微生物学报  2024, Vol. 64 Issue (1): 238-253   DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230395.
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20230395
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会

文章信息

吴柯, 冼振宇, 熊浩铭, 伍梓斌, 张家豪, 孙宝丽, 郭勇庆. 2024
WU Ke, XIAN Zhenyu, XIONG Haoming, WU Zibin, ZHANG Jiahao, SUN Baoli, GUO Yongqing.
维生素E对高精料诱导亚急性瘤胃酸中毒奶牛粪便微生物群落的影响
Vitamin E alters the fecal microbial community in dairy cows with subacute rumen acidosis induced by a high-concentrate diet
微生物学报, 64(1): 238-253
Acta Microbiologica Sinica, 64(1): 238-253

文章历史

收稿日期：2023-06-06
网络出版日期：2023-09-15
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引用本文
吴柯, 冼振宇, 熊浩铭, 伍梓斌, 张家豪, 孙宝丽, 郭勇庆. 维生素E对高精料诱导亚急性瘤胃酸中毒奶牛粪便微生物群落的影响[J]. 微生物学报, 2024, 64(1): 238-253.
Wu Ke, Xian Zhenyu, Xiong Haoming, Wu Zibin, Zhang Jiahao, Sun Baoli, Guo Yongqing. Vitamin E alters the fecal microbial community in dairy cows with subacute rumen acidosis induced by a high-concentrate diet[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024, 64(1): 238-253.
维生素E对高精料诱导亚急性瘤胃酸中毒奶牛粪便微生物群落的影响
吴柯 , 冼振宇 , 熊浩铭 , 伍梓斌 , 张家豪 , 孙宝丽 , 郭勇庆     
华南农业大学动物科学学院, 广东 广州 510642
收稿日期：2023-06-06；接受日期：2023-09-07；网络出版日期：2023-09-15
基金项目：广东省自然科学基金(2019B1515210020)；国家自然科学基金(31872382)
摘要：[目的] 研究高精料诱导亚急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis, SARA)和添加维生素E (vitamin E, VE)调控下，奶牛粪便中微生物群落的变化，评估其对奶牛机体代谢的潜在影响，以期为探索SARA的生理机制提供数据支撑。[方法] 选取7头装有瘤胃瘘管的经产荷斯坦奶牛，分为3期开展，每期18 d。第一期为对照期(CON期)，日粮精粗比为50:50 [干物质基础(dry matter basis, DM基础)]；第二期为诱导期(HG期)，用占日粮15% (DM基础)的细粉小麦替代日粮中粗饲料，以期诱导奶牛发生SARA；第三期为调控期(HGE期)，在诱导期日粮基础上添加12 000 IU/d/头的VE。每期第18天为采样期，采集粪便用来测定微生物群落。[结果] 3个处理期的粪便中微生物群落结构存在差异，并且HG期的Shannon指数显著低于CON期(P＜0.05)。对门和属水平上的物种进行分析发现，与CON期相比，HG期的Proteobacteria和Blautia相对丰度显著升高(P＜0.05)，unidentified_bacteria、Euryarchaeota、Desulfobacterota、Rikenellaceae_RC9_gut_group和Alistipes相对丰度显著降低(P＜0.05)。与HG期相比，HGE期的Blautia相对丰度显著升高(P＜0.05)。功能预测分析表明，SARA造成奶牛机体代谢紊乱，VE可能通过提高微生物生长繁殖的稳定性，促进肠道健康微生物群落增殖，以调节肠道内环境和促进肠道健康。[结论] 高精料诱导SARA导致奶牛肠道微生物多样性降低，使奶牛机体代谢紊乱；在VE调控下，能通过促进有益肠道微生物群增殖，调控奶牛肠道健康和维持肠道稳态。
关键词：奶牛    亚急性瘤胃酸中毒    维生素E    粪便    微生物    
Vitamin E alters the fecal microbial community in dairy cows with subacute rumen acidosis induced by a high-concentrate diet
WU Ke , XIAN Zhenyu , XIONG Haoming , WU Zibin , ZHANG Jiahao , SUN Baoli , GUO Yongqing     
College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China
Received: 6 June 2023; Accepted: 7 September 2023; Published online: 15 September 2023
*Corresponding author: E-mail: SUN Baoli, baolisun@scau.edu.cn;
E-mail: GUO Yongqing, yongqing@scau.edu.cn.
Foundation item: This work was supported by the Natural Science Foundation of Guangdong Province (2019B1515210020) and the National Natural Science Foundation of China (31872382)
Abstract: [Objective] This study aims to observe the changes of the fecal microbial communities in the dairy cows with subacute rumen acidosis (SARA) induced by a high-concentrate diet and modulated by the addition of vitamin E (VE). The potential effects on the metabolism of dairy cows were evaluated to provide data for exploring the physiological mechanisms of SARA. [Methods] Seven multiparous Holstein cows with rumen fistulas were selected for this trial which was carried out in three phases of 18 days each. The first phase was the control (CON) phase, with a concentrate-to-forage ratio of 50:50 in the diet (dry matter basis). The second phase was the induction (HG) phase, in which the forage was replaced with wheat flour at 15% of the diet (dry matter basis) to induce SARA. The third phase was the regulation (HGE) phase, in which VE was added at 12 000 IU/d/cow on the basis of the diet in the HG phase. The feces samples were collected on day 18 in each phase, and the microbial communities in the samples were examined. [Results] The fecal microbial community structure showed significant differences between three phases and the Shannon index in the HG phase was lower than that in the CON phase (P < 0.05). The HG phase had higher relative abundance of Proteobacteria and Blautia and lower relative abundance of unidentified_bacteria, Euryarchaeota, Desulfobacterota, Rikenellaceae_RC9_gut_group, and Alistipes than the CON phase (P < 0.05). The relative abundance of Blautia in the HGE phase was higher than that in the HG phase (P < 0.05). The functional prediction results showed that SARA caused metabolic disorders in the dairy cows, while VE regulated the intestinal microbiota and health by improving the stability of microbial growth and promoting microbial reproduction. [Conclusion] The SARA induced by a high-concentrate diet led to reduced intestinal microbial diversity and metabolic disorders in dairy cows. VE can regulate intestinal health and maintain intestinal homeostasis by promoting the proliferation of beneficial intestinal microorganisms.
Keywords: dairy cows    subacute ruminal acidosis    vitamin E    feces    microorganisms    

