提取样品中细菌DNA之后,将提取的DNA选用0.8%琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检验DNA的完整度、纯度以及浓度,将符合后续试验要求的DNA置于–20 ℃冰箱备用。

1.3.2 母乳样品中细菌16S rRNA基因序列全长扩增,建库及测序

本实验将16S rRNA基因序列全长作为目的片段,用带有识别标签(barcode)的引物对每个样本进行PCR扩增,扩增引物为:27F (5′-AGAGT TTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-ACCT TGTTACGACTT-3′)。将得到的PCR产物继续用AMPure Beads纯化后得到更高质量的DNA片段,将符合条件的DNA进行建库,用PacBio RS Ⅱ测序仪将建好的文库进行测序。使用RS_ReadsOfinsert.1对原始序列进行质量控制,质控条件参照徐海燕等[10]的方法:(1) 同一片段循环测序次数≥5;(2) 预测精确度≥90%;(3) 过滤小于1 400 bp,大于1 800 bp的序列。

1.3.3 生物信息学分析

应用QIIME 2平台将FASTQ格式的数据进行质量控制,从经过DADA2质控后的得到的扩增子序列(amplic sequences variant, ASV)表中挑选出ASV代表序列,与Sliva参考数据库(Sliva 132)进行同源性比对,确定细菌的分类学地位并注释到种水平[11]。计算α多样性,包括超1指数(Chao1 index)、发现物种数(observed species index)、Shannon指数(Shannon index)和辛普森指数(Simpson index)。基于优势菌属、差异菌属、冗余分析(redundancy analysis, RDA)等相关性分析,比较不同地区人初乳中的菌群组成。利用置换多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA)比较不同因素对人初乳细菌多样性的影响程度。

为了比较不同地区人初乳菌群的差异,从MG-RAST下载本团队及其新疆石河子大学之前利用Illumina miseq和PacBio SMRT测序技术对内蒙古、海南、广西、河北、黑龙江和江苏地区的人初乳测序结果,下载序列分别为:14份内蒙古人初乳样本[12]、19份海南人初乳样本[13]、7份广西人初乳样本、7份河北人初乳样本、7份黑龙江人初乳样本、7份江苏人初乳样本[14] (MG-RAST:mgp79730;NCBI-PRJNA845888, SRR19548162-SRR19548258;MG-RAST:No. 4703559.3, 4703561.3, 4703619.3)。

1.3.4 数据处理

采用R软件(V3.3.2)、STAMP (2.1.3)、Adobe Illustrator对QIIME 2产生的结果进行绘制及其整理。

1.4 核酸序列登录号

本研究所有序列数据已提交NCBI数据库,序列号为NCBI-PRJNA906706。

2 结果与分析 2.1 初乳中微生物组成分析

基于Sliva参考数据库,将37份恩施地区人初乳样本数据结合数据库中下载的62份其他地区的人初乳序列进行注释,共鉴定出357个属。初乳中相对丰度大于1%的菌属分别是葡萄球菌属(21.53%)、链球菌属(19.96%)、不动杆菌属(10.87%)、假单胞菌属(Pseudomonas, 3.83%)、肠杆菌属(Enterobacter, 2.91%)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas, 2.48%)、芽孢杆菌属(Bacillus, 2.10%)、乳杆菌属(1.62%)、肠球菌属(Enterococcus, 1.38%)、角质杆菌属(Cutibacterium, 1.25%)、代尔夫特菌属(Delftia, 1.25%)、青枯菌属(Ralstonia, 1.19%)、克雷伯氏菌属(Klebsiella, 1.10%)。

