2023, Vol. 63
表1(Table 1)
六种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测体系的构建
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20230044
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 张晓峰, 宋士琦, 曾若雪, 陈吴健, 莫虹斐, 王正亮, 帅江冰. 2023
- ZHANG Xiaofeng, SONG Shiqi, ZENG Ruoxue, CHEN Wujian, MO Hongfei, WANG Zhengliang, SHUAI Jiangbing.
- 六种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测体系的构建
- A MALDI-TOF MS system for simultaneous detection of six RNA viruses causing porcine respiratory diseases
- 微生物学报, 63(9): 3653-3666
- Acta Microbiologica Sinica, 63(9): 3653-3666
-
文章历史
- 收稿日期：2023-01-31
- 网络出版日期：2023-04-23
引用本文 |
张晓峰, 宋士琦, 曾若雪, 陈吴健, 莫虹斐, 王正亮, 帅江冰. 六种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测体系的构建[J]. 微生物学报, 2023, 63(9): 3653-3666.
Zhang Xiaofeng, Song Shiqi, Zeng Ruoxue, Chen Wujian, Mo Hongfei, Wang Zhengliang, Shuai Jiangbing. A MALDI-TOF MS system for simultaneous detection of six RNA viruses causing porcine respiratory diseases[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2023, 63(9): 3653-3666.
六种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测体系的构建
1. 杭州海关技术中心, 浙江 杭州 311202;
2. 浙江省检验检疫科学技术研究院, 浙江 杭州 310016;
3. 中国计量大学生命科学学院, 浙江 杭州 310018
2. 浙江省检验检疫科学技术研究院, 浙江 杭州 310016;
3. 中国计量大学生命科学学院, 浙江 杭州 310018
摘要：[目的] 建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)和猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)多目标检测方法，同时对SIV进行通用型、H1型及H3型分型检测。[方法] 本研究根据6种病原体基因的保守序列，设计了6对加标引物及对应的延伸探针并进行单反应试验。通过体系优化引物浓度和反应条件，以及方法特异性、重复性及灵敏度分析，使用MALDI-TOF MS检测方法及荧光定量PCR方法分别对临床样本和猪源产制品进行检测，并对结果进行对比验证。[结果] 质谱结果显示，6种产物峰仅在靶标病毒对应的产物位置出现峰值，其他常见猪病病原在质谱图像中均未出现干扰，表明该体系的特异性良好。体系中每种病毒在高、中、低浓度时的批内阳性符合率均为100%，批间符合率均≥96.7%，表明该体系的重复性良好。灵敏度分析结果显示，体系中各病毒最低检测限在6.73–21.25拷贝/μL范围。应用MALDI-TOF MS多重检测方法对124份组织、饲料及猪肉样品进行检测，检出PRRSV阳性样本9份，SIV阳性样本3份(其中SIV-H1阳性样本2份，SIV-H3阳性样本1份)。将以上结果与荧光定量PCR方法分析结果进行对比验证，2种方法对各病原体检测结果的总符合率可达到99.2%–100%。[结论] 本研究建立的6种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测方法为相关疫病监测和快速鉴别，以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。
关键词：猪呼吸道病毒 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) 高通量检测
A MALDI-TOF MS system for simultaneous detection of six RNA viruses causing porcine respiratory diseases
1. Hangzhou Customs Technical Center, Hangzhou 311202, Zhejiang, China;
2. Zhejiang Academy of Science & Technology for Inspection & Quarantine, Hangzhou 310016, Zhejiang, China;
3. College of Life Sciences, China Jiliang University, Hangzhou 310018, Zhejiang, China
2. Zhejiang Academy of Science & Technology for Inspection & Quarantine, Hangzhou 310016, Zhejiang, China;
3. College of Life Sciences, China Jiliang University, Hangzhou 310018, Zhejiang, China
Abstract: [Objective] To establish a multi-target method based on matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for the simultaneous detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), classical swine fever virus (CSFV), foot-and-mouth disease virus (FMDV), and swine influenza virus (SIV), and the detection of the general type, H1 type and H3 type of SIV. [Methods] We designed six pairs of primers and corresponding extension probes according to the conserved sequences of six pathogens and conducted single reaction tests. The primer concentrations and the reaction conditions were optimized for the established method. After examination of the specificity, repeatability, and sensitivity, the MALDI-TOF MS method was used to detect clinical samples and pig-derived products, and the results were compared with those obtained by fluorescence quantitative PCR. [Results] The established method only generated peaks corresponding to the positions of the target viruses, and other common pathogens causing swine diseases did not appear in the mass spectra, which indicated that the system had good specificity. The in-batch positive coincidence rate of each virus at high, medium, and low concentrations was 100%, and the inter-batch coincidence rate was ≥96.7%, indicating that the system had good repeatability. The minimum limit of detection for each virus in the system varied within 6.73–21.25 copies/μL. We then used the MALDI-TOF MS method to detect 124 tissue, feed, and pork samples. A total of 12 positive samples were detected, including nine PRRSV positive samples and three SIV positive samples (two SIV-H1 positive samples and one SIV-H3 positive sample). We then compared the above results with the results from fluorescence quantitative PCR, and found that the total coincidence rate of the two methods for detection of each pathogen was 99.2%–100%. [Conclusion] A method for the simultaneous detection of six RNA viruses causing porcine respiratory diseases was established based on MALDI-TOF MS. This sensitive and specific high-throughput multi-target detection method facilitates the surveillance and rapid identification of related diseases in the import and export animal quarantine.