随着我国经济高速增长和人民生活水平不断提高，生产结构不断优化，奶业得到迅猛的发展。在现代奶牛生产中，饲喂高产奶牛主要挑战是在保持瘤胃功能正常的同时，让奶牛采食更多的精饲料来满足产奶的需求[1]。但是，这种饲喂方式会削弱奶牛的咀嚼和反刍活动，降低碱性唾液的分泌，影响瘤胃功能[2]。日粮中的淀粉可在瘤胃中快速发酵，产生大量挥发性脂肪酸(volatile fatty acids, VFA)，降低瘤胃pH值[3]。缺少唾液缓冲液的供应及VFA的产生会引发瘤胃代谢紊乱，最终导致奶牛亚急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis, SARA)[4]。国内外研究人员对SARA的生理机制开展了大量的研究。汪艳[5]的研究发现，高精料饲喂奶牛会导致瘤胃蠕动变弱、渗透压升高，致使干物质采食量(dry matter intake, DMI)降低和营养摄入不足，进一步影响奶牛生产性能。Ma等[6]发现，饲喂高精料饲粮会导致奶牛的乳脂率显著降低；Malekkhahi等[7]也发现SARA引起奶牛的产奶量显著下降。除了影响生产性能，SARA还会导致奶牛代谢发生变化并诱发蹄叶炎等疾病。蹄叶炎可使奶牛被淘汰的风险增加，是导致奶牛产业经济损失的主要原因之一[8]。在SARA状态下，奶牛还会出现腹泻，主要因为饲喂大量精料时部分可发酵底物会通过瘤胃进入肠道进行发酵，肠道微生物群落会受到影响，继而影响肠道功能和机体健康[9]。SARA会导致奶牛采食量、产奶量和乳脂率降低，使得腹泻和蹄叶炎发病率增加[10]。因此，有必要开展相关研究，探索SARA对奶牛肠道微生物群落的影响及其有效的调控措施。

