微生物学报  2024, Vol. 64 Issue (10): 3853-3868   DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240227.
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20240227
中国科学院微生物研究所,中国微生物学会

文章信息

吴文豪, 郭梓泓, 张家豪, 孙龑鑫, 唐姝, 刘春, 李薇, 江飚, 苏友禄. 2024
WU Wenhao, GUO Zihong, ZHANG Jiahao, SUN Yanxin, TANG Shu, LIU Chun, LI Wei, JIANG Biao, SU Youlu.
猴耳环水提物对水产病原菌的抑菌活性及其机制
Inhibitory activity and mechanism of aqueous extract from Pithecellobium clypearia against aquatic pathogenic bacteria
微生物学报, 64(10): 3853-3868
Acta Microbiologica Sinica, 64(10): 3853-3868

文章历史

收稿日期:2024-04-09
网络出版日期:2024-05-29
猴耳环水提物对水产病原菌的抑菌活性及其机制
吴文豪1 , 郭梓泓1 , 张家豪1 , 孙龑鑫2 , 唐姝3 , 刘春1 , 李薇1 , 江飚1 , 苏友禄1     
1. 仲恺农业工程学院 动物科技学院, 健康养殖创新研究院, 广东 广州 510225;
2. 佛山市西江生物科技有限公司, 广东 佛山 528220;
3. 广东省动物疫病预防控制中心, 广东 广州 510220
摘要:抗菌药物的过度使用导致细菌耐药性和水产品药物残留问题日益严重,寻找抗菌药物替代品成为迫切需求。猴耳环作为一种具有抗菌和抗炎活性的中草药,尚未在水产病害防控中得到充分研究。[目的] 评估猴耳环水提物对水生动物病原菌的抑菌活性,并探究其作用机制,为水产抗菌药物开发提供新思路。[方法] 采用微量肉汤法评估107株水生动物病原菌的耐药性,分析猴耳环水提物的抑菌活性,测定猴耳环水提物处理后的无乳链球菌和副溶血弧菌的胞外K+含量及其超微结构变化。[结果] 107株病原菌对磺胺类药物的耐药率高达67.29%,46.73%的病原菌表现出多重耐药性,其中气单胞菌的耐药性最严重。猴耳环水提物在12.50 mg/mL浓度下对所有病原菌表现出抑制作用,尤其对气单胞菌最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)值低至0.39 mg/mL,并且对同一菌属不同耐药特征的菌株MIC值相近。与原始株相比,水提物对人工诱导舒伯特气单胞菌恩诺沙星耐药株的抑菌效果更显著,原始株和耐药株的MIC分别为0.78 mg/mL和0.20 mg/mL。此外,猴耳环水提物处理后细菌胞外K+浓度显著增加,细菌细胞膜结构受损,提示猴耳环可能通过破坏菌膜结构来发挥其抑菌作用。[结论] 本研究得出了猴耳环对水产病原菌具有一定的体外抑菌效果,在防治水生动物细菌病方面具有进一步研究和开发的巨大潜力。
关键词病原菌    耐药性    猴耳环    体外抑菌    杀菌机制    
Inhibitory activity and mechanism of aqueous extract from Pithecellobium clypearia against aquatic pathogenic bacteria
WU Wenhao1 , GUO Zihong1 , ZHANG Jiahao1 , SUN Yanxin2 , TANG Shu3 , LIU Chun1 , LI Wei1 , JIANG Biao1 , SU Youlu1     
1. Innovative Institute of Animal Healthy Breeding, College of Animal Sciences and Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, Guangdong, China;
2. Foshan Xijiang Biotechnology Co., Ltd., Foshan 528220, Guangdong, China;
3. Guangdong Animal Disease Prevention and Control Center, Guangzhou 510220, Guangdong, China
Abstract: The aquaculture industry has rapidly expanded in recent years in China, whereas it faces the challenge brought by bacterial diseases. Antibacterial agents have been the primary tools to combat these diseases. However, prolonged and haphazard usage of antibacterial agents in aquaculture has exacerbated antimicrobial resistance and led to severe antimicrobial residues. Considering these challenges, scholars worldwide have been exploring natural alternatives, such as Chinese herbal medicines. Among them, Pithecellobium clypearia stands out due to its antibacterial, antiviral, and anti-inflammatory properties, coupled with its safety and lack of antimicrobial resistance. Nonetheless, the potential of P. clypearia in the prevention and control of aquatic diseases remains underexplored. [Objective] This study evaluated the in vitro inhibitory activity of P. clypearia aqueous extract against aquatic pathogenic bacteria, including an artificially induced antimicrobial-resistant strain. Additionally, we investigated changes in bacterial cell membrane permeability and observed cellular alterations by transmission electron microscopy to elucidate the mechanism of the extract. Our findings are expected to pave the way for developing P. clypearia as an environmentally friendly antibacterial agent, reducing antibacterial agent dependency, and mitigating pathogen resistance in aquaculture. [Methods] We employed the microbroth method to assess the antimicrobial resistance of 107 pathogen strains attacking aquatic animals and analyzed the inhibitory activity of P. clypearia aqueous extract against aquatic pathogenic bacteria, including an artificially induced antimicrobial-resistant bacterial strain. Furthermore, we determined the extracellular K+ content and ultrastructural changes in Streptococcus agalactiae and Vibrio parahaemolyticus after treatment with the extract. [Results] The resistance rate of 107 pathogen strains to sulfonamides was as high as 67.29%, and 46.73% of the strains showed multidrug resistance, among which Aeromonas sp. showed the most severe resistance. The aqueous extract (12.50 mg/mL) of P. clypearia exerted inhibitory effects on all the pathogenic bacteria, especially on Aeromonas sp. with the minimum inhibitory concentration (MIC) as low as 0.39 mg/mL. The MICs of the extract were similar for the strains belonging to the same genus but with different antimicrobial resistance characteristics. The aqueous extract of P. clypearia showed stronger inhibitory effect on the artificially induced enrofloxacin-resistant strain of A. schubertii than on the original strain, with the MICs of 0.78 mg/mL on the original strain and 0.20 mg/mL on the resistant strain. In addition, the treatment with P. clypearia aqueous extract significantly increased the extracellular K+ concentration, leading to damage to the bacterial cell membrane structure, leakage of intracellular contents, and vacuolation of cytoplasm, which suggested that P. clypearia exerted the antibacterial effect by destroying the bacterial membrane structure. [Conclusion] P. clypearia exerts in vitro inhibitory effects on aquatic pathogenic bacteria and demonstrates great potential for further research and development in the prevention and treatment of bacterial diseases in aquatic animals. The antibacterial mechanism of P. clypearia appears to involve disrupting bacterial cell membranes. The application of P. clypearia in aquaculture promises to reduce antibiotic dependency and pathogen resistance, paving the way for a healthy and sustainable aquaculture industry.
Keywords: pathogenic bacterium    antimicrobial resistance    Pithecellobium clypearia    antibacterial activity in vitro    bactericidal mechanism    