Keywords:
porcine respiratory virus matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) high-throughput detection
猪呼吸系统疾病致病源复杂，常为病原体、外界环境或管理条件等多因素相互作用的结果[1]。由于该症候群病原种类较多，规模化养殖导致病毒传播速度快，加之部分猪只感染后症状相似，可能造成较大范围的混合感染。因此，猪呼吸道症候群病原一直是现代养猪业规模化和集约化发展的制约因素之一，其病原包括猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)及口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)等。PRRSV在猪只感染后，多产生发热、呼吸困难和繁殖障碍等症状，其与FMDV、CSFV一同被世界动物卫生组织列为法定报告传染病，是各级政府动物防控相关单位长期重点监测的猪疫病，对我国养猪业影响巨大，且完全清除和控制难度较大。FMDV被列为我国一类动物疫病，可引起偶蹄动物急性、热性和高度接触性疾病，与SIV均为人畜共患病原。与FMDV不同，SIV对猪只的影响并不是最为严重的，但鉴于猪只在流感病毒传播中扮演着“病毒混合器”的角色[2]，SIV的分型检测对预防猪只感染及流感病毒监测十分必要[3]。病原的快速诊断是控制该疫病发生的前提，因此建立高效的多病原体同时检测方法尤为重要。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术是一种新型生物大分子检测技术，可对一定质量范围的核酸、多肽及蛋白质等进行分析。通过对处理后的样本基质共结晶进行激光轰击，该方法可根据样品离子化后分子量差异，得到关于样品内大分子的质量图谱[4-6]。而MALDI-TOF MS与多重PCR反应联用作为一种核酸质谱技术，其针对多重PCR扩增后的片段，分别设计对应的延伸探针(unextended extend probe, UEP)，延伸探针与扩增产物以经虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP)消化后的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)为底物进行单碱基延伸反应后，可使用质谱手段得到多组特异性核酸片段的质量信号，从而完成对样本的多靶标检测。
MALDI-TOF技术具备单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)检测能力[6]，在基因分型检测方面应用前景广阔，现用于肿瘤易感基因检测、遗传病早筛及细菌耐药突变检测[7-9]等。此外，MALDI-TOF核酸质谱技术在病原微生物的检测方面已有较多研究，如人呼吸道病毒、冠状病毒、性相关疾病病毒、乳头瘤病毒、疱疹及多瘤病毒和鸭症候群病毒检测[10-17]等。本课题组前期针对7种猪呼吸道DNA病毒建立了MALDI-TOF MS检测方法[18]，该方法稳定性与特异性良好，每种病原体的检测限在8.65–26.27拷贝/μL之间，与单重荧光PCR检测方法性能相当。基于以上研究基础，本研究对SIV、PRRSV、CSFV及FMDV等猪呼吸道症候群RNA病毒进行了多重引物及延伸探针的设计，并对SIV目前主要流行和危害比较严重的H1、H3两个亚型[19]进行分型检测，建立了基于MALDI-TOF MS方法的6重常见猪呼吸道RNA病毒检测方法，为猪只的批量检疫及猪源产制品的病毒检测提供了一种新手段。
1 材料与方法 1.1 病毒FMDV灭活疫苗(OHM/02株+AKT-111株)购自金宇生物技术股份有限公司。SIV-H1灭活疫苗(TJ株)购自武汉科前生物股份有限公司，SIV-H5、H7灭活疫苗(Re-12株+Re-3株)购自青岛易邦生物工程有限公司。CSFV、PRRSV (HuN4株)、伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV, Bartha株)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV, CV777株)及猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2, PCV-2, JH SRJ株)由浙江大学惠赠。猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)由浙江农林大学惠赠。猪博卡病毒(porcine bocavirus, PBoV)核酸由本实验室保存。按TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit配套试剂说明书对毒株及疫苗进行核酸的提取纯化，并将DNA或反转录后的cDNA模板于–20 ℃保存备用。
1.2 试剂及仪器TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、PrimeScript™ IV 1st strand cDNA Synthesis Mix、Premix Ex TaqTM购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Equalbit® dsDNA HS Assay Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；PCR Reagent Set、SAP Reagent Set、Iplex Pro Reagent Set购自Agena Bioscience公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒4.0及NP968-C全自动核酸提取仪购自西安天隆科技有限公司；Qubit 4荧光计、ProFlex PCR仪、QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪购自Thermo Fisher公司；DP-TOF核酸质谱仪来自浙江迪谱诊断技术有限公司。
