2024, Vol. 64
表1(Table 1)
仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道源植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) HY21的生长及益生特性分析
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20230549
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 李忠琴, 王泽楠, 黄文树, 杨求华, 邹文政. 2024
- LI Zhongqin, WANG Zenan, HUANG Wenshu, YANG Qiuhua, ZOU Wenzheng.
- 仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道源植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) HY21的生长及益生特性分析
- Growth and probiotic properties of Lactobacillus plantarum HY21 from intestinal tract of Apostichopus japonicus
- 微生物学报, 64(3): 840-853
- Acta Microbiologica Sinica, 64(3): 840-853
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文章历史
- 收稿日期：2023-08-29
- 网络出版日期：2023-12-21
引用本文 |
李忠琴, 王泽楠, 黄文树, 杨求华, 邹文政. 仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道源植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) HY21的生长及益生特性分析[J]. 微生物学报, 2024, 64(3): 840-853.
Li Zhongqin, Wang Zenan, Huang Wenshu, Yang Qiuhua, Zou Wenzheng. Growth and probiotic properties of Lactobacillus plantarum HY21 from intestinal tract of Apostichopus japonicus[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024, 64(3): 840-853.
仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道源植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) HY21的生长及益生特性分析
1. 集美大学水产学院, 福建 厦门 361021;
2. 福建省水产研究所, 福建 厦门 361021;
3. 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心, 福建 厦门 361021;
4. 华中农业大学动物科学技术学院·动物医学院, 湖北 武汉 430070
2. 福建省水产研究所, 福建 厦门 361021;
3. 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心, 福建 厦门 361021;
4. 华中农业大学动物科学技术学院·动物医学院, 湖北 武汉 430070
摘要：[目的] 在仿刺参(Apostichopus japonicus)健康养殖中为了寻找具有良好耐受性、益生性、安全性的益生菌，本研究从仿刺参肠道内容物中分离获得一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) HY21，对其益生潜能进行评价。[方法] 利用摇瓶发酵培养、应用环境因子模拟试验、抗生素药敏测试等方法，分析L. plantarum HY21的生长特性、产酸性能、发酵液的抗氧化性质和对水产致病菌的抑制作用；检测菌体的疏水性、自聚性和共聚性、黏附力和药物敏感性，以及对应用环境因子的耐受性。[结果] L. plantarum HY21摇瓶发酵培养温度30 ℃、初始pH 8.0，于2–10 h为对数生长期，发酵18 h后pH达到最低3.6；发酵液对溶藻弧菌的抑菌直径达到(13.96±0.30) mm，对1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine, DPPH)自由基清除率达到95.45%±1.56%；L. plantarum HY21的疏水率为60.42%±2.78%、自聚率为22.69%±1.36%，与溶藻弧菌共聚率为27.98%±1.45%；对体表和肠道黏液蛋白的黏附量分别达到(1.66±0.01)×106 CFU/mL和(1.23±0.15)×106 CFU/mL；对13种常见的抗菌药物均表现敏感；菌体在模拟胃肠液(pH 3.0, pH 6.8)中孵育3 h存活率均可达99%以上，在10%鱼胆汁溶液中孵育3 h存活率达到68.11%±7.98%，在3%海盐溶液中孵育16 h存活率达到97.58%±7.14%。[结论] L. plantarum HY21具有良好的定殖作用、抑菌作用、抗氧化作用等益生特性，而且在应用环境中具有高存活率和高安全性，可以作为一株新的水产益生菌，为开发水产益生菌制剂提供科学理论依据。
