2023, Vol. 63
表1(Table 1)
氧化葡萄糖酸杆菌中一种潜在的双组分系统蛋白的功能研究
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220894
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 刘思羽, 马昱澍, 魏东芝. 2023
- LIU Siyu, MA Yushu, WEI Dongzhi.
- 氧化葡萄糖酸杆菌中一种潜在的双组分系统蛋白的功能研究
- Function of a potential two-component system protein in Gluconobacter oxydans
- 微生物学报, 63(8): 3187-3202
- Acta Microbiologica Sinica, 63(8): 3187-3202
-
文章历史
- 收稿日期：2022-12-03
- 网络出版日期：2023-03-15
引用本文 |
刘思羽, 马昱澍, 魏东芝. 氧化葡萄糖酸杆菌中一种潜在的双组分系统蛋白的功能研究[J]. 微生物学报, 2023, 63(8): 3187-3202.
Liu Siyu, Ma Yushu, Wei Dongzhi. Function of a potential two-component system protein in Gluconobacter oxydans[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2023, 63(8): 3187-3202.
氧化葡萄糖酸杆菌中一种潜在的双组分系统蛋白的功能研究
华东理工大学 生物反应工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所, 上海 200237
摘要：氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)基因组编码的蛋白质中，有相当数量的传感器激酶和反应调控蛋白组成了细菌的多个双组分信号转导系统(two-component signal transduction systems, TCSs)，这些系统能够介导细菌对外界环境变化做出反应。但目前对G. oxydans中潜在的双组分系统成员蛋白质结构和功能缺少必要的研究。[目的] 研究菌株G. oxydans 621H中GOX0645基因序列所编码蛋白质的自磷酸化活性，探究其与细菌趋化性运动的关联，揭示其是否作为一种双组分系统成员蛋白在细胞内发挥作用。[方法] 以菌株G. oxydans 621H基因组中一段可能编码双组分系统蛋白质的基因GOX0645为基础，通过生物信息学分析其保守结构域；采用体外化学发光实验证明其编码蛋白的自磷酸化活性；利用基因定点突变筛选出与自磷酸化活性相关的氨基酸位点；通过差速离心法寻找双组分蛋白的亚细胞定位；最后运用体内双分子荧光互补和体外生物大分子相互作用实验印证其与下游鞭毛马达蛋白之间的相互作用。[结果] 生物信息学分析发现GOX0645编码蛋白同时具有组氨酸激酶和应答调节子保守结构域，该蛋白含有能够结合ATP并发生磷酸化反应的保守组氨酸和天冬氨酸位点，且蛋白自磷酸化活性可受cAMP浓度调节；该蛋白主要存在于G. oxydans细菌细胞质内，并与鞭毛马达蛋白具有中等强度相互作用力。[结论] 本研究发现了菌株G. oxydans 621H中一种可能参与细胞趋化性调控的TCS系统，为进一步研究G. oxydans中TCS系统的作用机制奠定了基础。
关键词：氧化葡萄糖酸杆菌 双组分信号转导系统 自磷酸化活性 蛋白质相互作用
Function of a potential two-component system protein in Gluconobacter oxydans
State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Lu Hua New World Institute of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
Abstract: The genome of Gluconobacter oxydans encodes a large number of sensor kinases and response regulators, potential members of two-component signal transduction systems (TCSs), by which bacteria recognize and respond to a variety of environmental stimuli. However, little is known about the structures and functions of these proteins in G. oxydans. [Objective] To study the autophosphorylation activity of a potential TCS protein encoded by GOX0645 in G. oxydans 621H, and to reveal the role of this protein in bacterial chemotaxis. [Methods] We performed sequence analysis on GOX0645 from G. oxydans 621H that might encode a TCS member, detected the autophosphorylation activity of the encoded protein by in vitro luminescent kinase assay, and then identified the amino acid residues critical to the autophosphorylation by site-directed mutagenesis. We employed differential centrifugation to study the subcellular localization of the protein, and BiFC assay and Octet® system to explore the interaction between the protein and a flagellar motor protein of G. oxydans. [Results] The protein encoded by GOX0645 contained the conserved domains of both histidine kinases and response regulators, with a conserved Asp and three His residues associated with autophosphorylation activity. Furthermore, the protein, as a hybrid protein, showed the activity of autophosphorylation which was affected by the concentration of cAMP molecule. The protein was localized in the cytoplasm and had a moderate affinity with the flagellar motor protein, which implied its regulatory role in bacterial chemotaxis. [Conclusion] This study analyzed a potential TCS that might be involved in the regulation of chemotaxis in G. oxydans 621H. This finding contributes to gaining insight into the molecular mechanism of two-component systems in G. oxydans.
