洋葱伯克霍尔德氏菌复合群(Burkholderia cepacia complex, Bcc)由至少22个基因不同但表型相似的革兰氏阴性物种组成^[1-3]。洋葱伯克霍尔德氏菌复合群的分类是复杂的和不断更新的，研究者们采用各种各样的分子分型方法对其进行分类，包括16S RNA基因、recA以及多位点分型(multilocus sequence typing, MLST)。MLST是全球公认的方法，在物种水平上比其他方法有更高的分辨率。Bcc的MLST方案于2005年开发，并于2009年得到改进，在全球用于Bcc的分型和评估种群结构。多位点序列分析(multilocus sequence analysis, MLSA)利用MLST中等位基因位点的核苷酸序列进行系统发育分析，被广泛应用于分离株间的鉴定和系统发育分析^[4]。

Bcc在自然环境中无处不在，个人洗护用品的Bcc污染常常与多个相关的机会性感染实例有关^[5-6]。为了保证日化产品质量和消费者安全，厂家使用消毒剂和防腐剂来抑制微生物生长，以期将微生物负荷降低到可接受的水平。防腐剂通过作用于微生物的细胞膜、细胞壁及酶等多个靶点，破坏细胞的分裂，抑制细菌生长和繁殖，达到防腐的目的^[7]。菌种在抗菌剂作用下也发生耐药性的改变，细菌对杀菌剂的暴露可以选择对杀菌剂敏感性降低的突变体，而这些突变体往往表现出对各种抗生素的敏感性降低，表明杀菌剂可以在实验室条件下作为抗生素耐药性的驱动因子^[8]。Bcc常常在日化产品的污染菌株中出现，并占据一定的比例，即使在有防腐剂或者低营养条件下仍能存活数月，且对于防腐剂消毒剂有较强的耐药性^[9]。环境或工业污染中分离的Bcc菌株具有的耐药性基因可作为致病性Bcc菌株的重要耐药基因库来源，因此研究工业污染物中分离的菌株耐药性和耐防腐剂性能对预防大面积疾病感染有重要作用。

神秘伯克霍尔德氏菌(Burkholderia aenigmatica)为2020年重新分类的种^[2]，作为日化产品污染菌株的研究较少，本文以来自于日化产品的B. aenigmatica作为研究对象，对其进行详细的分类分型，并探究B. aenigmatica对部分抗生素和常见防腐剂的耐药性。

1 材料与方法 1.1 实验材料

MH肉汤培养基(Mueller-Hinton broth, MHB)、大豆酪蛋白琼脂培养基(soy casein agar, TSA)、非苛养非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒(API，梅里埃生物)、AmPure Microbial DNA Kit (广州美基生物科技有限公司)。

实验用抗生素包括头孢他啶(β-内酰胺酶类)、硫酸卡那霉素(氨基糖苷类)、盐酸四环素(四环素类)，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；实验用防腐剂包括山梨酸钾和苯甲酸钠，购自广东广试试剂科技有限公司，1, 3-二羟甲基- 5, 5-二甲基乙内酰脲(1, 3-dimethylmethylol-5, 5- dimethylhydantoin, DMDM乙内酰脲或者DMDMH)和卡松(甲基氯异噻唑啉酮: 甲基异噻唑啉酮为3:1)，购自阿拉丁试剂公司。

实验仪器和耗材主要有多功能酶标仪(BioTek synergy H1)、无菌96孔培养板和移液器等。

1.2 实验方法 1.2.1 菌种来源

从2020–2022年广东省微生物分析检测中心日化产品中分离出29株污染Bcc；B. cenocepacia LMG 18828和B. cepacia ATCC 25416作为本实验的参考菌株。

1.2.2 菌种培养和菌落形态观察

从甘油管中取10 μL菌种保存液垂直滴于TSA平板上，培养48 h后肉眼观察其菌落形态并拍照记录；成功复苏后用TSA琼脂划线转接，于30 ℃培养1–2代，实验前转菌培养18–24 h后使用。

1.2.3 菌种鉴定

培养的纯菌落采用API 20NE进行菌种鉴定，实验操作按照说明书进行。纯菌种培养物用AmPure Microbial DNA Kit (广州美基生物科技有限公司)快速制备DNA溶液，以通用引物对27F/1492R进行PCR扩增16S rRNA基因片段，PCR原液送至北京擎科生物科技有限公司进行Sanger法测序，BLAST比对序列确定菌株的属和种。

1.2.4 MLST分型鉴定

将API鉴定结果和分子鉴定结果相结合，先以API结果确定属于Bcc菌株，进一步进行16S rRNA基因鉴定，并将测序结果进行BLAST比对后，筛选出分子鉴定结果Max identity达99%–100%的洋葱伯克霍尔德氏菌复合群Burkholderia sp.进行MLST鉴定。