关键词：植物乳杆菌 耐受性 黏附性 抑菌作用 抗氧化作用
Growth and probiotic properties of Lactobacillus plantarum HY21 from intestinal tract of Apostichopus japonicus
1. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, Fujian, China;
2. Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361021, Fujian, China;
3. Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry, Ministry of Education, Xiamen 361021, Fujian, China;
4. College of Veterinary Medicine & College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China
2. Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361021, Fujian, China;
3. Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry, Ministry of Education, Xiamen 361021, Fujian, China;
4. College of Veterinary Medicine & College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China
Abstract: [Objective] To search for the strains with improved tolerance, probiotic properties, and safety, we isolated Lactobacillus plantarum HY21 from the intestinal contents of Apostichopus japonicus and evaluated the probiotic potential of the strain. [Methods] The shake flask fermentation, environmental factor simulation test, and antibiotic susceptibility test were carried out to study the growth characteristics and acid production of the strain, as well as the antioxidant capacity and aquatic pathogen-inhibiting effects of the fermentation broth. In addition, L. plantarum HY21 was characterized in terms of the tolerance to environmental factors, hydrophobicity, auto-agglutination and co-aggregation, antibiotic susceptibility, and intestinal adhesion ability. [Results] L. plantarum HY21 in shake flask culture with the initial pH 8.0 entered the logarithmic growth during the period of 2–10 h. The culture showed a strong acid-producing ability with the minimum pH 3.6 at the time point of 18 h. The fermentation broth of the strain showed an inhibition zone diameter of (13.96±0.30) mm against Vibrio alginolyticus and a 1, 1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine (DPPH) free radical scavenging rate of 95.45%±1.56%. L. plantarum HY21 had a hydrophobicity rate of 60.42%±2.78%, an auto-agglutination rate of 22.69%±1.36% and a co-aggregation rate of 27.98%±1.45% with V. alginolyticus. Furthermore, the strain showed the adhesion number of (1.66±0.01)×106 CFU/mL and (1.23±0.15)×106 CFU/mL to fish body surface and intestinal mucus