我国是水产养殖大国,水产养殖产量连续多年稳居世界第一[1],2022年水产养殖产量为5 565.46万t,其中,广东省贡献显著,养殖产量占比13.79%,成为我国水产养殖的重要省份[2]。然而,随着水产养殖产业的快速发展,养殖户过度追求经济效益,导致养殖密度越来越高,进而引发水产养殖水质严重富营养化,这种环境变化为病原体繁殖提供了条件。病原体的大量繁殖和疾病发病率的上升,已成为制约水产养殖业可持续发展的主要因素之一[3-4]。根据《2023中国水生动物卫生状况报告》统计,仅2022年,水产养殖业因病害造成的经济损失高达517亿元人民币[5]

细菌性病害是水产养殖业的一大挑战,不仅对水生动物的健康和生长构成威胁,还导致了严重的食品安全问题和巨大的经济损失。目前,抗菌药物仍是应对细菌性疾病的主要手段[6-10],然而,由于抗菌药物在水产养殖中长期存在大量不规范的使用情况,这不仅加剧了细菌耐药性,还引发了严重的药物残留问题[11]。细菌耐药性的不断增强使得水产养殖中的疾病治疗变得困难,病死率和治疗成本也随之攀升[12-13]。当面对病害时,养殖户只能不断加大抗菌药物剂量或多种抗菌药物联用,甚至违规使用非水产用抗菌药物。这种做法进一步加剧了细菌耐药性和食品安全问题。为了遏制抗菌药物滥用,国家相继出台了一系列政策措施,旨在规范和指导养殖户精准用药,减量用药。与此同时,科研人员也在探索针对细菌耐药性的新药研发策略,包括理解耐药机制和开发新的抗菌药物[14]

面对细菌耐药性的挑战,国内外学者更加关注中草药这一天然资源[15-16]。大多数中草药都具有广谱抗菌等作用,对病原菌有一定的抑菌能力,我国中草药资源丰富,种类繁多,相关研究表明中草药中含有多种生物活性物质(如生物碱、有机酸、萜类、氨基酸、多糖和甙类等)。这些物质不仅具有抗病原菌作用,还能调节免疫等多种药理功效,而且不易引发病原菌产生耐药性[17]。在农业农村部2022年颁布的水产养殖用药明白纸中[18],已有多种中药材和中成药在水产养殖中获批使用,如大黄、三黄散和黄连解毒散等。在我国不断推进水产养殖绿色可持续高质量发展和减少养殖抗菌药物使用大环境下,由于中草药的天然性和低耐药性风险,在解决细菌耐药性问题方面展现了巨大的潜力和广阔的应用前景[19]