种水平上,恩施、内蒙古、海南3个地区的70份人初乳样本中共注释出916个种,相对丰度大于1%的菌种分别是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, 6.13%)、Ralstonia insidiosa (5.78%)、溶血孪生球菌(Gemella haemolysans, 5.31%)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii, 4.98%)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis, 4.22%)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius, 3.53%)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, 3.10%)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, 2.38%)、琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii, 2.22%)、Thermus scotoductus (1.52%)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus, 1.36%)、Cupriavidus gilardii (1.03%)。进一步分析相同地区的人初乳样本后发现,在内蒙古地区14份人初乳样本中,相对丰度大于1%的菌种共有12个,其中琼氏不动杆菌平均相对含量高达9.10%、其次为唾液链球菌(8.92%)、溶血孪生球菌(6.21%)等;在恩施地区37份人初乳样本中,相对丰度大于1%的菌种共有16个,其中乳酸乳球菌平均相对含量高达11.11%,其次为德氏乳杆菌(8.78%)、溶血孪生球菌(4.81%)等;在海南地区19份人初乳样本中,相对丰度大于1%的菌种共有15个,其中Ralstonia insidiosa平均相对含量高达21.61%,其次为人葡萄球菌(9.00%)、表皮葡萄球菌(8.42%)等(图 1)。

图 1 不同地区人初乳中属、种水平菌落丰度图 Figure 1 Abundance map of human colostrum genus and species in different regions. ES: Enshi; GX: Guangxi; HN: Hainan; HB: Hebei; HLJ: Heilongjiang; JS: Jiangsu; NMG: Inner Mongolia. The following abbreviations have the same meaning as this note.

2.2 不同地区人初乳中的细菌多样性分析

α多样性是评估样本中菌群丰富度和多样性的重要指标。为了评估不同地区人初乳样本中微生物的多样性,本研究对99份人初乳样本的超1指数、发现物种数、香农指数和辛普森指数进行比较,结果如表 2所示,不同地区的人初乳样本的α多样性均存在显著差异(P < 0.05)。

表 2. 不同地区的人初乳样本α多样性指数 Table 2. Human colostrum samples from different regions alpha diversity index
Region Chao1 index Observed species index Shannon index Simpson index
ES 27 807.79±43 400.52a 3 066.78±1 888.21a 11.10±0.77a 1.00±0.002a
NMG 808 234.35±629 787.74b 5 025.64±1 744.40b 12.04±0.53b 1.00±0.001b
HN 60 700.19±31 174.95d 4 926.37±1 802.46b 10.39±1.05d 0.989±0.02d
GX 178 015.90±76 306.44c 13 648.57±4 007.55c 12.56±0.46c 1.00±0.002cd
HB 175 041.63±54 870.67c 14 295.57±2 722.49c 12.09±0.89c 0.99±0.01cd
JS 203 552.52±56 133.78c 14 791.86±3 362.79c 12.62±0.46c 1.00±0.001c
HLJ 170 784.33±21 490.49c 13 828.14±2 408.93c 12.28±0.24c 0.99±0.002cd
The difference is not significant if there are the same mark letters, and the difference is significant if there are different mark letters.

2.3 不同地区人初乳中菌群群落结构及其差异性分析

采用多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA)的方式评估地域对人初乳菌群结构的影响,基于jaccard距离的主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)显示,恩施、内蒙古与海南、江苏、广西、河北、黑龙江地区的人初乳菌群呈现显著分离趋势。通过不同地区人初乳菌群之间的差异,根据P值大小绘制箱型图,凡具有不同标记字母即为差异显著(P < 0.05),反之则为差异不显著。根据PC1维度将内蒙古、恩施、海南单独分成3组,黑龙江、河北、江苏分为1组。考虑到地理位置、饮食习惯等因素,将广西与海南并为一组(图 2)。基于以上,将7个地区分成4组,分别为:A组恩施,B组内蒙古,C组海南、广西,D组黑龙江、江苏、河北。基于不同分组对人初乳中差异菌属进行分析,结果发现,恩施相较于其他6个地区人初乳中甲基杆菌属(Methylobacterium-Methylorubrum)、阿菲波菌属(Afipia)、乳杆菌属、金色微菌属(Chryseomicrobium)、马赛菌属(Massilia)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属、微小杆菌属(Exiguobacterium)、红球菌属(Rhodococcus)显著增多;肠杆菌属、寡养单胞菌属、不动杆菌属、罗斯氏菌属(Rothia)显著减少(P < 0.001)。内蒙古与其他地区相比人初乳中阿菲波菌属、金色微菌属、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、鞘脂菌属(Sphingobium)、微杆菌属(Microbacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、痤疮丙酸杆菌属、甲基杆菌属、乳球菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属、寡养单胞菌属、罗斯氏菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属显著减少(P < 0.001)。海南、广西与其他地区相比人初乳中阿菲波菌属、肠杆菌属显著增多;乳杆菌属、金色微菌属、微小杆菌属、马赛菌属、红球菌属、甲基杆菌属、乳球菌属、假单胞菌属、链球菌属、鞘氨醇单胞菌属、肠球菌属显著减少(P < 0.001)。黑龙江、江苏、河北与其他地区相比,人初乳中罗斯氏菌属显著增多;微小杆菌属、马赛菌属、痤疮丙酸杆菌属、金色微菌属、乳杆菌属、微球菌属(Micrococcus)、乳球菌属、红球菌属、肠球菌属显著减少(P < 0.001) (图 3)。