protein, respectively. L. plantarum HY21 was susceptible to 13 common antibiotics. The survival rate of L. plantarum HY21 reached 99% and above in simulated gastrointestinal fluid (pH 3.0, pH 6.8) within 3 h, 68.11%±7.98% in 10% fish bile fluid within 3 h, and 97.58%±7.14% in 3% sea salt solutions within 16 h. [Conclusion] L. plantarum HY21 is a probiotic strain with strong colonization potential, antimicrobial activity, and antioxidant capacity, demonstrating a high survival rate and high safety in the applied environment. The findings provide a theoretical basis for the development of new probiotic strains as probiotic additives for aquaculture.
Keywords:
Lactobacillus plantarum tolerance adhesion antimicrobial effect antioxidant capacity
随着我国水产养殖业的迅猛发展，养殖水环境持续恶化，近年来频繁暴发水产养殖病害，养殖户不得已增加化学类药物用量，这不仅影响水产品质量，还危及食品安全，成为水产养殖业健康可持续发展的制约因素。随着对水产投入品的监管日趋规范与严厉，根据农业农村部第194号公告，饲料中已禁止添加抗生素。为了防治水产养殖病害，益生菌制剂已成为一种优良的抗生素替代产品。益生菌具有与抗生素相似的抗菌活性，在环境保护、食品安全、病原耐药性等方面却无抗生素的负面影响。益生菌能够调节宿主体内的肠道菌群，增加有益菌株的比例，提高消化吸收能力，从而提高饲料利用率，促进养殖动物生长；益生菌代谢产物还能增强肠道免疫力和抗氧化性，提高养殖动物的抗应激能力和抗病原侵染能力，降低死亡率[1-5]。
仿刺参(Apostichopus japonicus)是我国重要的经济海水品种。自2003年开展“北参南养”试验以来，仿刺参养殖在南方取得蓬勃发展，福建省已成为我国南方重要的仿刺参养殖产区，在“北参南养”过程中，疾病问题一直是制约养殖业发展的难题。本研究从仿刺参肠道内容物中分离获得一株植物乳杆菌，对菌株生长特性、定殖作用、抑菌作用、抗氧化作用等益生特性进行分析，为水产用益生菌制剂研发提供备选菌株，为更好地开发和应用益生菌制剂提供理论支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)分离自福建水产研究所提供的健康仿刺参的肠道内容物，经16S rRNA基因测序鉴定，NCBI基因序列号为OP020611。
溶藻弧菌(Vibrio alginolytica)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)由鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心提供。
1.1.2 主要试剂及仪器MRS肉汤、MRS琼脂、LB肉汤和LB琼脂购自海博生物技术有限公司；抗菌药物药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；邻菲咯啉、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2- trinitrophenylhydrazine, DPPH)、邻苯三酚等购自上海麦克林生化科技股份有限公司；硫酸亚铁、氯化钠、无水乙醇和过氧化氢等购自国药集团化学试剂有限公司。
全波长酶标仪、大容量高速冷冻离心机购自ThermoFisher Scientific公司；纯水系统购自Millipore公司；电热鼓风干燥箱购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超净工作台购自北京东联哈尔仪器制造有限公司；生化培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；恒温培养振荡器购自天津市欧诺仪器仪表有限公司。
1.2 细菌浓度和吸光度值的线性相关曲线参考文献[6]，以无菌培养液作为空白对照，取处于对数生长期的L. plantarum培养液。在波长600 nm分别测定系列稀释菌悬液的OD值，制作菌浓度与OD值的关系曲线，获得线性关系方程式。
1.3 不同条件下培养菌株HY21MRS液体培养基分别调节不同pH和不同NaCl添加量，分别接种2%种子液，在不同温度条件下进行恒温培养24 h，测定其OD600值。根据1.2线性方程式，计算结果绘制图表。
1.4 菌株的生长曲线及产酸能力的测定将L. plantarum HY21培养液以2%接种于MRS液体培养基，30 ℃恒温厌氧培养。前12 h每1 h取样一次，后20 h每2 h取样一次。测定培养液在600 nm处吸光度值并测定培养液pH。
1.5 模拟胃液和肠液的耐受性试验参考文献[7]，配制不同pH的人工胃肠液。将L. plantarum HY21培养液分别接种于人工胃液或人工肠液中，30 ℃、180 r/min摇床培养，分别于0、1、2、3 h进行活菌平板计数。