为了解决SARA对奶牛生产带来负面影响的问题，本研究添加维生素E (vitamin E, VE)调控SARA。VE别名生育酚，是一种脂溶性维生素，具有强抗氧化能力和强化机体免疫功能等作用，对阻止低密度脂蛋白氧化和防止动脉粥样硬化起主要作用[11]。研究表明，VE作为饲料添加剂可以增强奶牛机体抗氧化能力和免疫力，并提高生产能力[12]。张德广[13]发现，在高精料日粮中添加100 IU/kg VE，可以降低肉牛瘤胃和血浆中脂多糖和其他炎性因子的含量。Bell等[14]的研究发现，在日粮中同时添加油料和VE可以提高牛奶中乳脂的含量。Moghimi-Kandelousi等[15]通过在日粮中添加VE，可以在一定程度上增加细胞丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，提高抗氧化酶活性，提升奶牛瘤胃和机体的抗氧化能力，降低炎性反应。李云飞[16]和曲扬华[17]的研究结果表明，VE调控后能够提高奶牛DMI。高精料诱导的SARA会降低奶牛的产奶量和乳脂产量，而VE调控则会提高产奶量和乳脂率[18]。另外，VE对肠道屏障结构蛋白具有保护作用，能够上调肠道黏膜和十二指肠肠道组织中的紧密连接蛋白的表达[19]。孙岳丞等[20]发现，VE对受辛硫磷毒性损伤的小鼠肠道具有一定的改善作用。

根据以上研究，假设高精料日粮诱导SARA后奶牛肠道微生物群落会受到损害，日粮添加VE有助于调节肠道微生物群组成，减缓SARA对奶牛肠道健康的损害。本研究的目的是探索高精料诱导发生SARA及添加VE对奶牛粪便中微生物群落的影响，以更好地了解与SARA相关肠道微生物群落的变化。

1 材料与方法

本研究中所有实验程序都得到了华南农业大学动物实验委员会的批准(编号：2020G012)。

1.1 试验动物和饲养管理

试验选用7头装有瘤胃瘘管的经产荷斯坦奶牛[泌乳天数为(63±12) d，体重为(611±26) kg]。试验分为3期，每期18 d。每期的前3 d逐步替换日粮，以使奶牛适应新的日粮。第1期为对照期(CON)，日粮精粗比为50:50 [干物质基础(dry matter basis, DM基础)]；第2期为诱导期(HG)，用细粉碎小麦(过1.5 mm筛网)替代粗饲料，日粮精粗比为65:35 (DM基础)；第3期为调控期(HGE期)，在诱导期日粮基础上添加VE (添加量：12 000 IU/(d·头)；上海健荷牧业科技有限公司)。试验在广东省肇庆市某奶牛场进行，试验牛单栏饲养(2.5 m×2.5 m)，地面装有橡胶垫。饲粮以全混合日粮(total mixed ration, TMR)形式饲喂，自由采食和饮水。每日挤奶(06:30和17:30)和饲喂(07:00和18:00) 2次。TMR组成及营养水平见表 1。

表 1. 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础，%) Table 1. Composition and nutrient levels of experiment diets (dry matter basis, %)
Items CON HG HGE
Ingredients
Whole corn silage 24.32 16.78 16.78
Alfalfa hay 13.75 9.69 9.69
Oat hay 11.45 8.32 8.32
Corn 17.00 17.12 17.12
Wheat 0.00 15.19 15.19
Barly 3.00 3.03 3.03
Soybean meal 13.41 13.50 13.50
Whole cotton seed 5.23 5.27 5.27
Wet brewer’s grains 4.93 4.14 4.14
Cane molasses 2.65 2.67 2.67
Rumen bypass fat 0.39 0.40 0.40
Mineral-vitamin premix1) 0.84 0.84 0.84
Calcium hydrogen phosphate 0.36 0.36 0.36
Limestone 1.12 1.13 1.13
Sodium bicarbonate 0.81 0.82 0.82
Potassium chloride 0.07 0.07 0.07
Magnesium oxide 0.31 0.31 0.31
Salt 0.36 0.36 0.36
Nutrient levels2)
NEL (MJ/kg) 6.67 6.97 6.97
Crude protein 16.62 16.63 16.63
Neutral detergent fiber 35.81 29.22 29.22
Acid detergent fiber 22.60 17.41 17.41
Ether extract 4.43 4.25 4.25
Starch 21.97 31.28 31.28
Calcium 0.89 0.82 0.82
Phosphorus 0.39 0.41 0.41
1): Each kilogram of premix contained the following, VA: 1 380 000 IU; VD: 386 400 IU; VE: 9 940 IU; Cu: 2 400 mg; Zn: 20 000 mg; Mn: 15 600 mg; Se: 100 mg; I: 300 mg; Co: 240 mg. 2): Net energy of lactation is a calculated value, while the others are measured value. CON: The control phase; HG: The induction phase; HGE: The regulation phase.
表选项