猴耳环(Pithecellobium clypearia)是豆科常绿乔木,主要分布在我国华南地区、缅甸、越南、马来西亚等[20-21]。据报道猴耳环叶、皮中富含没食子酸、槲皮素、黄酮等主要成分[22],具有抗病毒、抗炎活性,因此在传统医学和现代临床实践中,猴耳环常被作为治疗上呼吸道感染、咽炎、喉炎、急性扁桃体炎、急性胃肠炎和细菌性痢疾的处方药[23-24]。近年来的研究表明猴耳环对多种病原菌具有抑制作用,覃旭[25]发现猴耳环提取物对柑橘溃疡病病原菌的菌落生长及其生长量均具有较强的抑制作用。李超[26]进一步研究发现,猴耳环提取液对常见的金色葡萄球菌、大肠杆菌及沙门氏杆菌均有较强的抑杀作用。Liu等[27]证实,猴耳环提取物对鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌具有抑菌活性,而且在与抗菌药物联用时存在协同作用。Liu等[28]研究团队还发现,猴耳环提取物可以抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的生长,并降低临床分离株对抗菌药物的耐药性。尽管猴耳环在多个领域的应用已广受关注,但在水产养殖中的研究尚未见报道,因此,探究猴耳环对水生动物病原菌的作用效果和机制,对开发中草药防治水生动物疾病可提供重要参考数据。

本研究以猴耳环为研究对象,研究猴耳环水提物对水产养殖中多种病原菌和人工诱导获得的耐药菌株的体外抑菌活性,并通过细胞膜通透性变化和透射电镜进一步观察了猴耳环水提物对病原菌作用后的细菌细胞状态,初步分析其作用机制。本研究结果以期为猴耳环作为水产养殖绿色抗菌药物的开发提供新的参考,以减少对抗菌药物的依赖和病原菌耐药性的发生,使水产养殖业向更加健康、可持续的方向发展。

1 材料与方法 1.1 菌株来源

实验所用的菌株为仲恺农业工程学院水产病害课题组和广东省动物疫病预防控制中心在2023年从广东省内水产养殖场分离所得,共107株,通过对其进行16S rRNA基因鉴定,得到气单胞菌属44株,链球菌属34株,弧菌属15株,爱德华氏菌属7株,诺卡氏菌属7株,保种于–80 ℃冰箱,菌株详细信息见表 1

表 1. 病原菌来源情况表 Table 1. The origin of pathogenic bacteria
Genus Region Host Number of bacterial (strains)
Aeromonas sp. Foshan, Zhongshan, Zhaoqing Hybrid snakehead, Micropterus salmoides, Pelteobagrus fulvidraco, Grass carp, Oxyeleotris marmorata 44
Streptococcus sp. Guangzhou, Foshan, Zhaoqing Hybrid snakehead, P. fulvidraco, O. marmorata, Lithobates catesbeiana 34
Vibrio sp. Foshan, Yangjiang, Zhaoqing P. fulvidraco, Trachinotus ovatus, Scatophagus argus, Epinephelus spp. 15
Edwardsiella sp. Foshan M. salmoides 7
Nocardia sp. Foshan Hybrid snakehead, M. salmoides 7

1.2 实验药物及主要试剂

猴耳环干燥叶片(产地广东惠州,人工种植采摘后由机器烘干处理),莱泰农业(惠州)有限公司;脑心浸出液肉汤(brain heart infusion broth, BHI)和水解酪蛋白胨肉汤(mueller hinton broth, MH),北京陆桥技术股份有限公司;琼脂粉(agar),BioFroxx公司;马血清,北京索莱宝科技有限公司;清蛋白葡萄糖过氧化氢酶添加剂(oleic albumin dextrose catalase, OADC),青岛海博生物技术有限公司;需氧菌药敏检测板,复星诊断科技(上海)有限公司;96孔细胞培养板,广州洁特生物过滤股份有限公司;钾(K+)测试盒,南京建成生物工程研究所;Gluta电镜固定液,福州飞净生物科技有限公司;刃天青指示剂,上海源叶生物科技有限公司;血琼脂平板,广州市迪景微生物科技有限公司。

1.3 猴耳环水提物制备

首先将猴耳环叶放入烘箱中37 ℃烘干24 h,除去残余水分,完全干燥后放入粉碎机粉碎,用80目筛去除未能粉碎的物质,过筛后获得猴耳环粉末。准确称量100 g猴耳环粉末,去离子水1 L,加入在锥形瓶中,先混匀浸泡12 h后,武火煮沸转文火煮30 min,反复煎煮2次后,收集药液,药渣中加水收集残留药液,最终定容至1.0 L,此时猴耳环水提液浓度为100 mg/mL,121 ℃灭菌15 min,冷却后进行4 ℃、8 000 r/min离心15 min,取上清液于4 ℃冰箱中保存。

1.4 实验菌株菌液制备

将前期分离鉴定保种的病原菌从–80 ℃冰箱中取出,使用BHI琼脂平板进行复苏,28 ℃培养24 h,培养完成后挑取长势良好的单菌落于新的BHI琼脂平板(链球菌和诺卡氏菌使用血琼脂平板)中进行划线复壮,继续28 ℃培养24 h,挑取复壮后的菌落3−5个,置于2−3 mL灭菌生理盐水中,用麦氏比浊仪进行比浊,调整菌液浓度为0.5麦氏单位浓度(1.5×108 CFU/mL)。