Keywords:
Gluconobacter oxydans two-component signal transduction system autophosphorylation activity protein-protein interaction
为了适应外界环境的变化，生物体需要迅速感应并对环境信号做出应答。在大部分低等真核生物、原核生物和植物的生命活动中，组氨酸蛋白激酶系统，又称为双组分系统(two-component system, TCS)发挥着重要作用[1]。在已完成全基因组测序的1 087个细菌中，共含有63 259种编码双组分系统蛋白的基因[2]。这些双组分系统介导了细菌体内各类生理过程，如细菌趋化、渗透压调节、孢子形成、营养元素代谢和物质运输等[3]。在某些革兰氏阴性致病菌中，双组分蛋白除了参与细菌生存所必需的调控过程外，还与致病菌的毒力、生物膜和群体感应等致病过程相关[4-5]。
典型的双组分系统由组氨酸激酶(histidine kinase, HK)和应答调节蛋白(response regulator, RR)两部分组成，HK大部分为跨膜蛋白，而RR一般位于胞质内[6]。HK组氨酸残基和RR天冬氨酸残基的磷酸化和去磷酸化是整个信号转导过程的关键[7-8]。在外界环境信号的刺激下，HK的His位点发生自磷酸化，然后将其磷酸基团转移至配对RR的Asp位点上，引起蛋白构象发生变化。磷酸化RR的DNA结合能力显著提高，从而激活或抑制下游靶基因的转录[9]。作为双组分系统的终端，RR的磷酸化水平受到HK活性状态的严格控制，在细胞内维持着磷酸化和脱磷酸化2种状态的动态平衡[10]。
除了作为转录因子发挥作用的RR之外，信号结构域应答调节蛋白(signal domain response regulators, SD-RRs)通过结合其他蛋白，如鞭毛马达蛋白、组氨酸激酶或蛋白酶等将信号向下传递[11-12]。大肠杆菌(Escherichia coli) CheA-CheB/CheY双组分系统中的趋化蛋白CheY是第一个被鉴定的SD-RR，该双组分系统可以调控大肠杆菌的趋化性，其同源蛋白广泛分布于多种细菌中[13-15]。
氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)是醋酸杆菌科(Acetatebacter)中的一种专性好氧的革兰氏阴性菌，由于其不完全氧化糖和醇的能力而广泛应用于食品、饲料和制药等工业生产中[16]。通过分子生物学方法对工程菌株进行遗传标记和改良是研究和阐明其在生物催化中的作用，并进一步优化的重要手段[17]。但目前适用于氧化葡萄糖酸杆菌的分子生物学工具有限，其双组分系统方面的报道不足。
本研究从G. oxydans 621H菌株的基因组中得到了一段基因，编号GOX0645，序列分析推测其翻译产物可能是双组分系统中的组氨酸激酶应答调节子杂合蛋白(HK蛋白)。体外化学发光实验证明HK蛋白能够通过保守的组氨酸位点结合ATP发生磷酸化反应，该自磷酸化活性可受信号分子cAMP浓度的调节。此外本研究表明，HK蛋白主要存在于G. oxydans细菌细胞质内，并与鞭毛马达蛋白具有中等强度相互作用力，这为进一步研究G. oxydans中TCS系统的作用机制奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒本研究涉及的菌株和质粒见表 1。
表 1. 研究用菌株和质粒
Table 1. Strains and plasmids used in this study
| Strains and plasmids | Genotype and/or descriptiona | Source |
| Strains | ||
| G. oxydans 621H | Wild-type, Cefr | Kept by the laboratory |
| E. coli Trans5α | Host for cloning | TransGen Biotech |
| E. coli BL21(DE3) | Host for expression vector | TransGen Biotech |
| E. coli HB101/pRK2013 | Helper bacteria in triparental mating; Kanr | Kept by the laboratory |
| Plasmids | ||
| pET21a | Ampr | Kept by the laboratory |
| pET28a | Kanr | Kept by the laboratory |
| pET28a-hk | pET28a expressing HK; Kanr | Kept by the laboratory |
| pBBR1MCS-5 | Broad host range vector; Gmr | Kept by the laboratory |
| pET21a-mcherry | pET21a expressing mCherry fluorescent protein; Ampr | Kept by the laboratory |
| pET28a-c2530g_a2531c-hk | pET28a expressing HK-H844A; Kanr | This study |
| pET28a-c2887g_a2888c-hk | pET28a expressing HK-H963A; Kanr | This study |
| pET28a-c3142g_a3143c-hk | pET28a expressing HK-H1048A; Kanr | This study |
| pET28a-a3422c-hk | pET28a expressing HK-D1141A; Kanr | This study |
| pBBR1MCS5-hk-mcherry | pBBR1MCS5 expressing HK-mCherry; Gmr | This study |
| pET28a-mc-hk | pET28a expressing MC-HK; Kanr | This study |
| pET28a-hk-mc | pET28a expressing HK-MC; Kanr | This study |
| pET21a-mn-flim | pER21a expressing MN-FliM; Ampr | This study |
| pET21a-flim-mn | pET21a expressing FliM-MN; Ampr | This study |
| pET28a-flim | pET21a expressing FliM; Kanr | This study |
