2024, Vol. 64中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 胡紫萌, 陈伟叶, 陈欣仪, 李培, 李敏, 周璐, 杜鸿, 刘玉庆, 张炜, 谈忠鸣. 2024
- HU Zimeng, CHEN Weiye, CHEN Xinyi, LI Pei, LI Min, ZHOU Lu, DU Hong, LIU Yuqing, ZHANG Wei, TAN Zhongming.
- PH826噬菌体与抗生素联用有效抑制多重耐药铜绿假单胞菌生物被膜的形成
- Combination of phage PH826 and antibiotics inhibits biofilm formation of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa
- 微生物学报, 64(2): 473-488
- Acta Microbiologica Sinica, 64(2): 473-488
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文章历史
- 收稿日期：2023-06-23
- 网络出版日期：2023-12-20
引用本文 |
2. 南京农业大学三亚研究所, 海南 三亚 572024;
3. 江苏省疾病预防控制中心急性传染病防制所, 江苏 南京 210009;
4. 苏州大学第二附属医院临床检验科, 江苏 苏州 215004;
5. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所, 山东 济南 250100
2. Sanya Institute of Nanjing Agricultural University, Sanya 572024, Hainan, China;
3. Department of Acute Infectious Disease Prevention and Control, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, Nanjing 210009, Jiangsu, China;
4. Department of Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu, China;
5. Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰氏阴性机会病原体，是引起医院感染最常见的病原体之一[1-2]。铜绿假单胞菌严重影响免疫功能低下的患者，是造成接受化疗的中性粒细胞减少性癌症患者菌血症和败血症的主要原因，在各种皮肤感染中包括糖尿病性溃疡、烧伤伤口、角膜溃疡中也经常出现[3-4]。此外，患有囊性纤维化(cystic fibrosis)的患者通常会慢性感染铜绿假单胞菌，导致这些患者因肺功能衰竭而死亡[5]。
铜绿假单胞菌属于“ESKAPE”病原体，耐药机制通常分为固有性耐药(intrinsic resistance)和获得性耐药(acquired resistance)。铜绿假单胞菌的固有性耐药机制使其对多种抗生素产生耐药性，而获得性耐药机制则包括生物膜和多重耐药滞留菌的形成[6-7]。铜绿假单胞菌是研究生物被膜的模式生物，其生物膜基质主要包括多糖、细胞外DNA (extracellular DNA, eDNA)、蛋白质和脂质，占生物膜总量的90%以上，用以抵抗抗生素以及宿主的免疫反应[8-10]。生物被膜的产生增加了对抗生素、消毒剂、各种放射处理、环境和免疫系统的抗性，使铜绿假单胞菌的防控变得更加不利[11-13]。由于抗生素无法渗透到生物被膜的复杂多糖基质(糖复合物)中，使生物被膜对抗生素的抵抗力大约是浮游细胞的10–1 000倍[14]。
噬菌体是专门感染细菌的病毒，是抗生素的替代治疗策略。与使用广谱抗生素相比，噬菌体疗法具有明显的优势，它对目标细菌病原体具有高度的特异性，不会对宿主及其微生物群产生不利影响[15]。许多文章报道了铜绿假单胞菌、噬菌体和抗生素联合使用可以有效抑制细菌生长和生物被膜的形成[16-19]。例如，de Cássia Oliveira等发现，铜绿假单胞菌与噬菌体共同培养24 h后，与对照组相比，所有的噬菌体可以在生物被膜生长的早期阶段有效降低生物被膜的生长速度。然而，共同培养24 h后，对照组和噬菌体处理组的生物被膜的形成无显著差异[20]。
因此，采用噬菌体尝试治疗由多重耐药铜绿假单胞菌引起的慢性感染和清除其生物被膜是至关重要的。本研究对铜绿假单胞菌进行噬菌体分离，并对其生物学特性、全基因组学进行分析、在体外进行噬菌体抑菌试验和生物被膜生成抑制试验，探讨其可能的应用价值。