1.5 抗菌药物对病原菌的最小抑菌浓度(MIC)测定

在进行药敏实验前,采用标准菌株大肠杆菌ATCC 25922对药敏板进行质控。这些药敏板分别包含多种抗菌药物,具体为恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、多西环素、氟甲喹、磺胺间甲氧嘧啶钠以及甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。

取1.4节制备的菌液60 µL,滴入无菌加样槽中,加MH肉汤培养液(12 mL),充分混匀(链球菌试验需要额外添加马血清600 µL,诺卡氏菌试验额外添加OADC增菌液600 µL)。用微量移液器吸取稀释菌液100 µL,加入药敏板(药物浓度见表 2)中除阴性对照孔以外的95个孔,阴性对照孔加无菌MH肉汤培养液100 µL,28 ℃培养16–24 h后,观察实验结果,参照NCCLS抗菌药物敏感性试验解释标准记录MIC值。

表 2. 药敏检测板浓度梯度表 Table 2. The concentration gradient table of drug sensitivity detection plate (μg/mL)
Antibacterial agents 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Enrofloxacin 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.06 0.03 0.015
Neomycin sulfate 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125
Thiamphenicol 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25
Florfenicol 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25
Doxycycline 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.062 5
Flumequine 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125
Sulfamonomethoxine sodium 1 024 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 Positive control
Trimethoprim/Sulfamethoxazole 64/1 216 32/608 16/304 8/152 4/76 2/38 1/19 0.5/9.5 0.25/4.8 0.125/2.4 0.06/1.2 Negative control

1.6 水产主要病原菌敏感性判定转折点

参考CLSI药敏标准(M45、M100、VET02)和欧盟药敏标准EUCAST,实验用8种抗菌药物耐药性判定折点结果见表 3,其中链球菌仅有多西环素和复方磺胺甲噁唑2种抗菌药物有明确的药敏判定标准,气单胞菌、爱德华氏菌和弧菌除氟甲喹外的7种抗菌药物均有明确的耐药性判定标准。

表 3. 病原菌抗菌药物耐药性折点 Table 3. The break point of antibacterial agents resistance of pathogenic bacteria (μg/mL)
Antibacterial agents Aeromonas sp., Edwardsiella sp., Vibrio sp. Streptococcus sp.
S I R S I R
Enrofloxacin ≤0.5 1−2 ≥4
Neomycin sulfate ≤4 8 ≥16
Thiamphenicol ≤8 ≥16
Florfenicol ≤2 4 ≥8
Doxycycline ≤4 8 ≥16 ≤1 ≥2
Flumequine
Sulfamonomethoxine sodium ≤256 ≥512
Trimethoprim/Sulfamethoxazole ≤2/38 ≥4/76 ≤1/19 ≥2/38
S:敏感;I:中介;R耐药;−:无对应药物的耐药折点
S: Sensitivity; I: Intermediary; R: Resistance; −: The resistance break point for no corresponding drug.

1.7 猴耳环水提物对病原菌的最小抑菌浓度(MIC)测定

使用二倍稀释法在无菌96孔板上对猴耳环水提物进行依次稀释,在每行第一孔中加入猴耳环水提物200 µL,其余孔中分别加入MH肉汤培养液100 µL,然后再逐次倍比稀释至第10列(每孔液体终体积是100 μL),最后猴耳环水提物浓度变为原始浓度的1/2、1/4、1/8······1/1 024。取1.4节制备的菌液60 µL,滴入无菌加样槽中,加MH肉汤培养液(12 mL),充分混匀。使用微量移液器在除第11列的阴性对照孔中全部加入稀释菌液100 µL,阴性对照添加无菌MH肉汤培养液100 µL,每孔液体终体积为200 μL,28 ℃培养16–24 h后,参照NCCLS抗菌药物敏感性试验解释标准记录MIC值。

1.8 猴耳环水提物对病原菌的抑菌圈测定

使用特异性引物或者gyrB基因在1.1节属水平基础上进行定种,挑选9株不同菌种的病原菌,分别为舒伯特气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、杀鱼爱德华氏菌、副溶血弧菌、海豚链球菌、无乳链球菌和鰤鱼诺卡氏菌,采用牛津杯法测定猴耳环水提物的抑菌圈大小,按照1.4节的方法制备菌液,然后稀释10倍(1.5×107 CFU/mL),取100 μL均匀涂布于MH琼脂平板,放置上孔内径为6 mm的无菌牛津杯,每个平板内放置4个牛津杯,其中3孔为试验组生物学重复,每个试验孔内加入100 μL猴耳环水提物,第4孔为阴性对照,内为无菌水。将平板正置于恒温培养箱内,28 ℃培养12 h。选取3个不同角度测量抑菌圈直径大小。