| Cef: Cefoxitin sodium; Kan: Kanamycin; Amp: Ampicillin; Gm: Gentamicin. | ||
1.2 主要试剂和仪器
Kinase-Glo化学发光试剂盒购于Progema公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真聚合酶购于TaKaRa公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购于Thermo Fisher公司；细菌质粒提取试剂盒购于Axygen公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；DNA片段纯化试剂盒和琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购于Omega公司；快速克隆试剂盒(ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit)购于Vazyme公司；Bradford蛋白含量检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所；各类抗生素和异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)诱导剂购于上海前尘生物科技有限公司。本研究中使用的头孢西丁钠、卡那霉素、氨苄青霉素和硫酸庆大霉素的终浓度分别为25、50、100、25 μg/mL。
IPTG诱导剂(mol/L)：IPTG 0.5；TBS缓冲液(mol/L)：Tris-base 0.02，调节pH值至7.4；咪唑溶液(mol/L)：Tris-base 0.02，NaCl 0.2，咪唑0.5，调节pH值至7.4；蛋白透析液(mol/L)：Tris-base 0.04，MgCl2 0.02，调节pH值至7.4，加入5%–10%甘油；洗涤缓冲液Ⅰ (mol/L)：Tris-base 0.02，EDTA·Na2 0.001，调节pH值至8.5，加入1% Triton X-100；洗涤缓冲液Ⅱ (mol/L)：Tris-base 0.02，EDTA·Na2 0.001，尿素2，调节pH值至8.5，加入1% Triton X-100；变性缓冲液(mol/L)：Tris-base 0.02，EDTA·Na2 0.01，尿素8，调节pH值至9.5；复性缓冲液Ⅰ (mol/L)：Tris-base 0.02，尿素6，调节pH值至9.5，加入20%甘油；复性缓冲液Ⅱ (mol/L)：Tris-base 0.02，尿素3，调节pH值至9.0，加入15%甘油；复性缓冲液Ⅲ (mol/L)：Tris-base 0.02，尿素1.5，调节pH值至8.5，加入10%甘油；复性缓冲液Ⅳ (mol/L)：Tris-base 0.02，尿素1，调节pH值至8.0，加入5%甘油；复性缓冲液Ⅴ (mol/L)：Tris-base 0.02，调节pH值至7.4；Octet缓冲液(mol/L)：Tris-base 0.04，MgCl2 0.02，BSA 0.1 g/100 mL，调节pH值至7.5，加入0.02% Tween-20；Octet ATP反应液(mol/L)：Tris-base 0.4，MgCl2 0.2，BSA 1 g/100 mL，ATP 0.002，调节pH值至7.5，加入0.02% Tween-20。
SpectraMax 190多功能酶标仪(Molecular Devices)、Nikon A1R激光共聚焦显微镜(Nikon)、OctetQke分子相互作用技术平台(ForteBio)、LYNX4000超速离心机(Thermo Fisher)、5804R低温离心机(Eppendorf)、TC-XP-D PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司)、NanoDrop 2000核酸定量仪(Thermo Fisher)、SPX-150B-Z生化培养箱(上海博讯实业有限公司)、DHG-9240A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、BS600电子天平(上海友声仪器有限公司)。
1.3 培养基和培养条件E. coli培养使用LB培养基，质粒扩增或普通传代培养条件为37 ℃、200 r/min摇床培养12 h；蛋白表达时应先37 ℃、220 r/min培养至OD600为1.0 (约12–16 h)，然后取1 mL菌液加入到200 mL新鲜LB培养基中，37 ℃、220 r/min培养至OD600为0.6 (约2 h)，再加入IPTG诱导剂至终浓度0.1 mmol/L，18 ℃、220 r/min继续培养20 h。
G. oxydans 621H使用山梨醇培养基进行培养，基因组扩增培养条件为30 ℃、220 r/min培养16–20 h；取1 mL菌液加入到50 mL新鲜山梨醇培养基中，30 ℃、220 r/min培养12 h，用于荧光蛋白检测。
山梨醇培养基(g/L)：酵母粉20，山梨糖醇80，KH2PO4 1，MgSO4 0.3，谷氨酰胺0.1，(固体培养基补加琼脂20)，121 ℃灭菌20 min后使用。
1.4 hk基因突变菌株的获取采用重叠延伸PCR (overlap extension PCR)法对hk基因进行改造，分别将第1 141位Asp氨基酸残基和保守HATPase结构域中963位、1 048位His氨基酸残基以及结构域N端紧邻的844位His位点突变为Ala残基，得到4种去磷酸化HK突变体。
重叠延伸PCR由3个PCR反应组成：以基础质粒pET28a-hk为模板，正向引物hk-F和突变引物H844/H964/H1048/D1141-Rm进行扩增，产物为包含突变位点的上游基因片段；同时也以基础质粒pET28a-hk为模板，反向引物hk-R和突变引物H844/H964/H1048/D1141-Fm进行扩增，产物为包含突变位点的下游基因片段；最终混合2种产物并以正反向引物F和R进行第3轮扩增，得到引入突变的目标片段。
实验中所用的上下游引物均通过软件Primer 5.0设计完成，定点突变引物由Agilent公司QuikChange Primer Design网站在线设计，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物汇总见表 2。
表 2. 重叠延伸PCR引物
Table 2. Primers used for overlap extension PCR
| Primers | Sequencesb (5′→3′) | Description |