1.2 样品采集 1.2.1 瘤胃液的采集和pH的测定

每期第18天晨饲前(0 h)和晨饲后3、6、9 h和12 h通过瘤胃瘘管采集瘤胃前、中、后处瘤胃液，将其混合，经高压灭菌的4层纱布过滤后，使用梅特勒-托利多FE28-Standard pH计立即测定pH值并统计采食后12 h内瘤胃pH值低于5.8的时间，以判定高精料日粮是否成功诱导奶牛发生SARA。根据发表的试验结果，7头奶牛均诱导产生了SARA[18]。

1.2.2 粪便的采集

每期第18天晨饲前利用直肠取样法，采集新鲜粪便样品150−200 g，分装于2 mL冻存管中，置于液氮中保存待测。

1.3 样品测序和分析

将样本送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行检测，测序过程如下：使用十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)方法提取样本DNA，并在1%琼脂糖凝胶上检测DNA浓度和纯度，再使用无菌水稀释样本DNA至1 ng/μL。以稀释后的样本为模板，采用带barcode的特异引物341F (5′-CCTAYGG GRBGCASCAG-3′)和806R (5′-GGACTACNNG GGTATCTAAT-3′)对16S rRNA基因V3−V4可变区进行扩增。扩增体系为：30 μL，3 μL缓冲液，15 μL Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs)，上下引物各0.2 µmol/L，10 ng DNA模板，2 μL超纯水。扩增程序如下：98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，对目标条带使用GeneJET Gel Extraction Kit回收试剂盒(Thermo Scientific)回收产物。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒(Illumina)进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用NovaSeq 6000进行上机测序。

测序得到原始数据后，使用FLASH软件对每个样本的序列进行拼接，得到的拼接序列为原始序列数据[21]；使用Trimmomatic软件对拼接后的原始数据过滤处理得到有效数据[22]。基于97%的一致性，对分类操作单元(operational taxonomic units, OTUs)进行聚类，然后对OTUs的序列进行物种分类分析。分析不同组之间共有和特有的OTUs，使用R软件(version 2.15.3)和GraphPad Prism (version 8.0.2)绘图。使用QIIme软件(version 1.9.1)计算Chao1、Shannon、Simpson、Ace和Goods-coverage指数。线性判别分析(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)使用LEfSe软件，设置LDA (linear discriminant analysis) Score的筛选值为4。基于Tax4Fun数据库预测微生物区系的功能。

1.4 数据统计和分析

本研究α多样性指数、粪便微生物群落结构数据、KEGG谱通路相对丰度数据采用SAS (版本9.4，SAS Institute Inc.)进行分析。使用UNIVARIATE程序测试数据的正态性。基于绝对学生化残差值＞3处理异常值。使用GLM程序进行分析。分析模型为：Yijk=μ+Ti+Pj+Ck+εijk，其中Yij是因变量值；μ是总体均值；Ti是日粮i的固定效应(i=1–3)；Pj是试验期j的固定效应(j=1–3)；Ck是试验牛只j的随机效应(j=1–7)；εijk是随机误差。利用Tukey多重比较方法检验各种处理之间的显著差异(P＜0.05)。数据以最小二乘均值表示。

2 结果与分析 2.1 高精料诱导SARA及VE调控对奶牛粪便OTUs的影响

将所有粪便样品在Illumina NovaSeq平台进行16S rRNA基因V3−V4区的高通量测序，经过质控平均得到77 377条有效数据。基于97%的一致性，将序列聚类得到2 036个OTUs，各组共享和特有的OTUs如图 1所示，3期共有1 176个相同的OTUs数，占总数的57.76%。3期的特有OTUs数分别为CON期123个、HG期164个和HGE期169个，所占总数比例分别为6.04%、8.06%和8.30%。3期的OTUs大体一致，表明样品中的主要微生物群相似，并且这些OTUs可能代表试验牛只的核心粪便微生物群。

图 1 高精料诱导和VE调控下奶牛粪便微生物群的韦恩图 Figure 1 Venn diagram of microbiota under high concentrate induction and VE modulation. CON: The control phase; HG: The induction phase; HGE: The regulation (HGE) phase. The same below.
图选项

2.2 高精料诱导SARA及VE调控对奶牛粪便微生物群多样性的影响 2.2.1 粪便微生物群分析

当测序深度小于600 reads时，随着测序深度的增加，OTUs数量变化迅速，物种丰富度持续增加。而当测序深度大于600 reads时，OTUs数量变化曲线趋于平缓，这说明测序深度基本覆盖样品的物种，能够反映粪便微生物区系情况。