1.6 药敏试验采用纸片扩散法测定L. plantarum HY21对8种常用抗菌药物的敏感性，依据《抗菌药物敏感性试验执行标准第十九版信息增刊》(CLSI, 2009)，判定对8种抗菌药物敏感度。
采用微量肉汤稀释法测定7种渔用药物对L. plantarum HY21抗菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)。
1.7 海盐的耐受性试验取活化培养12 h后的L. plantarum HY21培养液，离心去除上层清液，用3%的海盐溶液重新混匀，再于28 ℃培养箱培养。分别于0、1、2、4、8、16 h进行平板菌落计数。
1.8 鱼胆汁的耐受性试验取新鲜鱼胆汁，用无菌滤膜过滤。再用0.9%生理盐水稀释成5%、10%、20%浓度梯度的胆汁溶液。取5 mL植物乳杆菌HY21悬液与5 mL生理盐水混合，进行平板菌落计数作为对照。各取5 mL不同浓度胆汁溶液与5 mL菌悬液混合。于28 ℃摇床培养3 h，进行平板菌落计数。
1.9 黏附能力的测定取1 mL黏液蛋白于2 mL离心管中，4 ℃下过夜使黏液蛋白包被于离心管上。去除上层清液以除去未黏附在离心管上的蛋白，加1 mL植物乳杆菌HY21悬液于管中，30 ℃孵育1 h。去除上层清液，将1 mL无菌生理盐水加入管中混匀。将菌液均匀涂布在平板上，进行计数，以确定菌液中的细菌数量。
1.10 表面疏水性、自凝聚性、共聚集性测定采用细菌黏着碳烃化合物法[8]，通过乳酸菌对碳烃化合物的亲和力来测定菌株疏水性。参考文献[8-9]，测定L. plantarum HY21的自凝聚性，以及与迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌和溶藻弧菌的共聚集性。按照公式(1−3)计算自聚性、疏水性及共聚性：
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公式(1) |
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公式(2) |
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公式(3) |
式中，A0为初始菌液OD600值；A1为静置3 h后上清液OD600值；A2为与二甲苯混匀后水相OD600值；A3为病原菌OD600值；A4为混合静置5 h后上清液OD600值。
1.11 抑菌试验采用琼脂扩散法[10]，将4种水产常用病原指示菌(无乳链球菌、迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌)在其最佳培养条件下进行培养，调整菌液浓度至106 CFU/mL，分别吸取100 μL菌液于平板上均匀涂开，放上牛津杯。每个牛津杯内加入200 μL植物乳杆菌HY21发酵上清液，30 ℃恒温培养12 h，观察并用游标卡尺测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小判定其抑菌能力的强弱。
1.12 体外抗氧化能力的测定参考文献[11-13]的方法，分别测定L. plantarum HY21的胞外产物、胞内产物、菌细胞悬液三者清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子的能力，以及三者的还原力。按公式(4−7)计算。
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公式(4) |
式中，A0为对照组吸光度；A1为样品组吸光度；A2为空白组吸光度。
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公式(5) |
式中，A1为样品组吸光值；A0为空白组吸光值。
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公式(6) |
式中，A1为样品组吸光值；A0为空白组吸光值
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公式(7) |
式中，As为样品组吸光值；Ab为PBS替代待测样品的空白组吸光度值；以0.25 mg/mL的维生素C (vitamin C, Vc)溶液作为阳性对照，将待测样品的还原力转换为VC当量。
1.13 数据分析数据采用SPSS 17.0中单因素方差分析，结果以平均值+标准差表示，其中P > 0.05表示差异不显著，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著；采用GraphPad Prism 8软件作图。
2 结果与分析 2.1 细菌浓度和吸光度值的线性相关曲线L. plantarum HY21的细菌浓度与OD值之间相关线性关系的标准曲线如图 1所示。在波长为600 nm下，当吸光度值介于0.054 0–0.848 6之间时，L. plantarum HY21细菌浓度与吸光度值之间线性关系良好，建立的回归方程为Y=0.027 34X+0.039 11 (R2=0.997 6)。
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| 图 1 植物乳杆菌HY21的细菌浓度-吸光度的线性相关曲线 Figure 1 Linear curve between bacterial concentration and absorbance of Lactobacillus plantarum HY21. |