1.3 引物和质量探针的设计和合成下载GenBank收录的相关病毒基因序列，使用ClustalW和MEGA-X进行多重序列对比，最终选择PRRSV的ORF6基因、CSFV的5′-UTR基因、FMDV的3D基因、SIV的M1基因、SIV-H1与SIV-H3的HA基因保守区域作为目的片段。根据所选片段，使用Primer 3及MassARRAY Assay® Design Suite (Agena)设计用于病毒检测的特异性PCR引物及相应的延伸探针，并用Primer-BLAST、MFEprimer 3.1对所设计的多重引物及探针分别进行特异性、引物二聚体及发卡结构的评估。所选病毒目的基因、引物序列及质量信息见表 1。多重PCR引物及延伸探针，用于对比验证的荧光定量PCR引物及探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和纯化。
表 1. CSFV、SIV、PRRSV、FMDV、SIV-H3及SIV-H1目的基因及引物信息
Table 1. CSFV, SIV, PRRSV, FMDV, SIV-H3, and SIV-H1 target genes and primer information
| Species | Target gene | Sequence of primer (5′→3′) | Mass probe (5′→3′) | Mass probe mass (Da) | Extended mass probe mass (Da) |
| CSFV | 5′-UTR | F: ACGTTGGATGTACTCAGGACTTAGACCACC | AGGGAGCTCGCCACT | 4 579.0 | 4 850.2 |
| R: ACGTTGGATGCGAACTGGGCTAGCCATGC | |||||
| SIV | M1 | F: ACGTTGGATGCGTCTACGCTGCAGTCCTCGC | CAGTCCTCGCTCACTG | 4 794.1 | 5 081.3 |
| R: ACGTTGGATGGGCTAAAGACAAGACCAATC | |||||
| PRRSV | ORF6 | F: ACGTTGGATGTAACCACGCATTTGTCGTCC | CCACTACGGTCAACGGCA | 5 454.6 | 5 701.7 |
| R: ACGTTGGATGCCACCCAACACGAGGCTTTT | |||||
| FMDV | 3D | F: ACGTTGGATGCAGGAGAAGTTGATCTCCG | AGTTGATCTCCGTGGCAG | 5 531.6 | 5 818.8 |
| R: ACGTTGGATGGATCTGTAGCTTGGAATCTC | |||||
| SIV-H3 | HA | F: ACGTTGGATGATGGCAAAGGAAATCCATAG | GGATCCAATCTTTGTATCCT | 6 059.0 | 6 346.2 |
| R: ACGTTGGATGTGACCATGATGTATACAGAG | |||||
| SIV-H1 | HA | F: ACGTTGGATGCATTAGAACACATCCAGAA | GGATGGCCCCCAGGGAGACT | 6 169.0 | 6 440.2 |
| R: ACGTTGGATGACCAGATTTTGGCGATCTA |
1.4 标准质粒的建立
以GenBank中公布的CSFV (NC_002657.1)、PRRSV (AF066183.4)、FMDV (AY593823.1)、SIV (U53169.1)、SIV-H1 (JN809161)和SIV-H3 (NC_007366.1)基因序列为模板，参照病毒目的片段选取相应位置，由生工生物工程(上海)股份有限公司构建pUC-57标准质粒。使用Qubit 4测得每一质粒浓度，根据(NA×质粒浓度)/(碱基数× 660 Da/bp)=copies/mL，其中NA=6.02×1023，进一步得到各质粒拷贝数：6.09×109拷贝/μL (CSFV)、1.24×1010拷贝/μL (PRRSV)、9.56×109拷贝/μL (FMDV)、1.48×1010拷贝/μL (SIV)、8.29×109拷贝/μL (SIV-H1)和4.12×109拷贝/μL (SIV-H3)，按10倍梯度稀释成109–100拷贝/μL共10个梯度，将同一浓度水平的6种质粒等体积混合，得到各梯度的混合标准质粒，置于–20℃保存备用。
1.5 单重反应试验反应体系中仅加入该靶标的扩增引物及延伸探针，以1.4中每种中浓度质粒(104拷贝/μL)为模板，设置ddH2O为空白对照，对6种靶标分别进行单靶标扩增试验，通过质谱结果来验证每组靶标扩增引物及延伸探针的反应状况。
1.6 多重体系反应条件及优化MALDI-TOF MS与PCR联用方法主要通过对样本DNA或cDNA进行多重PCR反应、SAP消化反应以及单碱基延伸反应，延伸产物再通过质谱仪进行检测与分析。(1) 反转录反应：将2 μL模板RNA与4 μL 5×PrimeScript IV cDNA Synthesis Mix、2 μL Random 6 mers混合，用ddH2O补至20 μL，反应程序为30 ℃ 10 min；42 ℃ 15 min。(2) 多重PCR反应：将2 μL质粒或反转录后的cDNA模板与1.2 μL PCR Buffer Mix、1 μL PCR引物混合液一并混合，用ddH2O补至5 μL，反应程序为95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，进行35个循环；72 ℃ 5 min。(3) SAP消化反应：将扩增产物加入2 μL SAP酶混合液，反应程序为37 ℃ 40 min；85 ℃ 5 min。(4) 延伸反应：将消化产物中加入1 μL延伸探针混合液，0.2 μL Inplex buffer及0.2 μL Termination mix，用ddH2O补至9 μL。反应程序为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，进行40个循环；72 ℃ 3 min。将反应结束后的延伸产物，转至384板，用ddH2O补至25 μL，8 000 r/min离心2 min。将离心后的384孔板及其配套芯片放入质谱仪，完成样本设置及芯片编板后进行质谱飞行参数设置。启动点样状态默认设置(400)，纯化树脂进样量为10 μL，激光发射器的激光脉冲设置为30次，每个样本数据最大采集次数设置为9次。使用MassARRAY Typer软件对质谱信号进行处理及分析。
根据延伸效率E=S产物峰/(SUPE残留峰+S产物峰)，以E≥0.8为标准，同时考虑多重延伸探针的相对峰高，分别对体系中多重引物和延伸探针比例进行调整。以104拷贝/μL混合质粒为模板，使用初始浓度分别为0.5、5 μmol/L的引物与延伸探针对多重体系进行优化，以获得具有清晰延伸探针峰及产物峰的质量信号谱图。