2.2.2 粪便微生物群落α多样性指数分析

本研究通过Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和ACE指数对粪便OTUs α多样性进行分析，如图 2所示。3期的覆盖值都在0.99以上，这表明采样数据足以代表不同样品的整个微生物群。与CON期相比，HG期Shannon指数显著降低(P＜0.05)，Chao1指数和ACE指数均有所上升，但差异不显著(P＞0.05)，表明随着高精料诱导，奶牛后肠道微生物的多样性降低，丰富度增加但不显著。与HG期对比，HGE期Shannon指数和Simpson指数升高(P＞0.05)，Chao1指数和ACE指数均有所下降(P＞0.05)。表明VE对奶牛后肠道微生物群具有一定的调控作用。

图 2 高精料诱导的SARA及VE调控对奶牛粪便微生物群α多样性影响 Figure 2 Effect of high concentrate induced SARA and VE regulation on alpha diversity of fecal microbiota in dairy cows. A−D: Box plots of Shannon index, Simpson index, Chao1 index, and ACE index. *: P < 0.05; Each box plot represents the maximum, minimum, median, and interquartile distance.
图选项

2.2.3 粪便微生物群β多样性分析

β多样性分析是对不同样品的微生物群组成进行比较。本研究基于Weighted Unifrac距离进行主坐标分析(primary coordinate analysis, PCoA)，基于Bray-Curtis距离进行无度量多维标定法(non-metric multidimensional scaling, NMDS)统计，如图 3所示。3个试验期的粪便微生物群样本之间存在相互交杂，整体呈现3种不同聚落，说明3期之间的微生物群结构存在差异性。PCoA和NMDS图反映微生物群大致分布情况，多元响应置换分析(multiple response permutation procedure, MRPP)能反映期间生物统计上的差异。由表 2可知，3期的A值均大于0，说明期间的差异均大于期内差异，分期具有意义。与CON期对比，HG期微生物群结构存在显著差异(P＜0.05)。与HG期对比，HGE期微生物群结构差异不显著(P＞0.05)。

图 3 高精料诱导的SARA及VE调控对奶牛粪便微生物群β多样性影响 Figure 3 Effect of high concentrate induced SARA and VE regulation on beta diversity of fecal microbiota in dairy cows. A: PCoA analysis based on Weighted Unifrac distance. B: NMDS analysis based on Bray-Curtis distance.
图选项

表 2. MRPP期间差异分析 Table 2. Analysis of period variance of MRPP
Period A Observed-delta Expected-delta Significance
CON-HG 0.087 0.379 0.415 0.001
HG-HGE 0.004 0.412 0.413 0.345
CON-HGE 0.064 0.357 0.381 0.007
表选项

2.3 高精料诱导SARA及VE调控对奶牛粪便微生物群结构组成的影响

在不同分类水平上对粪便样本进行物种注释，共鉴定出24个门、48个纲、116个目、188个科、377个属和206个种。以下从门和属水平上分别选取相对丰度在前10和前30的微生物群进行分析。基于门水平研究发现(图 4A)，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是各期主要的菌门，是奶牛后肠道的优势菌门。Firmicutes在各期的相对丰度分别为51.81%、54.36%和60.80%；Bacteroidetes在各期的相对丰度分别为38.29%、31.56%和27.51%。相比CON期，HG期的Bacteroidetes相对丰度显著降低(P＜0.05)。除此之外，还鉴定了4种平均相对丰度大于1%的次要菌门，包括放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋菌门(Spirochaetes)和unidentified_bacteria。相比CON期，HG期的Proteobacteria相对丰度显著升高(P＜0.05)，unidentified_bacteria、广古菌门(Euryarchaeota)和脱硫菌门(Desulfobacterota)相对丰度显著降低(P＜0.05)。

图 4 粪便微生物群结构组成 Figure 4 Structural composition of fecal microbiota. A: Structure of fecal microbiota phylum. B: Structure of fecal microbiota genus.
图选项

在属水平上，由图 4B可知，微生物群相对丰度在1%以上的有9个，分别为UCG-005属、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、普雷沃氏菌科UCG-003属(Prevotellaceae_UCG-003)、密螺旋体菌属(Treponema)、拟杆菌属(Bacteroides)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)和另枝菌属(Alistipes)。UCG-005属是各期的优势菌属，相对丰度分别为16.51%、16.05%和20.84%。与CON期对比，HG期的Rikenellaceae_RC9_gut_group和Alistipes相对丰度显著降低(P＜0.05)，布劳特氏菌属(Blautia)相对丰度显著升高(P＜0.05)。与HG期相比，HGE期的Blautia相对丰度显著升高(P＜0.05)。