| hk-F | ATAGGATCCATGTATCTTGTGGAGGGCACTGAAGAGG | Digested with BamH Ⅰ; forward primer to clone mutants of hk into pET-28a |
| hk-R | ATAGTCGACTCAGTCCCCTTTCAGCAGAACAGC | Digested with Sal Ⅰ; reverse primer to clone mutants of hk into pET-28a |
| H844-Fm | GTTGTTGAAATCAGCCGCCAGACCACCCG | To introduce HK-H844A mutant encoding gene |
| H844-Rm | CGGGTGGTCTGGCGGCTGATTTCAACAAC | Same as above |
| H963-Fm | ACGCCATGGCTGACCGCG | To introduce HK-H963A mutant encoding gene |
| H963-Rm | CGCGGTCAGCCATGGCGT | Same as above |
| H1048-Fm | GTGGAGATCGCCTCCACGCG | To introduce HK-H1048A mutant encoding gene |
| H1048-Rm | CGCGTGGAGGCGATCTCCAC | Same as above |
| D1141-Fm | CCGGCATCCCGATAGCACTAATAAGAACCGCAG | To introduce HK-D1141A mutant encoding gene |
| D1141-Rm | CTGCGGTTCTTATTAGTGCTATCGGGATGCCGG | Same as above |
| b: Restriction sites are in bold and mutant bases are underlined. | ||
使用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ分别对纯化后的PCR产物和pET28a空载质粒进行双酶切，T4 DNA连接酶连接后获得pET28a-c2530g_a2531c-hk、pET28a-c2887g_a2888c-hk、pET28a-c3142g_ a3143c-hk和pET28a-a3422c-hk 4种诱导性表达重组质粒。分别转化到E. coli Trans5α中扩增质粒，菌落PCR筛选阳性克隆子，测序进一步验证后提取质粒，转化到E. coli BL21(DE3)中进行蛋白表达。
1.5 蛋白表达和纯化将5种含有pET28a重组载体(pET28a-hk、pET28a-c2530g_a2531c-hk、pET28a-c2887g_a2888c-hk、pET28a-c3142g_a3143c-hk和pET28a-a3422c-hk)的E. coli BL21(DE3)接种到LB培养基中，并在低温条件下使用IPTG诱导表达HK蛋白及其突变体。
诱导结束后离心菌液(4 ℃, 8 000 r/min, 10 min)，使用TBS缓冲液清洗菌体沉淀后重悬，然后在冰水浴条件下进行超声破碎(工作参数：300 W, 5/5 s)，直至溶液清澈透明。超声后的溶液离心(4 ℃, 8 000 r/min, 30 min)取上清，0.45 μm滤器过滤后使上清液在低温条件下缓慢流过镍离子亲和树脂(Ni2+-NTA)纯化蛋白(流速2 mL/min)。用500 mmol/L咪唑洗脱目标蛋白后透析至咪唑浓度 < 0.01 mmol/L，得到纯化后的目标蛋白HK及其突变体HK-H844A、HK-H963A、HK-H1048A和HK-D1141A。置于–20 ℃冰箱中冻存1–2周或直接用于检测。
1.6 HK蛋白自磷酸化活性测定将HK蛋白及4种突变体与ATP孵育，然后使通过化学发光试剂盒法确定蛋白结合ATP发生自磷酸化反应的活性。
固定反应体系中ATP终浓度分别为0、2、4、6、8、10 μmol/L，恒温孵育(37 ℃, 30 min)后加入与反应体系等体积的Kinase-Glo化学发光试剂，继续孵育10 min后，用酶标仪检测化学发光信号，作ATP含量/化学发光值曲线，选择斜率最大即最灵敏点为最佳ATP浓度。
将纯化后的HK蛋白超滤浓缩至约5 mg/mL (4 ℃, 3 600 r/min)，分别按照0、1、2、3、4和5 μL梯度加至含有最佳ATP浓度的反应体系中，使用化学发光试剂盒在酶标仪下检测反应体系中剩余ATP的量，以确定蛋白自磷酸化活性；固定HK蛋白和ATP的浓度，将cAMP小分子以0、60、120、180、240、300、350、400 μmol/L浓度梯度加至反应体系中，测定剩余ATP的量，以确定cAMP小分子对HK蛋白自磷酸化活性的影响。
将HK蛋白的4种突变体HK-H844A、HK-H963A、HK-H1048A和HK-D1141A同样超滤浓缩至约5 mg/mL (4 ℃, 3 600 r/min)，并以浓度梯度加至含有最佳ATP浓度的反应体系中，使用化学发光试剂盒在酶标仪下检测反应体系中剩余ATP的量，以确定蛋白发生自磷酸化反应的氨基酸位点。
1.7 HK蛋白亚细胞定位以mCherry红色荧光蛋白作为标记以确定HK蛋白在G. oxydans 621H菌株中的定位。首先在G. oxydans 621H菌株中表达hk-mcherry重组基因，然后通过差速离心法分离细胞质和细胞膜组分，并在酶标仪下检测荧光值(激发光波长587 nm，发射光波长610 nm)，以确定HK蛋白的位置。
以pBBR1MCS-5广宿主质粒作为克隆载体，首先使用pET28a-hk模板和hk-F/R引物对将hk基因插入pBBR1MCS-5质粒中，然后以pET21a-mcherry为模板，通过mcherry-F/R引物对将荧光蛋白基因mcherry连接到hk基因3′端，构建出pBBR1MCS5-hk-mcherry重组质粒。考虑到pBBRMCS-5质粒连接外源基因的效率较低，选择快速克隆(ClonExpress)代替连接过程。使用的引物也相应需在5′端增加15–20个pBBR1MCS-5质粒插入位点的同源碱基。所用引物如表 3所示。
表 3. 快速克隆引物
Table 3. Primers collection for ClonExpress
| Primers | Sequencesc (5′→3′) | Description |
| hk-F | CAGAAAGATCTAGAACTAGTGGATCC ATGTATCTTGTGGAGGGCAC |
Digested with BamH Ⅰ; forward primer to clone hk into pBBR1MCS-5 |