MLST中的7个管家基因的扩增，引物序列来源于网站Bcc PubMLST website (https://pubmlst.org/Bcc/)，如表 1所示。MLST引物反应条件：96 ℃预变性1 min；96 ℃变性1 min，58 ℃引物退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。每个50 µL扩增反应混合液包括：25 µL 2×Rapid Taq Master Mix (诺唯赞)、2.0 µL染色体DNA (1–10 ng/µL)、2.0 µL上游引物(10 pmol/µL)、2.0 µL下游引物(10 pmol/µL)，19 µL PCR级H₂O。

1.2.5 MLSA进化树构建方法

串联MLST中的7个管家基因：atpD (443 bp)、gltB (400 bp)、gyrB (454 bp)、recA (393 bp)、lepA (397 bp)、phaC (385 bp)和trpB (301 bp)，标准菌株的7个管家基因从https://pubmlst.org/Bcc/下载，利用MEGA 11，采用最大似然法和GTRCAT替代模型对串联序列进行比对，在bootstrap检验中(1 000次重复)关联类群聚集在一起的重复树的百分比，得到系统发育树。

1.3 最小抑菌浓度(minimal inhitory concenctration, MIC)测定 1.3.1 药物配制

配制山梨酸钾、苯甲酸钠、DMDMH、卡松、头孢他啶、硫酸卡那霉素和盐酸四环素储备液，过滤除菌于4 ℃冰箱避光保存，实验前稀释至所需浓度。

1.3.2 微量肉汤稀释法

将培养过夜的纯菌落挑至MH肉汤培养基中，调节菌液OD₆₀₀值为0.08–0.13，再稀释100倍，此时菌液浓度约为10⁶ CFU/mL，于第1孔中加入抗菌药物(抗生素或防腐剂) 100 µL，二倍稀释抗菌药物直至每行的第10孔，往96孔板中每行1–11列加入100 µL菌液，第12列不加菌液只加MH肉汤，每行第11孔为阳性对照，每行第12孔为空白对照。

将96孔板置于30 ℃培养箱中恒温培养24 h，在确保阳性对照有明显生长以及空白对照无菌生长情况下，分别通过肉眼观察是否浑浊或沉淀和用酶标仪测定吸光值OD₆₀₀并换算成透光度，来判定和比较其MIC值，无菌生长的最低浓度定义为MIC。

2 结果与分析 2.1 MLST及菌种鉴定结果 2.1.1 新等位基因

在BC09、BC13和BC16中发现4个无法在MLST系统上匹配的基因，分别为gyrB、recA、lepA和trpB，已上传至pubMLST Burkholderia cepacia complex系统中，经过Eliza Depoorter (Laboratory of Microbiology, LM-UGent, Ghent University, Belgium)审核后，分配新的等位基因号为：gyrB-1351、recA-778、lepA-887和trpB-851 (表 2)，其基因序列已录入在Bcc PubMLST website系统中。新等位基因的发现丰富了Bcc数据库的基因数量，有助于更好地对Bcc进行分类。

2.1.2 MLSA进化树的构建

本文中BC02、BC03、BC09、BC13、BC16和BC21以及BC26、BC27、BC28和BC29等均匹配不到分型，为了确认其具体的菌种，串联MLST中的7个管家基因：atpD (443 bp)、gltB (400 bp)、gyrB (454 bp)、recA (393 bp)、lepA (397 bp)、phaC (385 bp)和trpB (301 bp)，采用最大似然法得到系统发育树(图 1)。

根据MLSA系统发育树聚类分析，本文中的大部分分离菌株主要聚类在B. cenocepacia、B. contaminans和B. aenigmatica，其中B. aenigmatica占比最大。BC02、BC03为新的ST分型，系统发育树中它们聚类在B. cenocepacia分支，BC09、BC13和BC16聚类在B. aenigmatica分支，BC21聚类在B. stabilis和B. pyrrocinia分支，与B. stabilis距离更近。新ST型菌BC29聚类在B. vietnamiensis分支，与BC25、BC26、BC27、BC28共同聚类在一个分支。编号为BC216、BC217、BC218、BC219、BC220和BC221的这6株为2020年前样品中被鉴定为B. lata的菌株^[10]，用MLST串联7个管家基因构建发育树，发现其聚类于B. aenigmatica分支。2020年Depoorter等^[2]对Bcc taxon K重新分类后，许多学者纷纷更改了对B. aenigmatica的误分类^[11-12]，大部分B. aenigmatica都被误分类为B. lata。