图 2 基于非加权的jaccard距离的细菌主坐标分析图 Figure 2 Bacterial principal coordinates analysis based on unweighted jaccard distance. A: Principal coordinate analysis of bacteria in different regions based on unweighted jaccard distance. B: Analysis chart of bacteria principal coordinates in PC1 dimension in different regions. C: Analysis chart of bacteria principal coordinates in PC2 dimension in different regions. The difference is not significant if there are the same mark letters, and the difference is significant if there are different mark letters.

图 3 不同分组地区人初乳中的差异菌属 Figure 3 The different genus of human colostrum from different groups. A: Differential bacteria in human colostrum from Inner Mongolia and other regions. B: Differential bacteria in human colostrum from Hainan, Guangxi and other regions. C: Differential bacteria in human colostrum from Hebei, Jiangsu, Heilongjiang and other regions. D: Differential bacteria in human colostrum from Enshi and other regions.

2.4 不同地区与人初乳菌群的冗余分析

采用冗余分析(redundancy analysis, RDA)人初乳中细菌优势菌属和不同分组地区之间的相关性,2个排序轴共解释了99个人初乳样本中细菌群落组成的68.82%,其中第一排序轴解释了42.72%,第二排序轴解释了26.10%。RDA图结果显示与A组恩施、D组河北、江苏、黑龙江呈正相关的菌属如乳杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属等与B组内蒙古、C组海南、广西呈现负相关;与A组恩施、D组河北、江苏、黑龙江呈现负相关的菌属如链球菌属、葡萄球菌属、寡养单胞菌属等与B组内蒙古,C组海南、广西呈现正相关(图 4)。

图 4 初乳细菌优势菌属与不同分组地区之间的RDA分析 Figure 4 Redundancy analysis of dominant genus of colostrum bacteria and different grouping regions.

2.5 其他因素对人初乳菌群多样性的影响

基于上述结果,本实验进一步探究了婴儿的喂养方式、母亲分娩方式、母亲妊娠期健康状态、胎次对人初乳中微生物多样性的影响。本研究对37份恩施地区人初乳样本的超1指数、发现物种数、香农指数和辛普森指数进行比较,结果如表 3所示,只用奶粉喂养婴儿的超1指数相较于只用母乳喂养和混合喂养婴儿的超1指数显著性增大,混合喂养婴儿的香农指数相较于单纯用母乳喂养和单纯用奶粉喂养婴儿的香农指数显著性减小。除此之外,不同的分娩方式(表 4)、母亲分娩前的健康状态(表 5)和不同的胎次(表 6)均不会对人初乳中微生物多样性造成显著影响。

表 3. 喂养方式的α多样性指数 Table 3. Feeding mode alpha diversity index
Infant feeding modes Chao1 index Observed species index Shannon index Simpson index
Breast feeding 3 555.88±2 487.89a 3 555.88±2 487.89a 11.27±0.96a 1.00±0.000 8a
Bottle feeding 70 605.14±65 309.46b 3 060.60±1 084.34a 11.33±0.50a 1.00±0.000 4a
Mixed feeding 41 149.64±45 305.83a 2 636.67±1 264.88a 10.86±0.60b 1.00±0.003a
The difference is not significant if there are the same mark letters, and the difference is significant if there are different mark letters.