1 材料与方法 1.1 细菌菌株和生长条件共选择39株细菌，包括33株铜绿假单胞菌(人源和动物源)、2株鲍曼不动杆菌、2株大肠杆菌和2株肺炎克雷伯菌作为噬菌体PH826宿主谱测定的受试菌。所有菌株在LB液体培养基(g/L，胰蛋白酶10、酵母提取物5和NaCl 10)、LB固体培养基(LB液体培养基+15 g/L琼脂)或LB半固体培养基(LB液体培养基+5 g/L琼脂)中生长。
1.2 噬菌体的分离和纯化噬菌体PH826是以铜绿假单胞菌PA003为宿主菌，从养殖场污水中分离出来的。采用双层琼脂平板法对噬菌体PH826进行增殖和计数[21]。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS) (80 g/L NaCl、2 g/L KCl、35.8 g/L Na2HPO4和2.7 g/L KH2PO4)用于稀释噬菌体。噬菌体液体在4 ℃、5 000×g条件下离心10 min，上清液通过0.22 µm的过滤器(Merck Millipore)过滤并储存在LB冻存液中[22]。
1.3 透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)下的噬菌体形态分析取20 μL噬菌体PH826的原液涂在铜网上。用磷钨酸(phosphotungstic acid, PTA, 2%质量体积分数)干燥后，使用透射电子显微镜(TEM)观察噬菌体形态后拍摄电子显微图片。
1.4 噬菌体的裂解宿主谱的测定采用点滴法对33株铜绿假单胞菌、2株鲍曼不动杆菌、2株大肠杆菌和2株肺炎克雷伯菌进行宿主谱的测定[23]。将10 μL纯化的噬菌体液体(109 PFU/mL)点滴在新接种的细菌菌苔上，待其干燥后在37 ℃下培养12 h[24]。通过观察裂解斑的形成确定是否为宿主细菌。
1.5 一步生长曲线将噬菌体以0.1的感染复数(multiplicity of infection, MOI)比例添加到PA003菌液(OD600为0.4)中，然后将混合物37 ℃、180 r/min振荡10 min。将未吸附的噬菌体用PBS洗涤，4 ℃、5 000×g离心后弃去上清，用10 mL新鲜LB培养液重悬沉淀，在37 ℃摇床中以180 r/min的转速培养。共培养总时长为120 min，每间隔10 min取样后，立即用双层琼脂法测定噬菌体滴度。所有试验均重复3次。
1.6 最佳感染复数(MOI)以铜绿假单胞菌菌株PA003作为PH826的宿主细菌。将PA003培养至对数期(OD600为0.4)，终浓度约为1.5×108 CFU/mL。将噬菌体和细菌以不同的MOI (噬菌体/细菌=10、1、0.1、0.01、0.001)混合，并在37 ℃下孵育10 h。将混合物以5 000×g离心10 min后并稀释上清液，计数噬菌斑用于确定噬菌体的效价。在10 h内产生最高噬菌体滴度的MOI被认为是最佳MOI。所有试验均重复3次。
1.7 温度和pH稳定性PH826的热稳定性和pH稳定性测试是根据先前的方法稍作修改后进行的[25]。热稳定性试验测定过程如下：在不同温度(4、25、37、50、60和70 ℃)下，将100 μL噬菌体悬浮液在900 μL PBS缓冲液中孵育1 h。采用双层琼脂平板法计数测定噬菌体的存活率。pH稳定性试验测定过程如下：将100 μL噬菌体悬浮在900 μL SM缓冲液，pH为1.0−12.0，在37 ℃的条件下培养1 h。采用双层琼脂平板法测定噬菌体的存活率。所有试验均重复3次。
1.8 噬菌体PH826的体外抗菌活性将噬菌体PH826与细菌PA003 (OD600为2×108 CFU/mL)在细菌对数生长期以MOI分别为10、1、0.1的比例混合，然后在37 ℃的条件下在180 r/min摇床上孵育。PBS用作对照组。每10 min测量一次细菌的OD600值，总时长持续2 h。所有试验均重复3次。
1.9 噬菌体PH826和抗生素的联合抑菌作用使用多黏菌素B、美罗培南、环丙沙星、阿米卡星、链霉素、氨苄青霉素、庆大霉素和磷霉素测定PA003 (PH826的宿主菌)的MIC；同时加入PH826 (终浓度为1×108 PFU/mL)，测定加入噬菌体后PA003的MIC。以临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI, 2019)为标准，所有试验均重复3次。
1.10 使用PH826和/或抗生素用于抑制生物膜(biofilm)取OD600为0.4的PA003 100 μL，以加100 μL的PBS为对照组，加100 μL的PA003+100 μL的抗生素(环丙沙星终浓度为0.5 μg/mL、阿米卡星终浓度为16 μg/mL、美罗培南终浓度为2 μg/mL，1×MIC；分别添加)为抗生素组。100 μL的PA003 (含噬菌体PH826，终浓度为1×108 PFU/mL)+100 μL的抗生素(环丙沙星终浓度0.5 μg/mL、阿米卡星终浓度为16 μg/mL、美罗培南终浓度为2 μg/mL，1×MIC；分别添加)；100 μL的PA003 (含噬菌体PH826，终浓度为1×108 PFU/mL)+100 μL的抗生素(环丙沙星终浓度为1 μg/mL、阿米卡星终浓度为32 μg/mL、美罗培南终浓度为4 μg/mL，2×MIC；分别添加)；100 μL的PA003 (含噬菌体PH826，终浓度为1×108 PFU/mL)+100 μL的抗生素(环丙沙星终浓度为2 μg/mL、阿米卡星终浓度为64 μg/mL、美罗培南终浓度为8 μg/mL，4×MIC；分别添加)，37 ℃培养箱中分别作用24 h和48 h。