2.4 高精料诱导SARA及VE调控对奶牛粪便微生物群结构差异性的影响

利用LEfSe分析工具在期与期之间寻找具有统计学差异的生物标识，并在3个期别进行比较分析的基础上绘制图 5。3个处理期共统计出16种差异菌系，分别为3个门、2个纲、3个目、5个科和3个属。其中CON期有7种，HG期有7种，HGE期有2种。3期相对丰度显著差异的菌门分别为Bacteroidota (CON)、Proteobacteria (HG)和Firmicutes (HGE)。3期相对丰度显著差异的菌属分别为Rikenellaceae_RC9_gut_group (CON)、Alistipes (CON)和Succinivibrio (HG)。同时进化分支图可以观察到粪便微生物衍生出多条进化枝，每条进化支上的差异物种如红、绿、蓝三色的圆表示，相同颜色的圆串联成独立的进化支。在3期差异菌系中，除HG组的毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和毛螺菌目(Lachnospirales)归属于HGE期的Firmicutes，其余差异菌系在各处理期之间的进化路线保持一定的独立性。HG期与HGE期的进化路线相互夹杂，表明它们有相近的进化方向，并与CON期存在差异。综上，高精料诱导的SARA及VE调控会改变奶牛后肠道中的环境特征，从而使粪便微生物形成不同的进化方向。

图 5 粪便微生物群结构差异性 Figure 5 Structural variability of fecal microbiota. A: Linear discriminant analysis (LDA) bar graph shows species with LDA score > 4. B: LEfSe evolutionary branching graph.
图选项

2.5 高精料诱导SARA及VE调控后奶牛粪便微生物群变化对机体代谢的影响

在本研究中，为了进一步了解SARA和VE调控如何影响奶牛后肠的微生物群功能，对KEGG谱(2级和3级)的前20条通路进行分析，在分类和重新梳理后，主要改变的KEGG通路如图 6所示。在KEGG 2级，结果显示HG期的“复制与修复(replication and repair)” “翻译(translation)” “核苷酸代谢(nucleotide metabolism)”和“转录(transcription)”通路富集(P＜0.05)，而“碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)” “多糖合成与代谢(glycan biosynthesis and metabolism)” “运输与分解代谢(transport and catabolism)” “酶家族(enzyme families)”和“细胞过程与信号(cellular processes and signaling)”的相对表达量显著降低(P＜0.05)。HGE期中，“信号传导(signal transduction)”和“基因调控(genetic information processing)”的相对表达量显著上升(P＜0.05)，而“glycan biosynthesis and metabolism” “辅助因子与维生素代谢(metabolism of cofactors and vitamins)” “折叠、定位与降解(folding, sorting and degradation)”和“新陈代谢(metabolism)”的相对表达量显著下降(P＜0.05)。

图 6 高精料诱导的SARA及VE调控对奶牛粪便KEGG谱差异分析 Figure 6 Analysis of the difference between high concentrate induced SARA and VE modulation on fecal KEGG profiles of dairy cows. A: KEGG level 2. B: KEGG level 3. *: P < 0.05. A：2级. B：3级
图选项

在KEGG 3级，2条“translation”通路、2条“replication and repair”通路、3条“carbohydrate metabolism”通路、2条“nucleotide metabolism”、“外泌体(exosome)”通路、“ABC转运蛋白(ABC transporters)”通路、“丙氨酸和天冬氨酸代谢(alanine aspartate and glutamate metabolism)”通路、“原核生物的固碳途径(carbon fixation pathways in prokaryotes)”通路和“蛋白酶(peptidases)”通路受到不同处理期的影响。其中，“DNA修复和重组蛋白(DNA repair and recombination proteins)”通路、“转运RNA生物合成(transfer RNA biogenesis)”通路、“嘌呤代谢(purine metabolism)”通路、“嘧啶代謝(pyrimidine metabolism)”通路、“ABC transporters”通路和“氨基酸tRNA生物合成(aminoacyl tRNA biosynthesis)”通路在HG期的相对表达量显著增加(P＜0.05)，而“peptidases”通路、“exosome”通路、“carbon fixation pathways in prokaryotes”通路、“氨基糖和核苷酸糖代谢(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)”通路和“alanine aspartate and glutamate metabolism”通路的相对表达量显著减少(P＜0.05)。在HGE期中，“丙酮酸盐代谢(pyruvate metabolism)”通路、“糖酵解/糖异生(glycolysis/gluconeogenesis)”通路、“染色体及相关蛋白(chromosome and associated proteins)”通路和“carbon fixation pathways in prokaryotes”通路富集(P＜0.05)，而“amino sugar and nucleotide sugar metabolism”通路的相对表达量显著减少(P＜0.05)。