2.2 植物乳杆菌的培养条件和产酸能力
由图 2所示，当pH 4.0–9.0时，植物乳杆菌HY21生长迅速，能大量繁殖。菌株在强酸强碱环境下生长状态明显受到抑制，对pH 4.0和pH 10.0等环境具有一定的耐受性。在15 ℃低温条件和55 ℃高温条件下，生长完全受到抑制，在20–45 ℃条件下，菌株能够良好生长。在添加1.0%、1.5% NaCl的MRS培养基中，菌株不受影响能正常生长。当添加NaCl含量大于3.0%时，生长效果逐渐次之。当NaCl添加量达到8.0%时，生长受到抑制，菌体无法增殖。在接种2 h后，迅速进入对数生长期，9 h后生长速度变缓，14 h时到达最大生长量。0–10 h内，菌液pH从5.6快速下降至3.8。18 h后菌液pH变化趋于平缓，基本稳定在3.6左右。L. plantarum HY21可以在14 h内达到最大生长量和较低的pH。综上所述，L. plantarum HY21在pH 5.0–8.0的环境中生长状态最佳，耐温范围较广，14 h内达到最大生长量和较低的pH。
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| 图 2 不同初始条件下植物乳杆菌HY21的生长量(A−C)和植物乳杆菌HY21的生长与pH变化曲线(D) Figure 2 Growth of Lactobacillus plantarum HY21 under different initial conditions (A−C), growth and pH change curve of L. plantarum HY21 (D). A: Growth of L. plantarum HY21 under different pH conditions. B: Effects of different temperatures on the growth of strain HY21. C: Growth of L. plantarum HY21 in media with different concentration of NaCl. D: Growth and pH change curve of L. plantarum HY21. The error bar reflects the average difference between a data point and the mean. |
2.3 植物乳杆菌对模拟胃肠液、海盐溶液、胆汁的耐受性
表 1比较了L. plantarum HY21在不同外环境胁迫下的存活情况。在pH 3.0的人工胃液和pH 6.8的人工肠液中3 h后，L. plantarum HY21存活率分别为118.83%±7.42%和103.85%±3.42%。在不同pH的人工胃肠液中处理不同时间后，所检测到的L. plantarum HY21活菌数随着pH降低而明显减少；而且经pH 2.5处理，随着时间延长活菌数显著减少；但经pH 3.0处理，随时间延长菌数没有明显变化。植物乳杆菌HY21在3%海盐溶液中处理不同时间后，所检测到的活菌数随时间延长并没有明显差异；在处理16 h后存活率仍为97.58%±7.14%。随着胆汁浓度的增加，植物乳杆菌HY21的活菌数逐渐减少，存活率逐渐降低；在2.5%、5.0%、10%胆汁环境下，存活率分别为89.43%±1.27%、87.74%±6.23%、68.11%±7.98%。
表 1. 植物乳杆菌HY21在不同溶液中的存活率(平均值±标准误，n=3)
Table 1. Survival rate of Lactobacillus plantarum HY21 in different liquids (mean±SEM, n=3)
| Tolerance time (h) | Gastric fluid pH 2.0 survival rate (%) | Gastric fluid pH 2.5 survival rate (%) | Gastric fluid pH 3.0 survival rate (%) | Enteric fluid pH 6.8 survival rate (%) |
| 1 | < 0.1 | 44.45±6.77a | 99.25±8.11 | 99.16±6.16b |
| 2 | < 0.1 | 0.30±0.00b | 106.04±5.74 | 113.91±4.48ab |
| 3 | < 0.1 | < 0.1c | 118.83±7.42 | 103.85±3.42a |
| Data are means of triplicates. Means in each bar sharing the same superscript letter or absence of superscripts are not significantly different determined by Tukey’s test (P≥0.05). The same below. | ||||
2.4 植物乳杆菌HY21药敏分析
由表 2可知，植物乳杆菌HY21对8种药物均表现敏感；其中对四环素最敏感，抑菌直径达到(40.66±1.15) mm；对青霉素G不敏感。由表 3得，7种水产常用抗菌药对L. plantarum HY21抗菌的MIC均介于常规用量，均表现敏感。对硫酸新霉素最为敏感，最低抑菌浓度为0.25 μg/mL。
表 2. 植物乳杆菌HY21对9种药物的敏感度