1.10.1 结晶紫染色法判断生物被膜的抑制情况将上述培养液吸出，每孔加入200 μL的PBS清洗3次，清洗时避免破坏黏附在孔壁的生物被膜；每孔加入100 μL甲醇固定15 min，然后吸出甲醇，自然风干；在每孔加入100 μL 1%的结晶紫，在室温下染色10 min；吸取孔中的结晶紫后，用流水将剩余的结晶紫溶液冲洗干净，室温或37 ℃培养箱中晾干或烘干；在每孔加入100 μL的33%冰乙酸，在37 ℃培养箱中作用30 min以溶解孔中的结晶紫；将培养板置于酶标仪中，测定溶液在595 nm处的吸光值；每孔做3个重复，并取平均值，以未接种菌液的培养液作为阴性对照，阴性值作为界限值(ODc)。结果判定的方法为：OD < ODc为没有生物被膜生成力；ODc < OD < 2ODc为弱生物被膜生成力；2ODc < OD < 4ODc为中等生物被膜生成力；4ODc < OD为强生物被膜生成力。
1.10.2 活菌落计数法判断生物被膜抑制情况分别在作用24 h和48 h后的噬菌体和细菌培养液中，取20 μL液体用PBS稀释后进行滴板计数。
1.11 噬菌体基因组提取和测序噬菌体PH826的基因组按照文献[26]的描述提取。噬菌体PH826的全基因组测序采用Illumina HiSeq系统(Illumina, San Diego)进行。采用bowtie2和samtools进行宿主基因组的去除后，使用Unicycler (version 0.4.8)进行重新组装[27]。
1.12 基因组的注释采用NCBI的BLASTp和RAST进行噬菌体基因组的比较和注释[28]。与PH826相似度较高的噬菌体使用NCBI数据库的在线BLASTn进行检查。噬菌体PH826的全基因组序列已存入GenBank数据库，登录号为ON653033。采用Prophage Hunter (http://pro-hunter.genomics.cn)预测宿主细菌中的前噬菌体[29]。采用PhageAI (https://app.phage.ai/)预测噬菌体的生活状态。使用Mauve 2.3.0对PH826和其他与PH826具有高度同源性的噬菌体的基因组进行多重比对[30]。采用Proksee (https://proksee.ca/)和InKscape进行基因组的可视化。采用Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index)对预测的可能编码的功能蛋白进行结构预测分析[31]。采用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行保守域的预测[32]。
1.13 系统发育和泛基因组分析采用Muscle对末端终止酶大亚基(terminal terminating enzyme large subunits, TerL) (一种保守的噬菌体蛋白)氨基酸序列进行比对。基于比对序列，在MEGA X中构建邻接(neighbor-joining, NJ)系统发育树[33]。通过系统发育分析确定PH826噬菌体的属，并通过NCBI的在线BLASTn搜索所有同属的噬菌体序列后进行泛基因组分析。采用Prokka (https://github.com/tseemann/prokka)对基因组数据注释，注释后收集gff格式的文件[34]。采用Roary (3.13.0) (https://github.com/deminu/Roary)进行同源聚类分析[35]。
1.14 统计分析统计分析采用GraphPad Prism 7软件包完成。测试组和对照组通过学生t检验进行比较。P < 0.05被认为具有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 噬菌体的分离和形态学从养殖污水中分离出一株编号为PH826的噬菌体。噬菌体PH826可以形成大的、清晰的圆形裂解斑。衣壳的直径估计为(62±1) nm，尾部长度估计为(108±1) nm (图 1)。
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| 图 1 PH826的形态图片 Figure 1 Morphological images of PH826. A: Transmission electron micrograph of phage PH826. B: PH826 phage plaques on double plate. |