1.7 特异性试验以PCV-2、PEDV、PBoV、PPV和PRV等非靶标的常见猪病病毒基因组核酸，以及SIV-H1、SIV-H3、SIV-H5/H7、PRRSV、CSFV和FMDV这些靶标基因组核酸为模板，以102拷贝/μL标准质粒混合模板为阳性对照，ddH2O为阴性对照，进行MALDI-TOF MS多重检测体系的特异性试验。若各非靶标病原体无延伸产物峰，而SIV、SIV-H1、SIV-H3、PRRSV、CSFV、FMDV及混合质粒有延伸产物峰出现在特定位置，且产物峰之间无重叠，则认为检测体系特异性良好。
1.8 敏感性试验为评价该方法的灵敏度，使用优化后的反应体系对混合质粒进行实验。将104、103、102、50、25、10、5、2.5、1拷贝/μL的混合标准质粒作为模板，以优化后的MALDI-TOF MS检测体系对每组梯度进行10次重复，每次重复均为阳性时体系中质粒标准品的浓度被认为是MALDI-TOF MS检测体系对该种病毒的最低检测限(limit of detection, LOD)。
1.9 重复性试验以高、中、低浓度(106、104、102拷贝/μL)的混合质粒标准品为模板，每组稀释度设置20个重复进行实验，来评估MALDI-TOF MS法对每种病毒检测结果的批内重复性；此外，将上述混合质粒标准品在3个不同时间分别进行检测，每个浓度设置10个重复，记录3批独立实验各稀释度质粒的检测结果，以评价该方法的批间重复性。
1.10 样品检测应用34份组织样本、42份含猪源性成分饲料样品和48份新鲜猪肉样品由本实验室收集保存。分别取0.5 g组织或新鲜猪肉、饲料样品，经低温研磨后按质量体积比1:10置于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)中，振荡混匀后10 000 r/min离心5 min，取上清进行核酸提取。按核酸提取仪NP968-C配套试剂说明书对样品进行总RNA提取，使用PrimeScript™ IV 1st strand cDNA Synthesis Mix对所得核酸进行反转录，并将得到的cDNA用于MADLI-TOF MS方法及荧光定量PCR方法的检测。荧光定量PCR方法为PRRSV[20]、CSFV[21]、FMDV[22]、SIV[23]、SIV-H1及SIV-H3[24]六种病毒单靶标检测，将2种方法所得结果按照(真阳性数+真阴性数)/检测总数×100%，进行总符合率的计算，并对结果进行评价。
2 结果与分析 2.1 单重反应试验以104拷贝/μL各靶标质粒为模板，使用单一引物及延伸探针进行单靶标扩增，可分别得到每个靶标以质量(mass)为横坐标、信号强度(intensity)为纵坐标的质谱图像。如图 1所示，体系中每种病毒均仅有延伸产物单峰(CSFV: 4 850.2 Da, SIV: 5 081.3 Da, PRRSV: 5 701.7 Da, FMDV: 5 818.8 Da, SIV-H3: 6 346.2 Da, SIV-H1: 6 440.2 Da)，其对应的阴性对照仅有延伸探针峰单峰(CSFV: 4 579.0 Da, SIV: 4 794.1 Da, PRRSV: 5 454.6 Da, FMDV: 5 531.6 Da, SIV-H3: 6 059.0 Da, SIV-H1: 6 169.0 Da)，质谱图像清晰且质量检测范围内并未出现杂峰，表明该体系中每种病毒的扩增引物及质量探针均可有效反应。
|
| 图 1 六种病毒单反应试验结果 Figure 1 Results of the single-reaction test for six viruses. Red peak: ddH2O as template; Black peak: 104 copies/μL plasmid as template. A: CSFV. B: FMDV. C: PRRSV. D: SIV. E: SIV-H1. F: SIV-H3. |
2.2 反应体系的建立
如图 2所示，体系中每种病毒在质谱图像中对应有延伸探针(UEP)和单碱基延伸产物2个峰位置，检测结果中质谱图像若仅在延伸探针处存在峰值，表示该种靶标检测结果为阴性，此时延伸探针未参与反应；若在延伸产物处出现峰值(SNR≥6)，则表示该靶标检测结果为阳性。体系中每组引物及延伸探针的浓度经过优化后，最终采用的多重PCR引物分别为0.6 μmol/L (SIV)、0.5 μmol/L (SIV-H1)、0.5 μmol/L (SIV-H3)、0.3 μmol/L (PRRSV)、0.5 μmol/L (CSFV)、0.6 μmol/L (FMDV)，延伸探针的最佳浓度分别为6 μmol/L (SIV)、5 μmol/L (SIV-H1)、5 μmol/L (SIV-H3)、5 μmol/L (PRRSV)、3.5 μmol/L (CSFV)、5 μmol/L (FMDV)。
|
| 图 2 混合质粒及空白对照的质谱结果合并图 Figure 2 Merged image of mass spectrometry results of mixed plasmids and blank controls. Red peak: ddH2O as template; Black peak: 102 copies/μL mixed plasmids of six targets. |
2.3 特异性分析
分别以SIV-H1、SIV-H3、SIV-H5/H7、PRRSV、CSFV、FMDV等靶标病毒cDNA，以及PCV-2、PEDV、PBoV、PPV和PRV等非靶标常见猪病病毒DNA或cDNA为模板，经MALDI-TOF MS检测后的实验结果如图 3所示。结果显示，体系中每种靶标病毒在各自延伸产物处均分别产生单峰(SNR≥6)，非靶标模板只存在延伸探针峰，而在延伸产物处均无峰(SNR≤3)，且阴性对照及阳性对照成立。其中SIV-H1、SIV-H3在其自身及SIV的延伸产物处均存在产物峰，而SIV-H5/H7仅在SIV通用型位置产生阳性，在SIV-H1、SIV-H3位置无产物峰及干扰峰(图 4)，与实验预期相符。结果表明，该方法能够准确识别目标病毒，且与其他非靶标病原无交叉反应，具有良好的特异性。
|
| 图 3 六重核酸质谱体系特异性试验结果 Figure 3 Six-plex nucleic acid mass spectrometry system specificity test results. X: Six redetection system target; Y: ddH2O, each virus and six target mixed plasmid; Z: Signal to noise ratio (SNR). |