1.9 猴耳环水提物对耐药菌株的抑菌效果测定

舒伯特气单胞菌耐药菌株来自水产病害课题组,前期采用不断提高浓度的恩诺沙星诱导并保存,恩诺沙星对其的MIC由诱导前0.015 μg/mL变为诱导后32 μg/mL。采用纸片法测定猴耳环对舒伯特气单胞菌耐药菌株的抑菌效果,将耐药菌株和敏感菌株按照1.4节的方法进行制备,然后稀释10倍后(1.5×107 CFU/mL)取100 μL均匀涂布于MH琼脂平板,放置直径为6 mm的无菌空白药敏纸片,然后往其中滴加10 μL猴耳环水提物,每个平板内放置3个生物学重复,阳性对照使用恩诺沙星药敏片(10 μg/tablet) (原始株对恩诺沙星敏感而耐药株对恩诺沙星耐药,可以直观地展现出它们对恩诺沙星敏感性)。将平板正置于恒温培养箱内,28 ℃培养12 h。选取3个不同角度测量抑菌圈直径大小。

采用二倍稀释法测定猴耳环水提物对舒伯特气单胞菌原始株和耐药株的MIC,操作同1.7节所述。在培养12 h后,往孔内加入10 μL刃天青指示剂,然后再继续培养2 h进行结果观察。刃天青指示剂颜色变化可判断药物的抑菌效果,刃天青的减少与细菌数量的增加存在直接关系,在有细菌存在的时候,加入刃天青的孔会由蓝紫色变为粉红色甚至无色,若加入的物质存在杀菌效果,则不会改变其颜色[29]

1.10 猴耳环水提物对细菌细胞膜通透性影响的测定

挑选革兰氏阳性菌无乳链球菌(FS23091905as)和革兰氏阴性菌副溶血弧菌(YJ2307004),分别与终浓度为其对应的MIC的猴耳环水提物共培养24 h。将培养后的菌液4 ℃、4 000 r/min离心15 min,得到上清液,使用钾测试盒测定细菌胞外的K+浓度。

1.11 透射电镜观察猴耳环水提物杀菌机制

实验菌株同1.10节,分别与终浓度为其对应MIC的猴耳环水提物共培养6 h (较短时间的培养可得到细菌介于未破坏和完全破坏之间的状态)。将培养后的菌液4 ℃、5 000 r/min离心10 min,弃上清培养基后加入电镜固定液,将菌体吹散悬浮于固定液内,4 ℃避光固定过夜。样品后期按顺序进行的漂洗、固定、漂洗、脱水、浸透、包埋及超薄切片,均在中山大学生命科学学院透射电镜研究室进行。

1.12 数据分析

使用GraphPad Prism 9和Adobe Photoshop 2023软件进行图片处理,SPSS 26软件进行单因素方差分析数据显著性差异,数据为平均值±标准差表示,P < 0.05差异有统计学意义。

2 结果与分析 2.1 抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)测定结果

对107株病原菌进行8种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)测定,结果显示不同菌株的药物敏感性差异较大。5个菌属的病原菌均对磺胺间甲氧嘧啶钠和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑表现出较高的耐药性。气单胞菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、多西环素、磺胺间甲氧嘧啶钠和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐药率高于其他病原菌,分别为38.63%、11.36%、54.55%、50.00%、20.45%、93.18%和65.90%。爱德华氏菌和诺卡氏菌对甲砜霉素的耐药率高达100.00%,表现出了完全耐药。弧菌对除磺胺间甲氧嘧啶钠外的其他几类抗菌药物均较敏感。链球菌无恩诺沙星、硫酸新霉素等5种抗菌药物的耐药折点,无法计算耐药率(表 4)。

表 4. 病原菌对不同抗菌药物的耐药率 Table 4. The resistance rate of pathogenic bacteria to different antibacterial agents (%)
Antibacterial agents Aeromonas sp.(n=44) Vibrio sp.(n=15) Edwardsiella sp.(n=7) Streptococcus sp.(n=34) Nocardia sp.(n=7)
Enrofloxacin 38.63 0.00 14.29 0.00
Neomycin sulfate 11.36 0.00 0.00 0.00
Thiamphenicol 54.55 6.67 100.00 100.00
Florfenicol 50.00 6.67 0.00 14.29
Doxycycline 20.45 0.00 0.00 11.76 0.00
Sulfamonomethoxine sodium 93.18 60.00 85.71 28.57
Trimethoprim/Sulfamethoxazole 65.90 6.67 0.00 32.35 14.29
−:无对应药物的耐药折点;n:菌株数量;诺卡氏菌属参考气单胞菌属的耐药折点
−: The resistance break point for no corresponding drug; n: Number of strains; The resistance break point for Nocardia sp. is based on that of Aeromonas sp.

将107株病原菌进行多重耐药性分析,2023年广东省主要水产养殖区水产动物107株病原菌中有78株菌株出现耐药情况,占比72.90%,共表现出21种耐药谱,其中44株气单胞菌均表现出耐药特征,占比56.41%。耐药谱结果表明,单独耐药类型有3种共28株,双重耐药有6种共20株,三重耐药有4种共8株,四重耐药有3种共7株,五重耐药有3种共12株,六重耐药1种共2株,七重耐药1种共1株,其中对磺胺间甲氧嘧啶钠和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的单独耐药率最高为13.08% (14/107)和9.35% (10/107),耐药最严重的一株菌株为嗜水气单胞菌,对7种抗菌药物均表出耐药特征(表 5)。