2.2 噬菌体PH826的宿主谱
选择了39株细菌(包括铜绿假单胞菌33株、鲍曼不动杆菌2株、大肠杆菌2株和肺炎克雷伯菌2株)用于测定噬菌体PH826的宿主谱。其中，13株铜绿假单胞菌(包括人源和动物源)可被PH826裂解，形成浑浊至透明的裂解斑(表 1)。
| Bacteria | Species | Source | Sample | Isolated years | Plaques |
| PA002 | P. aeruginosa | Human | Phlegm | NA | − |
| PA003 | P. aeruginosa | Human | NA | NA | ++ |
| PA004 | P. aeruginosa | Human | Phlegm | 2017 | − |
| PA005 | P. aeruginosa | Human | Airway secretion | 2017 | ++ |
| PA006 | P. aeruginosa | Human | Phlegm | 2017 | ++ |
| PA007 | P. aeruginosa | Human | Phlegm | 2017 | − |
| PA011 | P. aeruginosa | Human | Airway secretion | 2016 | − |
| PA012 | P. aeruginosa | Human | Phlegm | 2016 | ++ |
| PA013 | P. aeruginosa | Human | Airway secretion | 2016 | ++ |
| PA021 | P. aeruginosa | Human | NA | 2019 | ++ |
| PA022 | P. aeruginosa | Human | NA | 2020 | − |
| PA023 | P. aeruginosa | Human | NA | 2020 | + |
| PA024 | P. aeruginosa | Human | NA | 2020 | ++ |
| PA034 | P. aeruginosa | Marten | Phlegm | 2013.7 | + |
| PA035 | P. aeruginosa | Marten | NA | 2013.7 | − |
| PA036 | P. aeruginosa | Marten | Lung | 2013.7 | − |
| PA037 | P. aeruginosa | Marten | Fodder | NA | − |
| PA038 | P. aeruginosa | Marten | Internal organs | 2013.7 | − |
| PA039 | P. aeruginosa | Human | Internal organs | 2011.4 | ++ |
| PA040 | P. aeruginosa | Human | Phlegm | 2011.4 | ++ |
| PA041 | P. aeruginosa | Human | Phlegm | 2011.4 | − |
| PA042 | P. aeruginosa | Duck | Phlegm | 2019.7 | − |
| PA043 | P. aeruginosa | Bovine | NA | 2021.7 | − |
| PA044 | P. aeruginosa | Bovine | NA | 2022.6 | ++ |
| PA045 | P. aeruginosa | Bovine | NA | 2020.8 | − |
| PA046 | P. aeruginosa | Bovine | NA | 2020.8 | − |
| PA048 | P. aeruginosa | Bovine | NA | 2020.9 | ++ |
| PA049 | P. aeruginosa | Bovine | NA | 2020.9 | − |
| PA91 | P. aeruginosa | Human | Airway secretion | 2019.1 | − |
| PA92 | P. aeruginosa | Human | Airway secretion | 2019.2 | − |
| PA93 | P. aeruginosa | Human | Airway secretion | 2019.2 | − |
| PA94 | P. aeruginosa | Human | Blood | 2019.2 | − |
| PA95 | P. aeruginosa | Human | Phlegm | 2019.2 | − |