2.1.3 新MLST分型以及菌种鉴定

虽然16S rRNA基因序列分析通常用于识别潜在的新分类群，但该基因的分类学解析已不足以区分伯克霍尔德氏菌，特别是Bcc的成员^[2]，通过MLST分型能详细分别出菌株种类，本研究中的菌株的MLST分析共15个ST分型(表 3)，11株B. aenigmatica (38%)、6株B. cenocepacia (21%)、6株B. contaminans (21%)、5株B. vietnamiensis (17%)和1株B. stabilis (3%)。根据de Volder等^[12]的研究，B. contaminans和B. aenigmatica是工业产品和环境中最常见的污染物种。Cunningham-Oakes等^[11]通过重新分类确定了B. aenigmatica是比B. lata占比更多的一种主要污染菌株。本研究从日化产品分离的Bcc菌株中占主要污染数量的是B. aenigmatica。

通过MLSA进化树的聚类，BC02、BC03、BC09、BC13、BC16、BC21以及BC26、BC27、BC28和BC29，这些无法匹配的菌株已经申请到新的分型号，并匹配了相应的菌种(表 3中加粗字体表示)。

2.2 不同分型的菌落形态特征

B. cenocepacia的ST分型有：ST1519、ST2127、ST2128和ST839，从菌落形态上看ST1519、ST2127和ST839均为白色不透明菌落，菌落表面光滑，ST2128为淡黄色菌落(图 2)。B. contaminans的ST分型有：ST482、ST102、ST1639和ST482为黄色菌落，ST102和ST1639为白色菌落。B. aenigmatica的ST分型有：ST339、ST1642、ST2120、ST2122和ST855，均为白色不透明菌落。B. vietnamiensis的ST分型有：ST2118、ST2129和ST2118为白色菌落，ST2129为淡黄色菌落。B. stabilis的ST分型有：ST2130，为新的ST分型，其菌落颜色为白色不透明，与B. aenigmatica非常相似，难以从肉眼上分辨。

2.3 神秘伯克霍尔德氏菌(B. aenigmatica)的耐药性 2.3.1 抗生素对B. aenigmatica的抑制效果

B. cenocepacia和其他Bcc成员对大多数临床相关抗生素表现出高水平的固有耐药性，Bcc分离株的多重耐药包括喹诺酮类、氨基糖苷类和β-内酰胺类药物等。Bcc细菌的多种抗生素耐药性被归因于细菌外膜的通透性降低、耐药结瘤细胞分裂家族的外排泵^[13]和抗生素修饰酶^[14]等。

头孢他啶属于β-内酰胺类抗生素，通过抑制细菌细胞壁合成而引起细胞死亡，Everaert等^[14]的研究表明，Bcc菌株对β-内酰胺类抗生素的耐药性是由β-内酰胺酶和非β-内酰胺酶介导的耐药性机制介导的。作为工业环境和日化产品中最为常见的污染菌株，B. aenigmatica对头孢他啶的MIC值范围为1–16 μg/mL (表 4)，根据《CLSI 2021 31^st ed抗微生物药物敏感执行标准》^[15]的折点，Bcc物种的抗生素敏感性结果可以表示为敏感(S)、中间(I)和耐药(R)，11株样品中有9株MIC小于等于8 μg/mL，为头孢他啶敏感菌株(S)，其中对头孢他啶最敏感的菌株为BC14，头孢他啶MIC为1 μg/mL。不同存活环境对B. aenigmatica的耐药性有一定的改变，也有一些菌株提高了对头孢他啶的耐药性，BC17对头孢他啶的MIC为32 μg/mL，为头孢他啶耐药菌株(R)。硫酸卡那霉素为氨基糖甙类广谱抗生素，主要与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质合成，Bcc对氨基糖甙类存在固有耐药性，本次分离的神秘伯克霍尔德氏菌(B. aenigmatica)基本上属于耐药菌，只有BC15对卡那霉素敏感，可能是氨基糖苷类抗性基因丢失。大部分B. aenigmatica对四环素耐受，只有BC15和BC16为中间耐受。

本文B. aenigmatica均来源于日化产品，日化产品主要是采用防腐剂进行防腐，因此本研究的大部分B. aenigmatica对头孢他啶不耐受，但存在对四环素的耐药性以及对氨基糖苷类的固有耐药性。BC07、BC12、BC14和BC17同为ST339分型，但抗生素耐药性差异很大，BC14头孢他啶MIC为1 μg/mL，而BC17头孢他啶MIC高达32 μg/mL。BC09和BC13和BC16同为ST2120，它们的抗生素耐药性也不相同。说明即使是同一种菌种，同一种分型，不同的生存环境使得各菌株的耐药性有较大的差异。