表 5. 病原菌多重耐药情况 Table 5. The multiple drug resistance of pathogenic bacteria
Drug resistance spectrum Number of strains Percentage (%) Drug resistance spectrum Number of strains Percentage (%)
SMM 14 13.08 FFC+SMM+SXT 1 0.93
SXT 10 9.35 ENR+THI+SMM 1 0.93
THI 4 3.74 THI+FFC+SMM+SXT 5 4.67
THI+SMM 9 8.41 THI+FFC+DOX+SMM 1 0.93
DOX+SXT 4 3.74 ENR+DOX+SMM+SXT 1 0.93
ENR+SMM 3 2.80 THI+FFC+DOX+SMM+SXT 3 2.80
SMM+SXT 2 1.87 ENR+THI+FFC+SMM+SXT 8 7.48
ENR+THI 1 0.93 ENR+THI+FFC+SMM+SXT 1 0.93
THI+FFC 1 0.93 ENR+THI+FFC+DOX+SMM+SXT 2 1.87
NEO+SMM+SXT 3 2.80 ENR+NEO+THI+FFC+DOX+SMM+SXT 1 0.93
THI+FFC+SMM 3 2.80
ENR:恩诺沙星;NEO:硫酸新霉素;THI:甲砜霉素;FFC:氟苯尼考;DOC:多西环素;SMM:磺胺间甲氧嘧啶钠;SXT:甲氧苄啶/磺胺甲噁唑
ENR: Enrofloxacin; NEO: Neomycin sulfate; THI: Thiamphenicol; FFC: Florfenicol; DOC: Doxycycline; SMM: Sulfamonomethoxine sodium; SXT: Trimethoprim/Sulfamethoxazole.

2.2 猴耳环水提物的最小抑菌浓度(MIC)测定结果

猴耳环水提液的最低抑菌浓度(MIC)测定试验发现,其对107株病原菌均具有抑菌效果,而且同一菌属的MIC相近。气单胞菌属的MIC分布在0.78−3.12 mg/mL,链球菌属的MIC分布在6.25−12.50 mg/mL,弧菌属的MIC分布在1.56−6.25 mg/mL,爱德华氏菌属的MIC分布在3.12−6.25 mg/mL,诺卡氏菌属的MIC均为6.25 mg/mL (表 6)。猴耳环水提液对各类病原菌的MIC50为6.25 mg/mL,MIC90为12.50 mg/mL。

表 6. 病原菌在不同猴耳环水提物浓度下MIC的菌株数 Table 6. The number of strains with MIC of pathogenic bacteria at different concentrations of water extracts from Pithecellobium clypearia
Concentrations (mg/mL) Aeromonas sp. Vibrio sp. Edwardsiella sp. Streptococcus sp. Nocardia sp.
12.50 2 14
6.25 5 6 5 20 7
3.12 22 6 2
1.56 4 3
0.78 10
0.39 1
−:在该药物浓度下无相应菌株
−: There is no corresponding strain at this drug concentration.

2.3 猴耳环水提物对病原菌的抑菌圈测定

从猴耳环水提液对病原菌的MIC测定结果中,挑选9株不同种类的病原菌,采用牛津杯扩散法进行了抑菌试验,结果显示,猴耳环水提物对挑选的菌株均表现出体外抑菌活性(图 1),抑菌圈测定结果为舒伯特气单胞菌(29.94±0.35) mm、嗜水气单胞菌(21.02±0.73) mm、海豚链球菌(19.33±0.09) mm、迟缓爱德华氏菌(19.12±0.06) mm、维氏气单胞菌(17.36±0.44) mm、鰤鱼诺卡氏菌(16.43±0.50) mm、杀鱼爱德华氏菌(15.32±0.18) mm、无乳链球菌(14.68±0.41) mm和副溶血弧菌(14.66±0.47) mm (图 2)。

图 1 猴耳环水提物牛津杯法抑菌试验结果 Figure 1 The antibacterial test results of water extract of Pithecellobium clypearia using Oxford cup method. A: Aeromonas schubertii. B: Aeromonas hydrophila. C: Streptococcus iniae. D: Edwardsiella tarda. E: Aeromonas veronii. F: Nocardia seriolae. G: Edwardsiella piscicida. H: Streptococcus agalactiae. I: Vibrio parahaemolyticus.

图 2 猴耳环水提物抑菌作用的比较分析 Figure 2 The comparative analysis of antibacterial effects of water extracts from Pithecellobium clypearia. 1: Aeromonas schubertii; 2: Aeromonas hydrophila; 3: Streptococcus iniae; 4: Edwardsiella tarda; 5: Aeromonas veronii; 6: Nocardia seriolae; 7: Edwardsiella piscicida; 8: Streptococcus agalactiae; 9: Vibrio parahaemolyticus. Different letters indicate statistically significant differences (P < 0.05). 1:舒伯特气单胞菌;2:嗜水气单胞菌;3:海豚链球菌;4:迟缓爱德华氏菌;5:维氏气单胞菌;6:鰤鱼诺卡氏菌;7:杀鱼爱德华氏菌;8:无乳链球菌;9:副溶血弧菌. 不同字母表示差异有统计学意义(P < 0.05)