表 4. 分娩方式的α多样性指数 Table 4. Mode of delivery alpha diversity index
Mode of delivery Chao1 index Observed species index Shannon index Simpson index
Cesarean section 18 364.63±36 535.54a 2 658.00±1 720.79a 10.92±0.85a 1.00±0.003a
Natural childbirth 36 666.51±48 182.99a 3 460.95±2 004.61a 11.26±0.71a 1.00±0.002a
The difference is not significant if there are the same mark letters, and the difference is significant if there are different mark letters.

表 5. 妊娠期母亲健康状态的α多样性指数 Table 5. Maternal health during pregnancy alpha diversity index
Maternal health during pregnancy Chao1 index Observed species index Shannon index Simpson index
Diseased 23 652.65±35 233.56a 1 884.78±1 090.13a 10.49±0.52a 1.00±0.000 8a
Healthy 30 158.91±46 778.34a 3 510.52±1 952.82a 11.31±0.75a 1.00±0.002a
The difference is not significant if there are the same mark letters, and the difference is significant if there are different mark letters.

表 6. 胎次的α多样性指数 Table 6. Parity alpha diversity index
Parity Chao1 index Observed species index Shannon index Simpson index
First child 29 665.95±48 451.88a 3 175.00±2 141.24a 11.12±0.84a 1.00±0.000 9a
Second child 27 265.37±39 371.90a 3 024.82±1 653.93a 11.09±0.73a 1.00±0.003a
The difference is not significant if there are the same mark letters, and the difference is significant if there are different mark letters.

进一步采用置换多元方差分析其他因素对人初乳中微生物的影响程度。R2表示不同分组对样本差异的解释度,通过比较R2大小得出不同因素对人初乳中微生物菌群的影响程度,结果显示分娩母亲生活地区因素的R2最大,为0.17,对婴儿的喂养方式、母亲妊娠期健康状态、母亲的分娩方式、胎次因素的R2依次为:0.11、0.03、0.02、0.01,由R2可知不同因素对人初乳中微生物多样性的影响程度为: 地区 > 婴儿喂养方式 > 妊娠期健康状态 > 分娩方式 > 胎次。因此本研究得出结论,分娩母亲生活的地区不同是造成人初乳微生物多样性的主要因素(图 5)。

图 5 影响因素置换多元方差分析图 Figure 5 The permutational multivariate analysis of variance of influence factor.

3 讨论

初乳作为新生儿营养摄入的重要来源,被喻为“液态黄金”,对婴儿的健康及后续的成长至关重要[3]。由于Illumina MiSeq测序技术的读长较短,在一定程度上增加了测序的错误率,相反PacBio SMRT测序技术可以弥补这方面的缺陷,更好的在种水平上揭示人初乳中的菌群组成[15]。因此本研究基于PacBio SMRT测序技术揭示了恩施、内蒙古、海南3个地区人初乳中的优势菌种,通过与江苏、河北、黑龙江等地区人初乳样本进行对比后发现恩施、内蒙古、海南地区的人初乳菌群存在显著差异,并且这3个地区与广西、江苏、河北、黑龙江的人初乳菌群也存在显著差异,同时比较不同因素对人初乳菌群的影响程度,最终发现不同地区是造成人初乳中细菌多样性具有差异的主要原因。

研究表明葡萄球菌属、链球菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、乳杆菌属等是人初乳中的优势菌属;乳酸乳球菌、Ralstonia insidiosa、溶血孪生球菌等是恩施、内蒙古、海南人初乳中的优势菌种。Xi等[14]、Boix-Amorós等[16]在研究人初乳菌群时鉴定到的优势菌属与本研究结果一致。徐海燕等[10]通过研究内蒙古地区志愿者整个哺乳阶段母乳中的乳酸菌多样性后发现,德氏乳杆菌、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、表皮葡萄球菌、唾液链球菌、乳酸乳球菌是人母乳中的优势菌种,与本研究鉴定到的内蒙古地区人初乳中优势菌种几乎一致,两项研究中仅有植物乳植杆菌具有差异,猜测与研究人群哺乳阶段不同有关。