3 讨论 3.1 高精料诱导SARA及VE调控对奶牛粪便微生物群群落多样性的影响

本研究通过α多样性和β多样性评估粪便微生物群群落多样性。α多样性主要包括物种多样性曲线和α多样性指数。稀释曲线反映测序数据量的合理性，当曲线趋于平坦时，表明测序数据量合理[23]。3期的稀释曲线随着测序深度的增加趋于平缓，说明测序深度基本覆盖样品的微生物物种。等级聚类曲线反映物种的丰富度和均匀度，横轴跨度越大表示丰富度越高，曲线越平缓表示物种分布越均匀[24]。3个处理期在横轴方向相互重叠，说明微生物多样性相似；在纵轴方向曲线逐渐平缓，说明物种分布均匀。

α多样性指数主要包括Shannon、Simpson、Chao1和Ace指数，其中Shannon和Simpson指数反映物种多样性，Chao1和Ace指数反映物种丰富度[25]。结果显示，相比CON期，HG期的Shannon指数显著降低，Simpson指数下降但不显著，表明患有SARA的奶牛的粪便微生物群落多样性降低。Petri等[26]的研究表明，患有SARA的西门塔尔奶牛的Shannon和Simpson指数都显著低于健康奶牛，这与本研究结果相似。由于肠黏膜属于单层上皮，简单的结构使得后肠道上皮更容易受到酸性损伤、屏障损伤等影响[27-28]。因此SARA可能使奶牛后肠道损伤，破坏微生物群落环境，继而降低群落多样性。相比HG期，HGE期的Shannon和Simpson指数上升，这表明VE具有恢复肠道微生物群多样性的潜力，可能是由于VE对肠道屏障结构蛋白表达量的上调并不会引起炎症因子的改变[19]，损伤的肠道未能及时修复，因此差异不显著。

β多样性是对不同样本的微生物群落构成进行比较分析。本研究中，根据PCoA和NMDS基于不同降维模式的二维坐标图映射可知，3期坐标相互交错，期内样本距离相近，表明不同试验期之间存在微生物群结构上的差异。MRPP期间差异分析结果进一步证明了相比CON期，HG期微生物区系存在显著区分，而HGE期与HG期相比差异不显著。为了深入探究不同试验期之间的微生物群落结构，进行了相关的分析并进行讨论。

3.2 高精料诱导SARA及VE调控对奶牛粪便微生物群落结构的影响

动物胃肠道经过长期共同进化，形成了细菌、古细菌、真核生物和病毒共存的稳定复杂的微生态环境[29]。本研究16S rRNA基因测序结果表明，在粪便中细菌占据绝对优势地位(＞95%)，而古细菌在总微生物中处于次要地位，因此主要对细微生物群落结构进行分析与讨论。

许多研究报道，高精料导致的SARA会改变奶牛粪便中微生物群落的结构[30-31]。与之前的研究类似，Firmicutes和Bacteroidota是3个处理期粪便中的优势菌门[31-32]，但其他次要菌门在不同期中是不同的。与本研究相似，Mao等[33]的研究发现SARA会降低瘤胃液中的Bacteroidota和Spirochaetota的相对丰度，而本研究中Bacteroidota的相对丰度显著降低，Spirochaetota相对丰度降低但不显著。El Kaoutari等[34]报道了Bacteroidota比Firmicutes更有效地降解结构性碳水化合物，而粪便中Firmicutes与Bacteroidota比例的增加可能不利于奶牛利用膳食纤维。与HG期相比，HGE期Firmicutes和Bacteroidota的相对丰度无显著差异，可能由于VE对肠道屏障的修复减缓SARA对肠道的进一步损伤。本研究中，HG期Proteobacteria的相对丰度相比CON期显著提高。Proteobacteria可以降解葡萄糖等小分子碳水化合物[35]，可能由于日粮组成发生改变，精料的含量提高促进Proteobacteria增殖。Euryarchaeota属于产甲烷菌，负责瘤胃肠道甲烷的合成，其在糖酵解和宿主免疫反应中的作用被广泛讨论[36]。SARA导致Euryarchaeota相对丰度显著下降，可能会降低奶牛机体糖酵解过程和免疫反应，相反，VE能提高Euryarchaeota的相对丰度，但差异不显著。