Table 2. The sensitivities of Lactobacillus plantarum HY21 to the nine susceptibility tablets
| Antibiotics | Drug content (μg/tablet) | Diameter of inhibition zone (mm) | Sensitivity |
| Tetracycline | 30 | 40.66±1.15 | S |
| Erythromycin | 15 | 38.33±0.57 | S |
| Norfloxacin | 10 | 34.00±1.00 | S |
| Sulfamethoxazole+Trimethoprim | 23.75/1.25 | 42.00±1.73 | S |
| Furazolidone | 300 | 37.00±1.00 | S |
| Gentamicin | 10 | 30.00±2.00 | S |
| Penicillin G | 10 | 22.33±1.15 | R |
| Chloramphenicol | 30 | 35.00±3.00 | S |
| Ampicillin | 100 | 31.66±3.00 | S |
| R: Insensitivity; S: Sensitivity. | |||
表 3. 七种水产常用药物对植物乳杆菌HY21的最低抑菌浓度
Table 3. Minimum inhibitory concentrations of seven commonly used aquatic drugs against Lactobacillus plantarum HY21
| Drugs | MIC (μg/mL) | Conventional dosage (time) |
| Enrofloxacin | 8 | 6–12 |
| Neomycin sulphate | 0.25 | 3 |
| Thiamphenicol | 4 | 3–6 |
| Florfenicol | 8 | 12–18 |
| Doxycycline | 8 | 12 |
| Flumequine | 16 | 15–30 |
| Sodium sulfamonomethoxine | 64 | 48–96 |
2.5 植物乳杆菌HY21的益生特性 2.5.1 植物乳杆菌HY21的体外定殖性能表征
由表 4可知，植物乳杆菌HY21的自聚率和疏水性分别达到22.69%±1.36%、60.42%±2.78%；与4株水产常见的病原菌共聚性达到25.33%±0.81%以上，其中与迟缓爱德华氏菌的共聚性达到33.62%±0.62%，显著高于其他3株病原菌；体表、肠道黏液的黏附量分别达到(1.66±0.01)×106 CFU/mL和(1.23±0.15)×106 CFU/mL，L. plantarum HY21对体表黏液的黏附量显著高于肠道黏液。
表 4. 植物乳杆菌HY21的表面疏水性、自聚性、共聚性和黏附能力的测试结果
Table 4. Test results of surface hydrophobicity, self-coagulation, copolymerization and adhesion of Lactobacillus plantarum HY21
| Item | Result (%) |
| Self-coagulation | 22.69±1.36 |
| Hydrophobicity | 60.42±2.78 |
| Copolymerization with Vibrio alginolytica | 27.98±1.45b |
| Copolymerization with Edwardsiella tarda | 33.62±0.62a |
| Copolymerization with Streptococcus agalactiae | 25.89±2.95b |
| Copolymerization with Aeromonas hydrophila | 25.33±0.81b |
| Surface mucous adhesion amount (×106 CFU/mL) | 1.66±0.01A |
| Intestinal mucous adhesion amount (×106 CFU/mL) | 1.23±0.15B |
| The significant differences between the four groups of copolymerization were analyzed (lowercase letters); Significance analysis between two groups of mucus (capital letters). | |
2.5.2 植物乳杆菌HY21发酵液的抑菌效果
植物乳杆菌HY21对无乳链球菌、迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌4株指示病原菌的抑制效果如表 5、图 3所示。由表 5结果可知，植物乳酸杆菌HY21发酵上清液对4株指示菌均有较好的抑菌效果，其中对无乳链球菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径达(17.83±0.50) mm。
表 5. 植物乳杆菌HY21对4株病原菌的抑制作用
Table 5. Antibacterial effect of Lactobacillus plantarum HY21 against four pathogenic bacteria