| hk-R | AATTCCTGCAGCCCGGG GGATCCGTCCCCTTTCAGCAGAACA |
Digested with BamH Ⅰ; reverse primer to clone hk into pBBR1MCS-5 |
| mcherry-F | GGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTT GGAGGTGGCGGGAGTGGAGGTGGCGGGAGT ATGGTGAGCAAGGGC |
Digested with Hind Ⅲ; forward primer to clone mcherry into pBBR1MCS5-hk |
| mcherry-R | AGGTCGACGGTATCGATAAGCTT TCACTTGTACAGCTCGT |
Digested with Hind Ⅲ; reverse primer to clone mcherry into pBBR1MCS5-hk |
| c: Restriction sites are in bold and homologous sequences are underlined. | ||
PCR产物和质粒酶切后转入快速克隆体系，37 ℃反应30 min，转化到E. coli Trans5α中扩增质粒，筛选阳性克隆子并测序验证质粒序列正确，用于后续三亲本结合转化(triparental mating)。
取培养好的受体菌(G. oxydans 621H)、供体菌(E. coli/pBBR-hk-mcherry)和辅助菌(E. coli HB101/pRK2013)各1 mL，室温下分别离心(6 000 r/min, 1 min)后弃上清，使用无菌水洗涤2次菌体并加入1 mL无菌水重悬菌体，然后将3种菌液混合，室温下离心(6 000 r/min, 1 min)，留200 μL左右上清重悬菌体，涂布于无抗山梨醇固体平板上，30 ℃培养至平板表面长出一层均匀的菌膜(约8–10 h)。在超净工作台中使用1 mL无菌水冲洗平板，吸取50–200 μL洗液涂布在含Cef和Gm双抗性的山梨醇固体平板上，30 ℃培养22 h后筛选阳性克隆子，得到G. oxydans/pBBR-hk-mcherry重组菌株。
培养G. oxydans/pBBR-hk-mcherry重组菌株至OD600为0.6–1.0后离心菌液(4 ℃, 8 000 r/min, 10 min)，使用TBS缓冲液清洗菌体沉淀后重悬，然后在冰水浴条件下进行超声破碎(工作参数：300 W, 5/5 s)，直至溶液清澈透明。超声后的溶液离心(4 ℃, 12 000 r/min, 40 min)取上清，然后在超速离心机中离心(4 ℃, 40 000 r/min, 90 min)分离上清液和沉淀，其中上清液为细胞质溶液，沉淀为细胞膜及其结合蛋白。
使用与上清液等体积的TBS缓冲液重悬沉淀，将各个步骤所得溶液留样进行SDS-PAGE电泳分析，并用Bradford蛋白含量检测试剂盒测定浓度，最后酶标仪检测mCherry红色荧光蛋白(587/610 nm)的主要分布位置，从而确定HK蛋白的亚细胞定位。
1.8 蛋白相互作用体内检测采用基于MN159-MC160的mCherry双分子荧光互补系统确认HK蛋白和G. oxydans 621H中鞭毛马达上的FliM蛋白之间的相互作用：将mCherry蛋白分子从第159和160位氨基酸之间切开，命名为MN和MC片段，并分别通过柔性接头(linker)连接在FliM和HK单体的N端或C端，以pET21a和pET28a为表达载体，构建质粒如图 1所示，将质粒两两组合在E. coli中表达融合蛋白。通过酶标仪检测融合蛋白共表达产生的荧光，并使用激光共聚焦显微镜观察细胞的荧光水平，可以直观判断目标蛋白是否具有相互作用。
|
| 图 1 双分子荧光质粒图 Figure 1 Four plasmids created for BiFC assay. flim1: mn segment ligated on C-terminus of flim; flim2: mn segment ligated on N-terminus of flim; hk3: mc segment ligated on C-terminus of hk; hk4: mc segment ligated on N-terminus of hk. |
构建双分子质粒所需引物如表 4所示。使用mn1-F/R和mn2-F/R引物对在pET21a-mcherry模板上克隆出分别在N端和C端带有柔性蛋白linker序列的mn片段，连接至pET21a空载质粒，得到pET21a-linker-mn和pET21a-mn-linker重组质粒，分别转化到E. coli Trans5α中进行扩增，筛选阳性克隆子并测序验证质粒序列。
表 4. 双分子荧光引物汇总表
Table 4. Primers for BiFC assay
| Primers | Sequenced (5′→3′) | Description |
| mn1-F | CCCAAGCTTGGAGGTGGCGGGAGTGGAGGTGGCGG GAGTATGGTGAGCAAG GGCGAGG |
Digested with Hind Ⅲ; forward primer to construct pET21a-linker-mn |
| mn1-R | TATGCGGCCGCTCAGTCCTCGGGGTACATCCG | Digested with Not Ⅰ; reverse primer to construct pET21a-linker-mn |
| flim1-F | CGCGGATCCATGGCAGGGCTGGGCCAT | Digested with BamH Ⅰ; forward primer to construct pET21a-flim-mn |
| flim1-R | CGCGTCGACGCTATAGGATGTGGCACGATCCG | Digested with Sal Ⅰ; reverse primer to construct pET21a-flim-mn |
| mn2-F | ATAGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGG | Digested with Sal Ⅰ; forward primer to construct pET21a-mn-linker |
| mn2-R | ATAAAGCTTACTCCCGCCACCTCCACTCCCGCCAC CTCCGTCCTCGGGGTACATCCGCT |
Digested with Hind Ⅲ; reverse primer to construct pET21a-mn-linker |