为了进一步研究微生物群落结构，对属水平展开分析与讨论。本研究中，与CON期相比，HG期Rikenellaceae_RC9_gut_group和Alistipes的相对丰度显著降低。相关研究报道Rikenellaceae_RC9_gut_group在脂质代谢过程起作用[37]。Alistipe可通过调节乙酸的产生来增加脂质代谢[38]，而乙酸是糖异生和脂肪生成过程的信号分子，并作为肠道外周细胞和肝脏的能量来源[39]。因此SARA使Rikenellaceae_RC9_ gut_group和Alistipes的相对丰度显著下调可能不利于脂质代谢，对奶牛机体造成肠道功能紊乱的影响。Blautia是一种专性厌氧菌，能将多糖分解成短链脂肪酸，它在肠道的存在可能支持健康的微生物组成[40]。3期中HGE期Blautia的相对丰度最高，这可能与VE在机体内的代谢产物调节肠道微生物群有关[41]，说明VE有利于提高奶牛肠道健康。为了确定在每期中显著分化的微生物类群，结合LEfSe分析进行了线性判别分析，结果发现Succinivibrio在HG期显著上调，这与Qiu等[42]的试验结果相似，饲喂高谷物组瘤胃中的Succinivibrio的相对丰度显著提高，但最近的研究发现Succinivibrio与饲料效率呈正相关[43]，与肠道健康无关。

3.3 高精料诱导SARA及VE调控后奶牛粪便微生物群变化对机体代谢的影响

本研究使用Tax4Fun探索不同处理期奶牛粪便细菌功能的差异，对差异代表的OTUs进行标准化，并根据已识别的KEGG通路预测它们的基因组贡献。对微生物群功能的预测表明，HG期碳水化合物代谢、多糖合成与代谢和运输与分解代谢等的相对丰度下调，表明SARA使奶牛机体代谢紊乱。与Zhang等[44]的研究相似，饲喂8−10月龄荷斯坦后备牛高精料日粮会降低机体碳水化合物和乙酸代谢。除此之外，HG期ABC transporters的相对丰度上调，氨基糖和核苷酸糖代谢和丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢的相对丰度下调，这些关键功能途径的失调会导致复发性免疫紊乱和组织损伤[45]。

在高精料日粮中添加VE，上调了信号转导、遗传信息处理和染色体和相关蛋白质等通路，这揭示了VE可能通过提高微生物生长繁殖的稳定性，促进肠道健康微生物群增殖，如VE显著提高Blautia的相对丰度，以调节肠道内环境和促进肠道健康，但具体增殖的微生物群和调控的具体过程都有待进一步确认。除此之外，VE的丙酮酸盐代谢和糖酵解/糖异生通路富集。常文露等[46]的研究表明，VE能提高高脂高糖饲喂的大鼠血浆中的己糖激酶和丙酮酸激酶。因此，VE能改善机体氧化应激反应，提高机体对胰岛素的敏感性，从而改善血糖水平[47]。此外，研究表明糖酵解过程丙酮酸通过以不依赖于ATP的方式清除自由基来防止肠道上皮细胞发生凋亡和坏死性凋亡[48]，可见VE对奶牛调控肠道健康和维持肠道稳态具有一定的作用。然而肠道微生物影响机体代谢的具体机制还需要进一步试验探究，如转录组、代谢组和蛋白组学等，以确认诱导SARA和VE调控下肠道微生物在奶牛中的具体功能和作用。

4 结论

综上所述，高精料诱导SARA导致奶牛肠道微生物多样性降低，添加VE具有恢复肠道微生物群多样性的潜力。SARA改变奶牛粪便中微生物群落的结构，门水平上显著降低Bacteroidota和Euryarchaeota的相对丰度，VE能提高Euryarchaeota的相对丰度但差异不显著；属水平上高精料诱导下Rikenellaceae_RC9_ gut_group和Alistipes的相对丰度显著降低，Succinivibrio的相对丰度显著提高，VE显著提高Blautia的相对丰度。功能预测结果发现，SARA导致奶牛机体代谢紊乱，并可能导致奶牛产生复发性免疫紊乱和组织损伤。在VE调控下，能通过促进健康肠道微生物群增殖，调控奶牛肠道健康和维持肠道稳态。

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