| AB4 | A. baumannii | Human | Blood | 2020.12 | − |
| AB6 | A. baumannii | Human | Phlegm | 2021 | − |
| EC918 | E. coli | Human | NA | 2021.10 | − |
| EC920 | E. coli | Human | NA | 2021.10 | − |
| KP55 | K. pneumoniae | Human | NA | NA | − |
| KP66 | K. pneumoniae | Human | NA | NA | − |
| ++: Clear cleavage spot; +: Turbid cleavage spot; −: No cleavage; NA: No cleavage. | |||||
2.3 噬菌体的一步生长曲线
一步生长曲线试验表明，PH826的潜伏时间为10 min，上升阶段为40 min，暴发量约为52.86个噬菌体/细菌(图 2)。
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| 图 2 在MOI为0.1时进行的PH826的一步生长曲线测试 Figure 2 One-step growth curve test of PH826 was carried out at MOI of 0.1. Data represent the mean±SEM of three independent replicates. |
2.4 最佳感染复数(MOI)
当MOI为0.001时PH826的效价最高。考虑到噬菌体的投入产出比，低MOI (0.001)被认为是最佳MOI (表 2)。
| Concentration of host bacterial (CFU/mL) | Concentration of phage (PFU/mL) | MOI | Titers of phage |
| 1.5×108 | 1.5×109 | 10 | 1.170×1010 |
| 1.5×108 | 1.5×108 | 1 | 1.440×1010 |
| 1.5×108 | 1.5×107 | 0.1 | 1.520×1010 |
| 1.5×108 | 1.5×106 | 0.01 | 1.255×1010 |
| 1.5×108 | 1.5×105 | 0.001 | 1.605×1010 |
2.5 噬菌体的温度和pH稳定性
在1 h内，PH826在4、25、37 ℃的条件下的存活率较高(存活率 > 93%)，在50 ℃的条件下下降至53.21%。暴露于60 ℃时，存活率骤降至3.67%，在70 ℃时噬菌体全部死亡。PH826可在pH 3.0−10.0的区间内保持高活性(存活率 > 81%)。当pH值为11.0时，存活率下降到52.19%。在pH < 3.0或pH > 1.0的条件下，PH826的存活率为0 (图 3)。
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| 图 3 PH826的稳定性试验 Figure 3 Stability tests of PH826. A: Thermal stability. Phage particles were incubated at various temperatures for 1 h. B: pH stability. Phage particles were incubated under different pH conditions for 1 h. Phage survival rate=titer after incubation/initial titer. Data represent the mean±SEM of three independent replicates. |
2.6 噬菌体PH826的体外抑菌试验结果
体外抑菌试验结果表明，2 h内噬菌体PH826在MOI为10、1、0.1时均能有效抑制PA003的生长，在不同MOI时噬菌体的抑菌效果差异不大。在孵育120 min后，所有3个噬菌体处理组的OD600值均低于对照组(图 4)。
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| 图 4 噬菌体PH826的抗菌活性 Figure 4 Antibacterial activity of phage PH826 (OD600 value of PA003 treated with PH826 at a MOI of 10, 1, and 0.1, respectively). Data represent the mean±SEM of three independent replicates. |