|
| 图 4 SIV-H1、SIV-H3及SIV特异性试验结果 Figure 4 Sensitivity test results of SIV-H1, SIV-H3 and SIV. A: Using SIV-H1 nucleic acid as the template, the red arrow indicates that SIV (5 081.3 Da) and SIV-H1 (6 440.2 Da) are positive. B: Using SIV-H3 nucleic acid as template, the red arrow indicates that SIV (5 081.3 Da) and SIV-H3 (6 346.2 Da) are positive. C: Using SIV-H5 and SIV-H7 nucleic acid as template, the red arrow is only positive for SIV (5 081.3 Da). |
2.4 敏感性分析和最低检测限
为评价检测体系的敏感性，根据优化后的引物及UEP浓度对104–100拷贝/μL的混合质粒模板进行MALDI-TOF MS实验。根据10次重复均为阳性的质粒浓度，可得到每种病毒的最低检测限：CSFV 6.76拷贝/μL、SIV 8.22拷贝/μL、PRRSV 13.73拷贝/μL、FMDV 21.25拷贝/μL、SIV-H3 9.15拷贝/μL和SIV-H1 18.41拷贝/μL (图 5)，体系中每种靶标的检测浓度均小于25拷贝/μL，其中CSFV、SIV的检测水平可达单拷贝，表明体系的敏感性较好。
|
| 图 5 六重核酸质谱敏感性试验结果 Figure 5 Six-plex nucleic acid mass spectrometry sensitivity test results. X: Six-plex system target; Y: Mixed plasmids of six targets with different concentrations; Z: The number of positive results in ten replicates. |
2.5 重复性分析
为验证体系对不同浓度下混合质粒的重复性，以106、104、102拷贝/μL三种浓度为代表，将对应混合质粒作为模板各进行20组重复；此外，于3个时间段分别进行检测，每个浓度重复10次。结果如表 2所示，高、中、低浓度组(106、104、102拷贝/μL)中SIV、SIV-H1、SIV-H3、PRRSV、CSFV及FMDV六种靶标的检测结果全部为阳性(SNR≥6)，表明该方法批内重复性良好。3个不同批次实验的检测结果中，SIV、SIV-H3、PRRSV、FMDV及CSFV阳性率均为100%，SIV-H1阳性率为96.7% (29/30)，表明该法具有较高的批间重复性(表 2)。
表 2. 重复性试验结果
Table 2. Results of repeatability test
| Plasmid concentration (copies/μL) | Species | Intra-assay of variation (%) | Inter-assay of variation (%) |
| 106 | SIV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) |
| SIV-H1 | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| SIV-H3 | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| PRRSV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| CSFV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| FMDV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| 104 | SIV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) |
| SIV-H1 | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| SIV-H3 | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| PRRSV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| CSFV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| FMDV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| 102 | SIV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) |
| SIV-H1 | 100.0 (20/20) | 96.7 (29/30) | |
| SIV-H3 | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| PRRSV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| CSFV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) | |
| FMDV | 100.0 (20/20) | 100.0 (30/30) |
2.6 样品检测应用
利用MALDI-TOF MS方法对34份组织或全血样品、42份含猪源性成分饲料样品、48份猪肉样品进行检测。结果如表 3所示，124份样品中检出阳性样品共计16份，均为组织样本检出。34份组织样本中，PRRSV检出9份，SIV检出共3份，其中SIV-H1、SIV-H3分别检出2份和1份。42份饲料样品及48份新鲜猪肉样品中6种靶标病毒均未检出。使用MALDI-TOF MS方法与PRRSV、CSFV、FMDV、SIV、SIV-H1、SIV-H3荧光定量PCR方法的检测结果进行对比。结果显示，2种方法的阳性检出结果基本一致，除SIV-H1符合率为99.2%外，其余5种靶标符合率均为100%。
表 3. MALDI-TOF MS多重检测体系与荧光PCR检测结果及总符合率