2.4 猴耳环水提物对耐药菌株的抑菌效果

通过琼脂扩散法发现,猴耳环水提物对舒伯特气单胞菌原始敏感菌株(WL23S)和其恩诺沙星耐药菌株(WL23R)均具有抑菌效果(图 3),猴耳环水提物对原始敏感菌株和恩诺沙星耐药株的抑菌圈直径分别为(22.76±0.23) mm和(28.34±0.12) mm,猴耳环水提物对恩诺沙星耐药菌株的抑菌效果更为显著(P < 0.05)。微量肉汤稀释法测得猴耳环水提物对原始敏感菌株的MIC为0.78 mg/mL,对恩诺沙星耐药株的MIC为0.20 mg/mL (图 4)。

图 3 猴耳环水提物对恩诺沙星耐药菌株和原始敏感菌株的抑菌效果 Figure 3 The antibacterial effects of water extract from Pithecellobium clypearia on drug-resistant and primitive strains. A: WL23S. B: WL23R. a, b, c: The water extract from P. clypearia; –: Negative control (sterile water); +: Positive control (enrofloxacin).

图 4 猴耳环水提物对恩诺沙星耐药菌株和原始敏感菌株的抑菌效果 Figure 4 The antibacterial effect of water extract from Pithecellobium clypearia on drug-resistant and primitive strains. A: WL23S. B: WL23R. The number is the concentration of water extract from P. clypearia (mg/mL); –: Negative control; +: Positive control.

2.5 细菌胞外钾离子浓度测定结果

无乳链球菌在MIC对应浓度的猴耳环水提物处理后细菌胞外K+的浓度由(9.14±0.11) mmol/L显著增加至(10.49±0.11) mmol/L (P < 0.05),副溶血弧菌在MIC对应浓度的猴耳环水提物处理后细菌胞外K+的浓度由(3.93±0.01) mmol/L显著增加至(6.55±0.38) mmol/L (P < 0.05) (图 5)。

图 5 猴耳环水提物处理后的菌液中钾离子浓度测定 Figure 5 The determination of K+ concentration in bacterial solution after treatment with water extract from Pithecellobium clypearia. A: Streptococcus agalactiae. B: Vibrio parahaemolyticus. *: Indicates significant difference compared to the control group (P < 0.05).

2.6 透射电镜观察

在透射电镜下观察,无乳链球菌呈卵圆形球状细菌,外形饱满,细胞壁及胞膜结构完整,细胞质均匀,状态良好;而猴耳环水提物处理后的无乳链球菌细胞壁完整性破损严重,出现胞膜结构模糊和菌体溶解,细胞内容物外流,严重受损,红色箭头所示。副溶血弧菌形态呈细长的弧形,细胞壁结构完整规则,细胞质均匀,状态良好;而猴耳环水提物处理后菌体变形,细胞膜向胞质内凹陷折叠,细胞质固缩,菌体内出现空腔,细胞受损严重蓝色箭头所示(图 6)。

图 6 猴耳环水提物处理的无乳链球菌和副溶血弧菌的透射电镜图 Figure 6 The transmission electron microscopy images of Streptococcus agalactiae and Vibrio parahaemolyticus treated with water extract from Pithecellobium clypearia. A–B: Represents untreated S. agalactiae. C–D: Represents S. agalactiae treated with P. clypearia. E–F: Represents untreated V. parahaemolyticus. G–H: Represents V. parahaemolyticus treated with P. clypearia.

3 讨论与结论

细菌性病害一直是水产养殖业面临的一大挑战,而抗菌药物则被视为主要的解决策略,然而,随着抗菌药物的不规范使用,耐药性问题日益严重[5-10]。本研究结果显示,2023年广东省内不同地区分离到的不同菌株对8种抗菌药物的耐药率存在一定差异,但整体而言耐药程度均处于较高水平。其中,不同菌株普遍对磺胺类药物表现出耐药性,特别是气单胞菌对两种磺胺类药物的耐药率高达93.18%和65.90%。磺胺类是应用最早的一类人工合成抗菌药物之一,因其高水溶性和广谱抑菌性在水产养殖业中得到广泛应用,其高耐药率的出现可能与养殖场常使用磺胺类药物来治疗细菌性病害的用药习惯有关[30]。此外,磺胺类药物还能诱导菌株耐药基因(ARGs)的表达,ARGs可以通过水平基因转移作用从环境菌株中转移至致病菌,一旦致病菌产生耐药性,控制和治疗细菌性病害会更加困难[31]。气单胞菌是引起水产养殖病害的最常见致病菌之一,抗菌药物的不合理使用、革兰氏阴性菌不对称双层外膜的特点以及耐药基因的传播,导致气单胞菌耐药问题突出,许多研究表明从水生动物中分离的气单胞菌具有耐药现象普遍、耐药谱广和耐药率高的特点[32-34]。本研究从病原菌数量和整体耐药情况也得出了同样的结果,分离数量最多的气单胞菌表现出了最高耐药率,其多重耐药情况也最为严重,占多重耐药菌的56.41%,其中一株嗜水气单胞菌表现出了七重耐药特征,几乎对水产用药明白纸上的抗菌药物完全耐药。因此,可见水产养殖中耐药细菌的广泛流行,迫切需要开发新型环境友好的治疗方法。