2.7 抗生素和PH826噬菌体联用对PA003的抑制作用
根据CLSI标准，PA003对美罗培南、环丙沙星和阿米卡星敏感。与单独使用抗生素相比，抗生素联用噬菌体组中的8种抗生素对PA003的MIC结果都有所下降(表 3)。
| Item | Antibiotic group | Antibiotics combined with phage group |
| Polymyxin B (μg/mL) | 4 | 1 |
| Meropenem (μg/mL) | 1 | 0.5 |
| Ciprofloxacin (μg/mL) | 0 | 0 |
| Amikacin (μg/mL) | 16 | 2 |
| Streptomycin (μg/mL) | 64 | 32 |
| Ampicillin (μg/mL) | > 512 | 128 |
| Gentamicin (μg/mL) | 16 | 2 |
| Fosfomycin (μg/mL) | > 512 | 16 |
2.8 噬菌体-生物被膜的相互作用
根据PA003的药敏试验结果，选择了3种对PA003敏感的抗生素：环丙沙星、美罗培南和阿米卡星，与噬菌体PH826联用抑制生物被膜的生长。根据CLSI标准，其MIC分别为0.5、2、16 μg/mL。
24 h的生物被膜抑制试验结果显示，与对照组相比，PH826+环丙沙星组在1×MIC、2×MIC、4×MIC时的OD595值分别下降了87.21%、80.97%、81.35%；PH826+美罗培南组在1×MIC、2×MIC、4×MIC时的OD595值分别下降了58.99%、84.26%、84.88%；PH826+阿米卡星组在1×MIC、2×MIC、4×MIC时的OD595值与对照组相比分别下降了34.05%、67.62%、81.16%。然而，单独使用环丙沙星、美罗培南和阿米卡星的OD595值分别下降了6.49%、28.18%、57.99% (图 5)。48 h的生物被膜抑制试验结果显示，PH826+环丙沙星组在1×MIC、2×MIC、4×MIC下的OD595值与对照组相比分别下降了89.44%、92.79%、91.52%；与对照组相比，PH826+美罗培南组在1×MIC、2×MIC、4×MIC的OD595值分别下降了50.43%、93.25%、92.53%；PH826+阿米卡星组在1×MIC、2×MIC、4×MIC的OD595值与对照组相比分别下降了20.88%、78.60%、87.50% (图 5)。
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| 图 5 分光光度法测量生物被膜抑制情况 Figure 5 Spectrophotometric measurement of biological inhibition by membranes. A: Biofilm inhibition test within 24 h. B: Biofilm inhibition test within 48 h (1×, 2×, 4× represent 1×MIC concentration, 2×MIC concentration, and 4×MIC concentration, respectively). Data represent the mean±SEM of three independent replicates. Significant difference (ns: No statistical difference; ****: P < 0.000 1). |
生物被膜抑制试验的活菌落计数结果显示，24 h内，与对照组相比，PH826组菌落数下降1个log值，PH826+环丙沙星组、PH826+美罗培南组、PH826+阿米卡星组菌落数分别下降了12、5、4个log值，环丙沙星组、美罗培南组、阿米卡星组菌落数分别下降了5、2、5个log值；48 h内，与对照组相比，PH826组菌落数下降不足1个log值，PH826+环丙沙星组、PH826+美罗培南组、PH826+阿米卡星组菌落数分别下降了12、4、5个log值，环丙沙星组、美罗培南组、阿米卡星组菌落数没有下降(图 6)。
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| 图 6 噬菌体抑制生物被膜后的细菌菌落计数 Figure 6 Bacterial colony counts after phage inhibition of biofilm. A: Biofilm inhibition test within 24 h. B: Biofilm inhibition test within 48 h (1×represents 1×MIC concentration of antibiotic). Data represent the mean±SEM of three independent replicates. Significant difference (***: P < 0.001). |