不同地区人初乳中的菌群组成显著不同,Boix-Amorós等[16]通过研究中国、芬兰、南非和西班牙人初乳菌群后得出与本实验相同的结论。Kumar等[8]也发现,西班牙妇女人乳中含有丰富的拟杆菌门(Bacteroides),中国妇女人乳中的放线菌门(Actinobacteria)较为丰富。同时,黄卫强[17]通过比较南方和北方地区人乳中差异菌属发现,南方地区人乳中葡萄球菌属、草螺菌属(Herbaspirillum)和棒状干菌属(Corynebacterium)的丰度大于北方地区,并且这种差异随着北移距离的增加而逐渐加大。南北方因环境、气候等外界条件导致饮食方面存在巨大差异,据研究显示,南北方每日谷物、瓜果、蔬菜、牛奶等摄入量显著不同[18],或许这是不同地区人乳菌群具有差异的原因。恩施地区海拔高,地处山区,并且含有大量的土家族人民,饮食偏好酸与辣[19]。除此之外,恩施被誉为“世界硒都”,土壤中硒含量高于全国平均水平,在此土壤下种植的农作物被称为富硒农产品,因此恩施人民饮食中硒含量普遍高于其他城市[20-22]。硒作为人初乳中的重要矿物质之一,长期饮食富硒食品可能会影响人初乳中菌群的定殖[23-24]。内蒙古地处高原,气候常年干冷,由于汉族与蒙古族的交融,生活在内蒙古的人民日常饮食以牛羊肉和奶食品为主[25]。宋玉玲[26]研究发现,肉类的过量摄入会加大蒙古族人民患乳腺癌的风险,国内外大量的研究也证实饮食会影响人乳菌群的组成[27],因此长期饮食具有蒙古族特色的食物可能是内蒙古人初乳菌群与其他地区人初乳菌群呈现显著分离趋势的主要原因。海南和广西均位于中国的最南端,居住着大量的黎族人民,气候常年炎热湿润,人初乳中含有大量的Thermus amyloliquefaciens等耐高温细菌[13, 28-29]。由于靠近热带,海南和广西水果种类丰富,人们经常将水果制作成爽口的饭菜,其中尤以芒果椰浆糯米饭著名,研究发现长期使用芒果椰浆糯米饭可以显著降低志愿者体内产甲烷的有害菌,提高嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)等有益菌[30],由于饮食会影响人乳菌群的组成,这可能是海南与广西人初乳菌群组成相似,与其他地区不同的原因。江苏、河北、黑龙江都处于中国内陆,城市偏向汉化,民族特色并不明显,也许这是3个地区与其他地区人初乳菌群呈现显著的分离趋势的缘故。同时,由于本研究中样本数量不一致,可能也会对不同地区人初乳菌群的分离趋势造成一定的影响。

为深究影响人初乳菌群的主要因素,本实验分别按照分娩母亲生活的不同地区、对婴儿的喂养方式、妊娠期母亲的健康状态、母亲的分娩方式、胎次等五大因素进行分组,比较人初乳中的细菌多样性指数,结果表明,除地区外,婴儿喂养方式也会影响人初乳菌群的多样性,这与Moossavi等[31]研究结果一致,他们发现相较于直接母乳喂养,间接母乳喂养(即婴儿不直接与母亲乳房接触)的母亲乳汁中的肠杆菌属和肠球菌属更为丰富。Kumar等[8]通过研究中国、芬兰、南非等地人乳菌群发现,母亲的分娩方式会影响母乳菌群的组成,Sakwinska等[32]却发现分娩方式并不会影响母乳菌群的组成,与本文研究结果一致,不同研究得出的结论差异可能与研究人群不同等有关,这还需要后续进一步深究。Wan等[2]发现妊娠期母亲健康状态等不会影响母乳菌群的组成,与本文研究结果相同。

4 结论

本研究利用PacBio SMRT测序技术,比较分析了分娩母亲生活的地区、婴儿喂养方式、母亲妊娠期健康状态、母亲的分娩方式和胎次等因素对人初乳中细菌菌群的影响,发现母亲生活的不同地区是影响人初乳微生物组成的主要因素,其中广西、河北、黑龙江、江苏地区母亲初乳样本主要以葡萄球菌属、链球菌属、不动杆菌属等菌属组成;恩施、内蒙古、海南地区母亲初乳样本主要以乳酸乳球菌、Ralstonia insidiosa、溶血孪生球菌等菌属组成。

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