| flim2-F | CCCAAGCTTATGGCAGGGCTGGGCCAT | Digested with Hind Ⅲ; forward primer to construct pET21a-mn-flim |
| flim2-R | TATGCGGCCGCTCAGCTATAGGATGTGGCACGATC | Digested with Not Ⅰ; reverse primer to construct pET21a-mn-flim |
| mc3-F | ATAAAGCTTGGAGGTGGCGGGAGTGGAGGTGGCG GGAGTGGCGCCCTGAAGGGCG |
Digested with Hind Ⅲ; forward primer to construct pET28a-linker-mc |
| mc3-R | ATACTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC | Digested with Xho Ⅰ; reverse primer to construct pET28a-linker-mc |
| hk3-F | ATAGGATCCATGTATCTTGTGGAGGGCA | Digested with BamH Ⅰ; forward primer to construct pET28a-hk-mc |
| hk3-R | ATAGTCGACGTCCCCTTTCAGCAGAAC | Digested with Sal Ⅰ; reverse primer to construct pET28a-hk-mc |
| mc4-F | ATAGGATCCATGGGCGCCCTGAAGGG | Digested with BamH Ⅰ; forward primer to construct pET28a-mc-linker |
| mc4-R | ATAGTCGACACTCCCGCCACCTCCACTCCCGCCAC CTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Digested with Sal Ⅰ; reverse primer to construct pET28a-mc-linker |
| hk4-F | ATAAAGCTTATGTATCTTGTGGAGGGCACTG | Digested with Hind Ⅲ; forward primer to construct pET28a-mc-hk |
| hk4-R | ATACTCGAGTCAGTCCCCTTTCAGCAG | Digested with Xho Ⅰ; reverse primer to construct pET28a-mc-hk |
| d: Restriction sites are in bold and linker sequences are underlined. | ||
以G. oxydans 621H基因组为模板，分别使用flim1-F/R和flim2-F/R引物对克隆flim基因片段，酶切连接在构建好的pET21a-linker-mn或pET21a-mn-linker质粒上，重新转化至E. coli Trans5α中得到flim1 (pET21a-flim-mn)和flim2 (pET21a-mn-flim)质粒。
同样地，使用mc1-F/R和mc2-F/R引物对克隆出2种带有柔性linker的mc片段，连接至pET28a空载质粒上，进而使用hk1-F/R和hk2-F/R引物对克隆hk基因，酶切、连接、转化后最终得到hk3 (pET28a-hk-mc)和hk4 (pET28a-mc-hk)质粒。
将flim1/2和hk3/4四种质粒两两组合，分别转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布在双抗平板上，挑取单菌落培养并进行菌落PCR验证，其中条带大小全部正确的菌落即为双质粒系统。
为了消除基底荧光对实验结果的影响，单独构建几组阴性对照组，包括flim1+mc (pET28a-mc质粒)、hk3+mn (pET21a-mn质粒)和mn+mc双质粒系统。
将4种双质粒系统(flim1+hk3、flim1+hk4、flim2+hk3和flim2+hk4)和阴性对照组分别在双抗培养基中培养并使用IPTG诱导2种融合蛋白共表达。
取1 mL诱导结束的菌液室温下离心(8 000 r/min, 2 min)后用TBS缓冲液洗涤菌体沉淀2次，然后加入250 μL TBS缓冲液重悬菌体，取200 μL至黑色96孔板中，使用酶标仪测定其荧光值(激发光波长587 nm，发射光波长610 nm)；另外取5 mL菌液，以新鲜LB液体培养基作为参比，测定其OD600值。
最后取培养结束的菌液10–30 μL滴在干净的载玻片上，盖好盖玻片后用吹风机小心吹干，通过激光共聚焦显微镜观察并记录细胞影像。
1.9 蛋白相互作用体外检测Octet生物分子相互作用仪用于快速精确检测蛋白浓度、小分子或配体筛选及亲和力检测等各个方面，本研究采用能够特异性识别并结合His标签的Anti-Penta-HIS探针，以His-FliM融合蛋白作为抗原，HK蛋白作为抗体，检测二者之间的相互作用。
以G. oxydans 621H基因组为模板，使用flim-F/R引物对(表 5)对flim基因进行扩增，然后酶切连接至pET28a质粒上并转入E. coli Trans BL21(DE3)感受态细胞中表达，由于FliM蛋白在大肠杆菌中无法正确折叠而是以包涵体的形式存在，因此采用包涵体变复性的方式对其进行纯化。
表 5. flim引物汇总表
Table 5. Primers for flim
| Primers | Sequencese (5′→3′) | Description |
| flim-F | CGCGGATCCATGGCAGGGCTGGGCCAT | Digested with BamH Ⅰ; forward primer to construct pET28a-flim |
| flim-R | CGCGTCGACTCAGCTATAGGATGTGGCACGATC | Digested with Sal Ⅰ; reverse primer to construct pET28a-flim |
| e: Restriction sites are in bold. | ||