Table 3. Results and coincidence rate of detection by MALDI-TOF MS compared with qPCR
| Target | Positive number† | Total coincidence rate (%) | |
| MALDI-TOF MS | qPCR | ||
| PRRSV | 9/0/0 | 9/0/0 | 100.0 (124/124) |
| FMDV | 0/0/0 | 0/0/0 | 100.0 (124/124) |
| CSFV | 0/0/0 | 0/0/0 | 100.0 (124/124) |
| SIV-H1 | 2/0/0 | 1/0/0 | 99.2 (123/124) |
| SIV-H3 | 1/0/0 | 1/0/0 | 100.0 (124/124) |
| SIV | 3/0/0 | 3/0/0 | 100.0 (124/124) |
| †: Tissue, pork and feed samples tested by two methods. | |||
3 讨论与结论
中国是世界猪肉最大生产国与消费国，2022年国内猪肉生产量占到世界总产量的44.5%，而根据2022年国内肉类消费结构统计显示，在所有肉类消费中猪肉占到77.7%。近年来，随着生猪养殖业不断发展，猪病带来的危害也愈发明显。猪呼吸与繁殖综合征、腹泻综合征等不同症候群病原导致的病毒病限制了养猪业及猪肉交易市场的进一步发展，其中一些人畜共患病原体也对公众的健康造成危害。例如流感病毒，截至目前SIV可按照血凝素(hemagglutinin, HA)及神经氨酸酶(neuraminidase, NA)分为H1–H18、N1–N11等亚型，经过基因重排后存在多种病毒亚型，而猪体内同时存在唾液酸-2, 3-半乳糖苷与唾液酸-2, 6-半乳糖苷2种流感病毒的特异性受体，不同亚型的流感病毒在猪体内可通过重组与适应，致使猪只存在感染禽流感(SIV-H5、H7和H9)及人流感(SIV-H1、H2和H3)的风险[25]。此外，国外进口猪只及其产制品也可能携带病原体，如2018–2019年间传入的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)。作为一种致死率极高的烈性传染病，ASFV目前尚无批准上市的商品化疫苗，口岸防御与检疫仍是防止该类疫情传入国内的首要方式[26]。由此可见，针对重点病原建立和完善多重病原体检测体系十分必要。
目前动物疫病病原检测方法主要包括基于血清学的酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫酶和免疫荧光，及血凝试验等传统方法，基于分子生物学检测的PCR、荧光定量PCR、数字PCR、二代测序，以及液相芯片、核酸质谱等技术。传统血清学方法技术最为成熟，但对于试验结果的评价可能存在主观性，且较难达到短时间内多种病原体同时检测的要求。以PCR为代表的低通量检测技术，灵敏度高且操作简易；尤其数字PCR作为绝对定量技术，能够很好地对复杂基质中微量靶标进行检测，但其成本偏高，在实际应用时可能存在同时检测靶标少、荧光串扰等局限。二代测序(next-generation sequencing, NGS)技术可对包含未知病原的样本进行高通量检测，但操作较为复杂，以及建库等因素导致重复性不佳；三代测序(third generation sequencing, TGS)技术自身测序深度不高，且错误率与NGS相比较高，检测成本仍高于前几种方法，难以应用于进出境等大样本检测的场景。此外，用于多种病原体检测的多重PCR技术，保留了以PCR技术灵敏度高、成本低的优势，但在应用时往往受限于体系中多组引物间产生的二聚体、发夹结构等交叉反应，或荧光染料及探针荧光通道的限制，通常难以对4种及以上靶标进行同时检测。而MALDI-TOF MS与多重PCR联用技术在设计多重引物时，采用同源加尾(homo-tag assisted non-dimer, HAND)[27]策略，将每条PCR引物的5′端加入相同的质量标签(5′-ACGTTGGATG-3′)，能够有效减少引物二聚体的形成，同时避免少量二聚体及未反应引物对质谱中质量探针峰及产物峰位置的干扰，从而对多种病原体靶点进行同时检测。MALDI-TOF MS与多重PCR联用技术使用质谱手段，可同时对近6 000 Da质量范围的核酸片段进行检测，在面对多种靶标的中高通量检测项目时有较大的成本优势，适用于临床及进出口口岸情境下不同症候群动物疫病重要病原体的监测。
通过方法学验证，该RNA病毒检测方法具有较好的稳定性与特异性，体系中的每个靶标检测限均可达101拷贝/μL水平，与单重的荧光PCR相当。通过对组织及全血样本、饲料样本及新鲜猪肉样本进行检测，结果表明MALDI-TOF MS方法与荧光定量PCR方法对样本检测结果的符合率较高(99.2%–100%)，这与前期本课题组建立的猪呼吸道DNA病毒MALDI-TOF MS检测方法与qPCR方法的比对结果一致[18]。在本研究中，2种方法均在样品中检出了9份PRRSV阳性样本、3份SIV阳性样本(包括SIV-H3阳性样本1份)，而CSFV、FMDV均为阴性。2种方法的差异主要体现在对组织样本中SIV-H1的检测结果上：1份组织样本经MALDI-TOF MS方法检测，显示其SIV、SIV-H1均为阳性；荧光定量PCR方法结果显示该样本SIV-H1为阴性(Ct值≥38)，而SIV为阳性，提示该样本SIV-H1结果为假阴性。后期经测序确认，该样本确为SIV-H1阳性样本。此外，2种方法在42份饲料及新鲜猪肉样品中均未检出阳性，这可能是由于饲料中猪源成分在深加工及后续保藏过程中对病毒结构破坏较为严重，使得样品中病毒RNA片段的含量较低(≤25拷贝/μL)；或饲料所使用猪源成分可能未受到几种病毒的污染，对48份新鲜猪肉样品全部为阴性的结果也支持这一推测。
本研究首次建立了基于MALDI-TOF MS技术的猪呼吸道RNA病毒的多目标检测方法，用以检测SIV、SIV-H1、SIV-H3、PRRSV、CSFV及FMDV病毒，进一步完善了呼吸道症候群病原体检测体系，为疫病的快速诊断和相关病原体的中高通量检测提供了便利，适用于进出口动物检疫及相关疫病监测等情景。此外，本检测方法对猪流感病毒进行通用型和H1、H3型的分型检测，可进一步降低SIV的漏检率，在预防猪流感传播和大流行[28]方面也具有一定的经济价值和公共卫生意义。
References
| [1] |
蒋大平. 猪呼吸道疾病原因与治疗方法[J]. 畜牧兽医科学(电子版), 2020(6): 51-52.