2.9 PH826基因组的特点
生物信息学分析表明，PH826的基因组大小为87 956 bp，G+C含量为54.70%，共有165个开放阅读框(open reading frames, ORFs)。噬菌体PH826的全基因组序列已上传至GenBank数据库，登录号为ON653033。PH826被PhageAI预测为裂解性噬菌体。对PH826基因组序列的在线BLASTn分析显示，它与假单胞菌噬菌体Epa26 (登录号：MT118300.1)的相似度较高，核苷酸一致性为98.19%。此外，基因组比较结果表明，PH826与Epa17、Epa24和Epa26有很高的同源性(图 7)。
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| 图 7 通过使用Mauve 2.3.0比较PH826和其他高度同源的铜绿假单胞菌噬菌体的序列 Figure 7 By using Mauve 2.3.0 to compare the sequence of PH826 and its similar Pseudomonas aeruginosa phage. |
总共预测了165个编码序列(coding sequence, CDS)。除了假定蛋白外，预测到的功能蛋白有：噬菌体裂解酶(phage endolysin)、噬菌体终止酶大亚基(phage terminase large subunit)、吖啶黄素抗性蛋白(acriflavin resistance protein)和Ia类核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase of class Ia)。此外，还预测到了2个tRNAs，它们分别是tRNA-Tyr-GTA和tRNA-Gln-TTG (图 8A)。其中预测到的噬菌体裂解酶属于木贼酶(muraidase)，对其进行了蛋白的三维结构分析(图 8B)。
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| 图 8 PH826的基因组学分析 Figure 8 Genomic analysis of PH826. A: Genomic circles, functional proteins identified by RAST annotation are marked, the rest are hypothetical proteins. B: PH826-26. Image coloured by rainbow (red to blue) N→C terminus. |
2.10 系统发育和泛基因组分析
基于终止酶大亚基的氨基酸序列的系统发育树显示，PH826噬菌体与Nankokuvirus的噬菌体归为一类，表明PH826属于Duplodnaviria (realm)、Heunggongvirae (kingdom)、Uroviricota (phylum)、Caudoviricetes (class)、Nankokuvirus (genus) (图 9)。
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| 图 9 噬菌体的系统发育分析 Figure 9 Phylogenetic analysis of bacteriophages. A phylogenetic tree was constructed based on the amino acid sequence of the large subunit of the terminase using the neighbor-joining method with 1 000 bootstrap repeats in MEGA X. |
为了进行泛基因组学分析，使用NCBI上的在线BLASTn搜索了其他25个属于Nankokuvirus属的噬菌体。在这26个噬菌体中共有351个基因簇(包括67个核心基因、2个软核心基因、166个壳基因和116个云基因) (图 10B)。泛基因组分析表明PH826与Nankokuvirus属的其他噬菌体整体相似度较高，与同属的其他25株噬菌体共有19.09%的基因组是一致的(图 10C)。
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| 图 10 Nankokuvirus属的泛基因组分析 Figure 10 Pan-genome analysis of Nankokuvirus phages. A: Frequency of genes versus the number of genomes. B: Pangenome_pie of the 26 strains of Nankokuvirus phages. C: The presence and absence matrix of the 26 strains of Nankokuvirus phages. |