将诱导培养的菌液经超声破碎后离心(4 ℃, 8 000 r/min, 30 min)收集沉淀，使用30 mL洗涤缓冲液I重悬并清洗沉淀，离心(4 ℃, 1 000 r/min, 15 min)后使用30 mL洗涤缓冲液Ⅲ重悬并清洗沉淀3次，再次离心(4 ℃, 1 000 r/min, 15 min)。加入25 mL变性缓冲液充分溶解包涵体，装入透析袋中，分别使用1 L复性缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ作为透析液进行透析，在4 ℃条件下每种溶液透析3 h，透析结束后将蛋白溶液取出，离心(4 ℃, 1 000 r/min, 15 min)取上清即为带His标签的FliM蛋白溶液。
分别检测发生自磷酸化之前和之后的HK与FliM蛋白的亲和力，以解析其磷酸化水平的变化对蛋白质相互作用所产生的影响。使用Octet Buffer将纯化好的2种蛋白重新透析一次，以防止蛋白缓冲液对实验结果的影响，透析结束后超滤至蛋白浓度约为0.1–0.5 mg/mL，然后按照检测仪说明书进行检测。
2 结果与分析 2.1 化学发光法测定HK蛋白及其突变体自磷酸化活性以ATP未降解组为对照，化学发光值随HK蛋白浓度变化趋势如图 2A所示。可以发现，随着体系中蛋白含量升高，化学发光值逐渐降低。该结果证实，随着HK蛋白含量的上升，ATP消耗量逐渐增加，剩余ATP减少，从而导致化学发光逐渐减弱，表明HK蛋白具有结合并消耗ATP的自磷酸化活性。
|
| 图 2 HK蛋白及其4种突变体磷酸化活性测定 Figure 2 Autophosphorylation activity of HK and four mutants. A: The phosphorylation reaction of HK kinase consumed ATP, resulting in decrease of luminescence. B: Autophosphorylation of HK mutants. HK-H963A, HK-H1048A and HK-D1141A lost the autophosphorylation activity, while the activity in HK-H844A remained unchanged. C: Influence of cAMP on HK autophosphorylation activity. cAMP improved HK autophosphorylation activity in a quantity-dependent manner. Error bars indicate SD (n=3). |
NCBI Blast在线分析结果显示，HK蛋白中存在多个保守结构域。蛋白C端第1 141位氨基酸Asp残基为一个保守的磷酸化位点，推测其用于磷酸基团传递；序列分析结果未显示能够被磷酸化的His位点，但Asp残基附近有保守的HATPase结构域(类似于其他组氨酸激酶中的CA结构域)，该结构域中共有2个His (963位和1 048位)，推测可能为能够被磷酸化的His残基；另外HATPase结构域的N端紧邻一个His位点(844位)，同样可能参与磷酸基团的接受和传递。根据上述分析结果，分别构建并表达突变体HK-D1141A、HK-H963A、HK-H1048A和HK-H844A，用于自磷酸化活性验证。
四种HK突变体自磷酸化活性检测结果如图 2B所示，HK-H844A蛋白曲线变化趋势与野生型相同，即844位His残基的突变并未影响到HK蛋白的活性；而HK-H963A、HK-H1048A和HK-D1141A自磷酸化实验结果显示，无论体系中蛋白浓度如何变化，化学发光值基本保持恒定，说明未发生ATP的消耗。这一结果显示，963位和1 048位His残基，以及1 141位Asp残基的突变都会使HK蛋白失去自磷酸化活性，因此这3个位点对于HK蛋白的信号传递过程起到了至关重要的作用。
由于HK蛋白N端含有多个传感器结构域，能够感应细胞内外多种小分子物质(如cAMP、cGMP等)，并对自身活性产生影响[18]。因此以HK蛋白为研究对象，验证cAMP对其自磷酸化活性的影响。图 2A中HK自磷酸化检测结果显示，当体系中蛋白浓度在0.05 g/L左右时斜率最大，即此时检测灵敏度最高，因此固定体系中HK浓度0.05 g/L，ATP浓度5 μmol/L，观察cAMP对HK蛋白自磷酸化活性的影响。以未加入cAMP组为对照，计算化学发光值的衰减，结果如图 2C所示。随着cAMP浓度的升高，HK蛋白明显提高了消耗ATP的能力，但当cAMP浓度达到240 μmol/L时，曲线趋于平缓，推测体系中ATP已基本耗尽。这一结果显示，cAMP对HK蛋白自磷酸化活性具有促进作用。
2.2 HK蛋白定位将mCherry红色荧光蛋白编码基因连接至hk基因并转入G. oxydans 621H中，通过检测分离后的细胞膜组分和细胞质组分中的红色荧光强度，对HK蛋白进行细胞内定位。
G. oxydans 621H原始菌株及G. oxydans/pBBR-hk-mcherry重组菌株各组分的SDS-PAGE结果显示，pBBR质粒的导入对G. oxydans细菌本身蛋白表达无明显影响。
分别对原始菌和重组菌的样品在587/610 nm参数下进行荧光值检测，结果如图 3所示。在全细胞样品、超声破碎后悬浊液中均有明显的红色荧光信号，而悬浊液离心后，红色荧光出现在上清液中，表明HK-mCherry蛋白在G. oxydans 621H中可溶性表达。对超速离心后分离的细胞质组分样品(5号样品)和细胞膜组分样品(6号样品)的检测显示，荧光信号主要来自于细胞质组分，即HK蛋白主要存在于G. oxydans 621H细菌的细胞质中，其定位与其他典型双组分系统的组氨酸激酶不同。
|
| 图 3 Gluconobacter oxydans 621H原始菌株及重组菌株不同样品中mCherry红色荧光蛋白信号检测 Figure 3 Fluorescence in various samples from Gluconobacter oxydans 621H and the recombinant strain with pBBR-hk-mcherryof samples. Sample 1: Cells before sonication; Sample 2: Cells after sonication; Sample 3: Supernatant after low-speed centrifugation; Sample 4: Pellet after low-speed centrifugation; Sample 5: Supernatant after ultracentrifugation; Sample 6: Pellet after ultracentrifugation. Error bars indicate SD (n=3). |
2.3 HK与FliM鞭毛马达蛋白相互作用