JIANG DP. Causes and treatment of respiratory disease in pigs[J]. Graziery Veterinary Sciences (Electronic Version), 2020(6): 51-52 (in Chinese). |
| [2] | VINCENT AL, PEREZ DR, RAJAO D, ANDERSON TK, ABENTE EJ, WALIA RR, LEWIS NS. Influenza A virus vaccines for swine[J]. Veterinary Microbiology, 2017, 206: 35-44 DOI:10.1016/j.vetmic.2016.11.026. |
| [3] |
冯兆民, 朱闻斐, 舒跃龙. 欧亚类禽猪流感病毒病原学研究进展[J]. 病毒学报, 2022, 38(1): 205-211.
FENG ZM, ZHU WF, SHU YL. Research progress in the etiology of Eurasian avian-like swine influenza viruses[J]. Chinese Journal of Virology, 2022, 38(1): 205-211 (in Chinese). |
| [4] | GAO X, TAN BH, SUGRUE RJ, TANG K. MALDI mass spectrometry for nucleic acid analysis[J]. Topics in Current Chemistry, 2013, 331: 55-77. |
| [5] | SINGHAL N, KUMAR M, KANAUJIA PK, VIRDI JS. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis[J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6: 791. |
| [6] |
中国核酸质谱应用专家共识协作组. 中国核酸质谱应用专家共识[J]. 中华医学杂志, 2018, 98(12): 895-900.
Chinese Expert Consensus Group on the Application of MALDI-TOF MS. Chinese expert consensus on application of MALDI-TOF MS[J]. National Medical Journal of China, 2018, 98(12): 895-900 (in Chinese). |
| [7] | TREMBIZKI E, SMITH H, LAHRA MM, CHEN M, DONOVAN B, FAIRLEY CK, GUY R, KALDOR J, REGAN D, WARD J, NISSEN MD, SLOOTS TP, WHILEY DM. High-throughput informative single nucleotide polymorphism-based typing of Neisseria gonorrhoeae using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2014, 69(6): 1526-1532 DOI:10.1093/jac/dkt544. |
| [8] | SUN LY, ZHANG C, AN SH, CHEN XP, LI YM, XIU LS, XU BP, XIE ZD, PENG JP. Comprehensive description of pathogens and antibiotic treatment guidance in children with community-acquired pneumonia using combined mass spectrometry methods[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2021, 11: 695134 DOI:10.3389/fcimb.2021.695134. |
| [9] |
王立琴, 张驰, 李晓东, 彭俊平. MALDI-TOF MS技术在传染病诊断中的应用进展[J]. 中国科学: 生命科学, 2022, 12: 1858-1867.
WANG LQ, ZHANG C, LI XD, PENG JP. Progress in applications of MALDI-TOF MS technology in the diagnosis of infectious diseases[J]. Scientia Sinica Vitae, 2022, 12: 1858-1867 (in Chinese). |
| [10] | SJÖHOLM MIL, DILLNER J, CARLSON J. Multiplex detection of human herpesviruses from archival specimens by using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2008, 46(2): 540-545 DOI:10.1128/JCM.01565-07. |
| [11] | PENG JP, YANG F, XIONG ZH, GUO JH, DU J, HU YF, JIN Q. Sensitive and rapid detection of viruses associated with hand foot and mouth disease using multiplexed MALDI-TOF analysis[J]. Journal of Clinical Virology, 2013, 56(2): 170-174 DOI:10.1016/j.jcv.2012.10.020. |
| [12] | XIU LS, ZHANG C, LI YM, WANG F, PENG JP. Simultaneous detection of eleven sexually transmitted agents using multiplexed PCR coupled with MALDI-TOF analysis[J]. Infection and Drug Resistance, 2019, 12: 2671-2682 DOI:10.2147/IDR.S219580. |
| [13] | LIU TT, KANG L, LI YW, HUANG J, GUO ZS, XU JL, HU Y, ZHAI ZX, KANG XP, JIANG T, LI H, SONG HX, WANG J, GAO S, LI JX, ZHOU XG, YUAN Y, ZHAO BH, WANG JL, XIN WW. Simultaneous detection of seven human coronaviruses by multiplex PCR and MALDI-TOF MS[J]. COVID, 2021, 2(1): 5-17 DOI:10.3390/covid2010002. |
| [14] |
刘宏钱, 宋朝晖, 梁巧米. 多重RT-PCR MassARRAY技术检测27种呼吸道病原体方法的建立和临床应用评价[J]. 检验医学, 2021, 36(9): 939-946.