中草药因具有易分解、残留少、价格低廉和不易产生耐药性等特点,已成为水产养殖中细菌性病害防控的有力替代方案[35-39]。猴耳环作为一种天然药物,凭借其抗菌、抗病毒和抗炎活性备受瞩目[24, 27-28, 40-42]。本研究发现,当猴耳环水提物浓度为12.50 mg/mL时,对全部107株实验菌株均显示出较好的抑制作用,对气单胞菌的抑菌效果尤为突出,其MIC低至0.39 mg/mL。与其他研究相比,高晓华等[43]发现40种中草药对美洲鲥源温和气单胞菌的体外抑菌MIC范围为7.81−31.25 mg/mL,以及王宝屯等[44]报道的76味中草药对无乳链球菌体外抑菌MIC范围为3.9−250.0 mg/mL,猴耳环在较低浓度下即展现出对不同菌属病原菌的优异抑菌效果。这表明猴耳环在水产养殖细菌性病害防控方面具有巨大的开发潜力,有望为水产绿色抗菌药物的开发提供新的参考。

耐药性使细菌对抗菌药物的敏感性降低或丧失,常规治疗剂量的抗菌药物无法有效抑制或杀灭细菌,从而导致治疗失败和感染持续[45]。本研究发现猴耳环水提物对107株具有不同耐药特征的病原菌均具有抑菌效果,对同一菌种中不同耐药性的菌株抑菌效果相近。进一步评估了猴耳环水提物对人工诱导的舒伯特气单胞菌恩诺沙星耐药株的抑菌效果,结果显示猴耳环水提物对耐抗菌药物菌株具有良好的抑菌效果,猴耳环水提物对耐药菌株(MIC为0.20 mg/mL)的抑菌效果优于对应的原始敏感菌株(MIC为0.78 mg/mL)。这一发现与Liu等[27]的研究结果相似,该研究也观察到猴耳环提取物对临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌具有显著抑菌作用。多项研究表明恩诺沙星耐药菌株的耐药机制与外排泵作用相关,这些耐药细菌能够通过外排系统,将抗菌药物排出细胞外,从而阻止药物在细菌内累积,达到有效的抑菌浓度[46-48]。基于以上研究,我们推测猴耳环的杀菌机制可能不受菌株耐药机制的影响,耐药菌株的外排系统无法将猴耳环水提物排出胞外,从而具有较好的抑菌效果。深入开展中草药猴耳环的研究,有望为抗耐药细菌的治疗提供新思路和方法。

多项研究发现,中草药主要通过破坏细菌细胞膜结构起到杀菌抑菌效果[15, 27-28, 48-49]。本研究也发现类似结果,并且发现猴耳环水提物对革兰氏阴性菌的抑制效果明显优于革兰氏阳性菌,这可能是由于两类菌株的外膜结构差异所致。革兰氏阳性菌具有较厚的由肽聚糖组成的细胞壁[50],因此其对猴耳环的抵抗能力较强。进一步的研究发现,经猴耳环水提物处理后,细菌胞外K+浓度显著增加,这反映了细胞成分的渗漏和细胞膜的损伤,从而增加细胞通透性,导致胞内K+外流。这一结果与Liu等[28]的研究相吻合,他们观察到猴耳环提取物能够破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜结构,从而促进了K+的外流。此外,本研究还通过透射电镜观察发现,猴耳环水提物处理后的细菌形态和细胞膜结构遭到破坏,随后导致细胞收缩和细胞裂解,内容物流出,最终导致细胞死亡。Liu等[27]也通过透射电镜结果发现,猴耳环提取物通过破坏细菌细胞壁起到杀菌效果。这表明猴耳环主要通过破坏细胞膜和细胞壁的结构,影响细胞的通透性,进而增加胞内K+的外流,最终导致细菌的死亡,说明猴耳环具有杀菌作用。这些发现为我们更深入地理解猴耳环的杀菌抑菌机制提供了重要依据。

综上所述,猴耳环已展现出对不同种类病原菌和耐药株的较好的体外抑菌效果,进一步的研究揭示,其主要通过破坏细胞膜结构导致细菌死亡,从而在防治水生动物细菌性病害方面具有巨大的开发潜力。然而,目前关于猴耳环在水产养殖中的实际应用尚无研究,对其具体的抑菌作用机制研究也不够深入。因此仍需对猴耳环在鱼体内的药物代谢、安全性、副作用以及实际防治效果等多种因素进行全面而细致的评估,以期为其在未来水产养殖中的广泛应用提供坚实的科学依据。

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猴耳环水提物对水产病原菌的抑菌活性及其机制
吴文豪 , 郭梓泓 , 张家豪 , 孙龑鑫 , 唐姝 , 刘春 , 李薇 , 江飚 , 苏友禄