根据NCBI Blast结果，HK蛋白C端REC (signal receiver domain)中存在CheY结构域，且G. oxydans 621H基因组中存在鞭毛马达蛋白FliM的同源基因(S=120)。为分析HK蛋白与FliM蛋白之间是否存在相互作用的可能，分别采用基于mCherry的双分子荧光互补系统和Octet生物分子相互作用仪进行研究。
将图 1中的质粒两两组合转化至E. coli中表达融合蛋白，并使用酶标仪测得4种双质粒系统单位细胞荧光量如图 4A所示。与其他实验组和阴性对照组相比，flim2+hk3组和flim2+hk4组的荧光值较高，表明在FliM蛋白和HK蛋白的引导下，MN和MC片段相互结合并重新构成了具有活性的红色荧光蛋白，该结果显示HK和FliM两种蛋白之间确实存在相互作用；与之相比，flim1+hk3和flim1+hk4组荧光量几乎为零。在大肠杆菌中，FliM蛋白是通过其N端直接与CheY相互作用的[19]，因此将MN连接在FliM蛋白的C末端，可能使其与MC片段的距离较远，而无法完成红色荧光蛋白的功能重构。另外，MN片段与FliM蛋白C端的连接也可能会影响的空间结构，使其无法正常折叠，从而导致双质粒系统无荧光信号。
|
| 图 4 双分子荧光确认HK和FliM蛋白的相互作用 Figure 4 Interaction between HK and FliM analyzed by BiFC assay. A: Fluorescence in bacteria with different dual plasmid system. B: Cells images by LSCM. flim1: pET21a-flim-mn; flim2: pET21a-mn-flim; hk3: pET28a-hk-mc; hk4: pET28a-mc-hk; mn: pET21a-mn; mc: pET28a-mc. Error bars indicate SD (n=3). |
激光共聚焦显微镜进行直接观察的结果如图 4B所示，与酶标仪测量值相符，flim1+hk3和flim1+hk4组几乎观察不到荧光，而flim2+hk3组和flim2+hk4组的荧光量较强，进一步证实FliM与HK蛋白在E. coli中的相互作用。
为进一步确定2种蛋白之间的相互作用力，并分析HK蛋白磷酸化状态对这一相互作用力的影响，在E. coli中分别表达纯化了HK和FliM蛋白，并按照之前的实验条件将部分HK蛋白与ATP孵育，制备磷酸化HK蛋白，与未磷酸化的HK蛋白分别用于与FliM蛋白的Octet亲和力测定。根据结合解离曲线，可以分别计算出2种蛋白质之间的结合速率常数Kon和解离速率常数Koff，并根据蛋白分子量和浓度计算用于表征两者亲和力强弱的平衡解离常数KD (表 6)。其中，Kon和Koff误差值分别比其计算值小一个数量级，表明计算结果可靠。
表 6. HK与FliM蛋白结合亲和力
Table 6. Affinity between HK and FliM
| KD (mol/L) | Kon (L/(mol‧s)) | Kon error | Koff (s−1) | Koff error | |
| FliM+HK | 2.296×10–7 | 6 511 | 507.5 | 1.495×10–3 | 1.118×10–4 |
| FliM+(HK+ATP) | 2.196×10–7 | 4 487 | 330.4 | 9.835×10–4 | 8.664×10–5 |
数据分析结果表明，HK和FliM蛋白相互作用的平衡解离常数位于10–4 mol/L和10–8 mol/L区间内，两者的相互作用具有中等强度的亲和力，但HK的磷酸化状态对相互作用的影响较小。
3 讨论与结论双组分信号转导系统(two-component signal transduction system, TCS)在原核生物应对环境变化，感应O2分子、cAMP小分子，调节渗透压等生命活动中发挥着重要作用[20]。TCS系统信号传递从组氨酸激酶(HK)中的保守组氨酸(His)位点自磷酸化开始，HK蛋白的CA (催化与ATP结合)结构域高度保守，可以将ATP分子固定在ATP盖子结构(lid)和中心螺旋之间[21]，ATP分子γ位磷酸基团暴露在外，迅速被DHp (二聚体化及磷酸转移)结构域上的组氨酸位点捕捉[22]。因此CA催化域的空间位置总是靠近磷酸化的His位点。HK蛋白自磷酸化后，通过与应答调节子(RR)蛋白结合的方式传递磷酸基团。磷酸化的RR蛋白会发生构型改变，REC (信号响应)结构域β3-α3环、β4-α4环和部分α4螺旋结构均受其影响[23]。据此，胞外信号以磷酸基团的形式逐级传递，最终作用到相应位点[24]。
在E. coli BL21中表达来源于G. oxydans 621H菌株的组氨酸激酶应答调节子杂合蛋白HK，发现其具有蛋白激酶活性，能够自磷酸化。这与双组分信号转导系统蛋白质的组氨酸激酶活性特征相符[25]。而HK突变体的磷酸化结果表明，1 141位Asp位点是蛋白RR结构域中用于接收磷酸基团的保守位点；但发生自磷酸化的His位点依然不能确定，原因是963位和1 048位His残基位于HATPase结构域中，它们在自磷酸化反应中很可能起到催化而非接收磷酸基团的作用。此外，cAMP在一定浓度范围内促进HK蛋白自磷酸化活性的结果提示了传感器结构域的存在，也进一步提示了HK蛋白作为双组分信号转导系统的成员，可能具备感应外界刺激并调节自身活性的能力。
在细菌生长过程中，胞内cAMP合成受到培养基成分尤其是培养基中葡萄糖浓度的影响：葡萄糖浓度较高会导致胞内cAMP水平下降[26]；而当葡萄糖耗尽时胞内腺苷酸环化酶激活，cAMP浓度上升。由此推测，G. oxydans 621H中HK蛋白可能通过cAMP感知外界环境中葡萄糖浓度变化。
HK蛋白定位结果显示，红色荧光主要分布在621H菌株的细胞质中，证明HK蛋白的亚细胞定位是细胞质结构。目前文献报道的大部分双组分系统的组氨酸激酶与细胞膜结合[27]，只有小部分定位于细胞质中，用于自身生命活动的调节[28]。结合HK蛋白能够感应细胞内cAMP浓度的变化结果，可以推断HK蛋白不同于大部分双组分系统的组氨酸激酶，它主要存在于细胞质中，用于感应胞内信号。
与大肠杆菌CheA-CheB/CheY双组分系统相同，HK蛋白具有CheY保守结构域，提示其可能与鞭毛马达蛋白FliM蛋白相互作用，从而对细菌的运动状态和趋化性产生影响。双分子荧光实验及Octet分子相互作用实验均证实了这一猜想。
本研究涉及了G. oxydans 621H菌株中一个双组分信号转导系统的信号输入、HK自磷酸化、磷酸基团传递和信号输出整个信号转导途径，研究结果提示了G. oxydans趋化性运动的一种可能调节方式，有助于更加深入了解细菌的双组分系统和G. oxydans中信号传递的分子机理。
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