LIU HQ, SONG CH, LIANG QM. Establishment and clinical application of multiple RT-PCR MassARRAY for the determinations of 27 respiratory pathogens[J]. Laboratory Medicine, 2021, 36(9): 939-946 (in Chinese). |
| [15] | ZHANG C, XIAO Y, DU J, REN LL, WANG JW, PENG JP, JIN Q. Application of multiplex PCR coupled with matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight analysis for simultaneous detection of 21 common respiratory viruses[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2015, 53(8): 2549-2554 DOI:10.1128/JCM.00943-15. |
| [16] | PENG JP, GAO L, GUO JH, WANG T, WANG L, YAO Q, ZHU HJ, JIN Q. Type-specific detection of 30 oncogenic human papillomaviruses by genotyping both E6 and L1 genes[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2013, 51(2): 402-408 DOI:10.1128/JCM.01170-12. |
| [17] | LIU N, WANG L, CAI GZ, ZHANG DB, LIN JH. Establishment of a simultaneous detection method for ten duck viruses using MALDI-TOF mass spectrometry[J]. Journal of Virological Methods, 2019, 273: 113723 DOI:10.1016/j.jviromet.2019.113723. |
| [18] |
宋士琦, 裘慧, 陈吴健, 莫虹斐, 金晨晨, 曾若雪, 王巍, 郭惠民, 帅江冰, 王正亮, 张晓峰. 基于MALDI-TOF核酸质谱的猪呼吸道病毒多目标鉴定方法的建立和应用[J/OL][J]. 微生物学报, 2023, 63(7): 2713-2727.
SONG SQ, QIU H, CHEN WJ, MO HF, JIN CC, ZENG RX, WANG W, GUO HM, SHUAI JB, WANG ZL, ZHANG XF. Establishment and application of a multi-target detection method for porcine respiratory viruses based on MALDI-TOF MS[J/OL][J]. Acta Microbiologica Sinica, 2023, 63(7): 2713-2727 (in Chinese). |
| [19] |
SHI HH. Investigation and analysis on the infection of swine influenza H1 and H3 in some areas of China[D]. Shanghai: Master's Thesis of Shanghai Jiao Tong University, 2015 (in Chinese). 石慧花. 国内部分地区样品猪流感H1、H3感染状况调查分析[D]. 上海: 上海交通大学硕士学位论文, 2015. |
| [20] |
General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China, Standardization Administration of the People's Republic of China. Real-time RT-PCR method for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: GB/T 35912—2018[S]. Beijing: Standards Press of China, 2018 (in Chinese). 国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. 猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法: GB/T 35912—2018[S]. 北京: 中国标准出版社, 2018. |
| [21] |
General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China, Standardization Administration of the People's Republic of China. Method of the real-time RT-PCR for the detection of classical swine fever virus: GB/T 27540—2011[S]. Beijing: Standards Press of China, 2012 (in Chinese). 国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法: GB/T 27540—2011[S]. 北京: 中国标准出版社, 2012. |
| [22] |
General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China, Standardization Administration of the People's Republic of China. Real-time RT-PCR for detection of foot and mouth disease virus: GB/T 27528—2011[S]. Beijing: Standards Press of China, 2012 (in Chinese). 国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法: GB/T 27528—2011[S]. 北京: 中国标准出版社, 2012. |
| [23] |
张春明, 乔传玲, 陈艳, 杨焕良, 辛晓光, 陈化兰, 冉多良. 猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立[J]. 中国预防兽医学报, 2008, 30(10): 805-810.
ZHANG CM, QIAO CL, CHEN Y, YANG HL, XIN XG, CHEN HL, RAN DL. Development of real-time fluorescent quantitative PCR for detection of M gene of swine influenza viruses[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2008, 30(10): 805-810 (in Chinese). |
| [24] |
王博, 王慧煜, 赵宝华, 罗静, 王承民, 何宏轩, 韩雪清. H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国畜牧兽医, 2017, 44(10): 3035-3041.
WANG B, WANG HY, ZHAO BH, LUO J, WANG CM, HE HX, HAN XQ. Development and application of duplex real-time RT-PCR assay for detection of H1 and H3 subtype swine influenza viruses[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2017, 44(10): 3035-3041 (in Chinese). |
| [25] |
毕保良, 李进涛. 猪流感诊断技术研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2009, 36(10): 179-183.
BI BL, LI JT. Research progress on diagnosis technology of swine influenza[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2009, 36(10): 179-183 (in Chinese). |
| [26] |
张丽, 罗玉子, 王涛, 孙元, 仇华吉. 非洲猪瘟诊断技术发展现状与需求分析[J]. 中国农业科技导报, 2019, 21(9): 1-11.
ZHANG L, LUO YZ, WANG T, SUN Y, QIU HJ. Current progress and demand analysis of diagnostic technologies for African swine fever[J]. Journal of Agricultural Science and Technology, 2019, 21(9): 1-11 (in Chinese). |
| [27] | DOELLINGER J, SCHROEDER K, WITT N, HEUNEMANN C, NITSCHE A. Comparison of real-time PCR and MassTag PCR for the multiplex detection of highly pathogenic agents[J]. Molecular and Cellular Probes, 2012, 26(5): 177-181. |
| [28] |
高灵茜, 崔梦一, 樊晓晖. 猪流感病毒基因池中的新成员: 新甲型H1N1流感病毒基因片段的存在及潜在威胁[J]. 中国人兽共患病学报, 2016, 32(9): 832-837.
GAO LX, CUI MY, FAN XH. The new member of the swine influenza virus gene pool: the existence of the 2009 pandemic H1N1 virus gene fragments and potential threats[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2016, 32(9): 832-837 (in Chinese). |