3 讨论与结论
铜绿假单胞菌是最常见的革兰氏阴性病原体之一，引起了医院感染和重要的公共卫生问题。它有许多复杂的耐药机制，并倾向于形成生物被膜，使其更难被控制。在这项研究中，从养殖场污水中分离并鉴定了一株编号为PH826的具有强裂解力的铜绿假单胞菌特异性噬菌体。
噬菌体的宿主谱测定试验结果显示，PH826可以裂解11株铜绿假单胞菌，包括人源和动物源。噬菌体的生物学特性包括噬菌体的温度稳定性和pH值稳定性，其是决定噬菌体应用和储存的关键因素。无论是应用在环境消毒，还是用作体内治疗，作为有应用价值的噬菌体应该在不同的温度和pH值下具有较高的稳定性。PH826可以在4−50 ℃之间保持高活性，并且仍有少量的噬菌体可以在60 ℃下存活(1 h内)，在pH值为3.0−11.0环境下的存活率也高达100% (1 h内)。此外，PH826在体外抑菌试验中表现出很强的抑菌能力。在不使用噬菌体的对照组中，2 h内PA003的OD600值为0.48，在MOI为10、1、0.1时，PA003的OD600值不超过0.1，这表明PH826在治疗和预防铜绿假单胞菌方面具有良好的潜力。PH826单独使用可在12 h内有效抑制铜绿假单胞菌的生长，作用效果与单独使用敏感抗生素无明显差异，其在体外裂解细菌的能力也普遍超于本实验室的其他铜绿假单胞菌噬菌体(未在本文列出)。
由于生物被膜可以形成物理屏障，能显著降低抗生素对细菌的杀菌效果。本研究采用8种抗生素对PA003进行了MIC的测定，结果表明PA003对许多抗生素有抗性，仅对环丙沙星、美罗培南和阿米卡星敏感。因此，选用了这3种抗生素与PH826联合使用进行生物被膜抑制试验。24 h和48 h的生物被膜抑制试验结果显示，PH826+环丙沙星组在1×MIC、2×MIC和4×MIC时都能有效抑制生物被膜的形成(24 h分别下降了87.21%、80.97%和81.35%；48 h分别下降了89.44%、92.79%和91.52%)。PH826+美罗培南组在1×MIC时的效果略差于PH826+环丙沙星组，但在2×MIC和4×MIC时有效(24 h分别下降了67.62%和81.16%；48 h分别下降了93.25%和92.53%)。总体来说，阿米卡星+PH826组对生物被膜的抑制效果不如环丙沙星和PH826联用及美罗培南和PH826联用组。然而，单独使用环丙沙星或噬菌体PH826对铜绿假单胞菌生物被膜的增长没有表现出明显的抑制能力。
对噬菌体和抗生素联用增强抑菌效果的现象做出了推测解释，可能是由于抗生素对生物膜内的细菌渗透性低，而生物膜内的细菌由于代谢活性低而表现出较高的抗生素抗性。然而，当噬菌体破坏了细胞外基质的完整性时，生物膜内层的细菌就会暴露出来，导致抗生素和噬菌体联合使用的抗菌效果增强[36]。事实上，分别对已经生成24 h和48 h的生物被膜进行了生物被膜清除试验，但是，环丙沙星与PH826联合使用或美罗培南与PH826联合使用均不能清除已生成的生物被膜。
基因组序列分析和电子显微镜分析联合表明，PH826噬菌体属于Nankokuvirus属。在线BLASTn比对结果显示，PH826与假单胞菌噬菌体Epa14、Epa17和Epa26的序列相似度很高。此外，PH826被PhageAI预测为裂解性噬菌体，可用于噬菌体治疗。在PH826的基因组中发现了2个tRNA。已经有充分的资料表明，tRNA可以由噬菌体携带。推测出2种假设：(1) 裂性噬菌体在宿主DNA的降解过程中，在所有噬菌体遗传物质被封装之前捕获细菌DNA；(2) 裂性噬菌体也可以通过与溶源性噬菌体重组获得tRNA。Canchaya等和Bailly-Bechet等研究了193种噬菌体的基因组，发现其中的48种共含有214种tRNA[37-38]。最近被报道为“huge phages”的噬菌体通常携带更多的tRNA，每个噬菌体平均有多达15个tRNA合成酶。一般来说，每个基因组的tRNA数量随着基因组的长度而增加[39]。PH826含有2个对应于密码子Tyr-GTA和Gln-TTG的tRNA，也有报道称AT碱基通常在tRNA的密码子中富集[40]。此外，发现PH826含有1个内溶素模块，推测可能具有裂解酶活性，裂解酶的表达工作正在进行中。
总之，在这项研究中，发现了一种具有针对铜绿假单胞菌的强裂解性噬菌体PH826。研究结果表明，PH826噬菌体在体外能有效地抑制细菌生长和生物膜的形成，这表明它在控制由耐多药的铜绿假单胞菌引起的感染方面有潜在的应用价值。
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