2.3.2 防腐剂对B. aenigmatica的抑制效果

本研究菌株主要来自于日化产品中污染菌株，探究它们对防腐剂的耐药性有助于指导防腐剂的添加和使用，使产品更加不易被污染。卡松是目前使用较为广泛的一类防腐剂，广谱杀菌抑菌性能，广泛应用于洗发水、沐浴液、洗面奶和洗手液等淋洗类化妆品。其杀菌机理是与蛋白质的巯基反应、抑制活性物运输和葡萄糖氧化作用，使细菌变性。卡松类防腐剂主要包括甲基异噻唑啉酮(methylisothiazolinone, MI)、甲基氯异噻唑啉酮(methylchloroisothiazolinone, MCI)及MCI与MI的混合物^[16]。我国现行的《化妆品安全技术规范》(2015年版)中将卡松收录于准用防腐剂列表中，并规定卡松最大允许使用限量为0.001 5%，且仅限于淋洗类产品中使用^[17]。杨娟等^[18]报道从洗洁精中获得的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia) MIC为20 μg/mL，超出了使用限量，可能是污染的微生物对卡松产生了耐药性。本研究中菌株卡松MIC为0.2%–6.25%e-4 (表 5)，远远低于最大允许使用量0.001 5%，对卡松耐药性较差，本研究中的菌株无来自洗手液或洗洁精等淋洗产品，因此对卡松耐药性较差，说明菌株对防腐剂的耐药性很大程度取决于产品中所使用的防腐剂。

DMDMH具有广谱抗菌活性，可通过抑制革兰氏阴性和阳性细菌、酵母菌及霉菌等起到防腐作用，主要应用于化妆品、洗涤用品和纺织品中^[19]。我国现行的《化妆品安全技术规范》(2015年版)中规定DMDMH最大允许使用量为0.6%，本研究中DMDMH对神秘伯克霍尔德氏菌B. aenigmatica MIC为0.006 25%–0.2%，小于0.6%，说明DMDMH在最大允许使用量内能很好地抑制B. aenigmatica生长。除了BC09和BC16之外，其他菌株MIC均高于标准菌株LMG 18828和ATCC 25416，这些来自日化产品的菌株对DMDMH的抗性增加，这与Rushton等的研究一致^[6]，BC09、BC13和BC16为同一ST分型，它们对DMDMH的耐药性并不相同，这可能取决于它们内在的防腐剂耐药性和稳定的适应性变化，如外排增强等^[6]。

苯甲酸钠是苯甲酸的钠盐，是广泛应用于食品、药物、化妆品、牙膏、香料、烟叶和饲料的防腐剂^[20]。山梨酸钾是由国际粮农组织与世界卫生组织共同推荐的一种安全高效的防腐剂，能够用于食品、饮料、烟草、农药及化妆品等各个行业^[21]。我国现行的《化妆品安全技术规范》(2015年版)中规定苯甲酸钠和山梨酸钾的最大允许使用量分别为0.5%和0.6%，本研究中苯甲酸钠和山梨酸钾对B. aenigmatica的MIC为0.1%–1.6%，标准菌株LMG 18828和ATCC 25416的MIC小于最大允许使用量，但分离菌株大部分MIC都超出了最大允许使用量，除了BC08和BC15外，其他菌株均表现出对苯甲酸钠和山梨酸钾的耐药性。

综上所述，卡松和DMDMH作为常见的日化产品防腐剂，对B. aenigmatica具有很好的抑菌效果，但在有效抑菌范围内来自日化产品中的B. aenigmatica对DMDMH的抗性有所增加。本研究中来自日化产品的B. aenigmatica对苯甲酸钠和山梨酸钾这2种防腐剂具有较强的耐药性，仅使用苯甲酸钠或山梨酸钾的其中一种并不能很好地对产品进行有效防腐。因此，在实际生产中需要充分考虑B. aenigmatica对防腐剂发生耐药的可能性，设计出更加优化的防腐体系，定期检查微生物污染问题，及时发现Bcc耐药菌并调整防腐剂方案。

3 结论与展望

本文利用MLST法对来自日化产品的Bcc进行分类分型，发现了新的等位基因并确立了新的分型，充实了Bcc数据库，使Bcc分类更加详细化，不同的管家基因可能主导了Bcc不同的功能，新的等位基因和分型预示着Bcc新菌株各方面的进化方向，为Bcc污染预防、耐药性逆转和Bcc疾病预防提供基础研究。Bcc分类一直较为复杂，目前尚存在很大的更新空间，本文对2020年以前本单位收集的部分Bcc分类进行了校正，尽可能正确分类Bcc并研究其分类意义。

本文还对2020年重新分类的Bcc菌株神秘伯克霍尔德氏菌B. aenigmatica进行了耐药性研究，实验证明，尽管不在含有抗生素的环境中生长，大部分B. aenigmatica对氨基糖苷类和四环素类抗生素均具有耐药性，同时B. aenigmatica对日化产品中常见的防腐剂具有耐药性，这可能成为致病性Bcc菌株的重要耐药基因库来源，本实验室将进一步研究其耐药机理和耐药逆转的方向，以期减少Bcc对日化的污染和对人类健康的影响。