| Strain | Diameter of inhibition zone (mm) |
| Vibrio alginolytica | 13.96±0.30c |
| Edwardsiella | 16.93±0.55b |
| Streptococcus agalactiae | 17.83±0.50a |
| Aeromonas hydrophila | 9.10±0.26d |
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| 图 3 植物乳杆菌HY21对4株病原菌的抑制平板 Figure 3 Antibacterial plate of Lactobacillus plantarum HY21 against four pathogenic bacteria. |
2.5.3 植物乳杆菌HY21的体外抗氧化能力
图 4比较L. plantarum HY21的细胞悬液、发酵胞外产物、胞内产物等3种物质的4种抗氧化指标，可知3种物质均具有不同程度的抗氧化作用。由图 4A可知，胞外产物对DPPH自由基的清除率高达95.45%，明显高于菌细胞悬液(21.24%)和胞内产物(19.70%)的清除率。由图 4B可知，胞外产物对羟基自由基的清除能力显著高于细胞悬液和胞内产物，高达37.70%。由图 4C可知，胞内产物对超氧阴离子的清除率最高，达到18.73%。由图 4D可知，菌细胞悬液和胞内产物的还原力极低，但胞外产物的还原力相当于1.06倍0.25 mg/mLVC的还原力。
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| 图 4 植物乳杆菌HY21清除3种自由基的能力和还原力的比较分析 Figure 4 Comparative analysis of the ability of Lactobacillus plantarum HY21 to scavenge three kinds of free radicals and reductive property. A: DPPH free radical scavenging ability. B: Hydroxyl radical scavenging ability. C: Superoxide radical scavenging ability. D: Reducing capacity. The error bar reflects the average difference between a data point and the mean. Different lowercase letters represent significant differences. 不同小写字母之间表示差异显著，相同字母之间表示差异不显著 |
3 讨论 3.1 不同来源植物乳杆菌的生长特性
对比不同来源植物乳杆菌的生长曲线与产酸曲线发现，大部分植物乳酸杆菌的生长延滞期较短，大多在2 h后迅速进入对数期，且产酸较多，大多数进入稳定期时pH小于4.0[14-19]。本试验菌株HY21的生长曲线和产酸曲线与猪源植物乳酸杆菌GF103[14]的研究结果相似，2 h后进入对数期，9 h进入稳定期，稳定后pH在3.6左右，至20 h进入稳定期末期，菌量才出现下降。该结果表明，菌株HY21有较好的稳定性和产酸能力。培养后期可以调节pH和添加营养物质等方式，在短时间内获得大量发酵产物和菌体。
温度是微生物生命活动中重要的环境因子，当温度改变时，微生物必须通过调节脂类的组成、胞内酶的活性、蛋白质的合成、基因调控和RNA的合成以适应环境温度的变化。温度不仅影响乳酸菌的生长，还影响代谢产物的产量和质量。Fu等[17]从泡菜中分离出植物乳酸杆菌ZJ2868，该菌在20–45 ℃的温度范围内均能正常生长，属于中温性乳酸菌。菌株HY21在30 ℃时生长效果最佳，在20–45 ℃能够良好生长，与温度对菌株ZJ2868的生长影响规律一致，也属于中温性乳酸菌。
3.2 植物乳杆菌对宿主内外环境条件的耐受性为了在肠道中发挥益生菌的作用，摄入的植物乳酸杆菌菌株需要在肠道的胆汁盐中存活，并在胃的酸性条件下存活，以便细菌定殖在主体[19]。因此对胃液、肠液、胆汁的抵抗力是选择潜在益生菌的重要标准。本研究考察了胃肠液、胆汁、渗透压对植物乳杆菌存活率的影响，测定不同pH值的胃液、肠液、胆汁和渗透压条件下菌株的存活率，试验结果与其他来源的植物乳杆菌的研究结果相一致[19-27]。
动物进食后pH约为3.0–5.0，一般食物通过胃的时间低于3 h，益生菌必须在pH值为3.0的条件下存活1.5–2.0 h[20-21]。因此，选择的益生菌需要对酸性条件具有高耐受性，才能更好地在肠道上部定殖[22]。Zommiti等[23]发现在低pH条件下，部分乳酸菌仍能保持活力，而低pH值与活力损失之间存在负相关关系。本研究发现，菌株HY21对pH 3.0的模拟胃液和pH 6.8的模拟肠液有良好的适应，在3 h后仍保持较高的存活率，均达到99%以上，而大于初始值的原因，可能是低pH条件下，菌株仍有少量增殖。
胆汁中含有胆汁盐，胆汁盐是具有强抗菌活性的有机化合物，可能会损坏或严重损害菌体膜功能。此外，胆汁盐会导致氧化应激、DNA损伤和蛋白质错误折叠[24]。因此，必须选择对胆汁盐具有高抗性的菌株。Mathara等[25]研究表明，在0.3%胆汁盐中培养，与未添加胆汁组对比，生长达到50%以上的菌株，被认为具有良好抗性的菌株。本研究考虑到实际肠道中胆汁的成分包括无机盐、胆汁酸、胆色素、脂肪酸、胆固醇、卵磷脂和少量蛋白质(包括黏蛋白、浆蛋白)等有机成分及酶的影响。在10%新鲜鱼胆汁处理下存活率仍达到68.11%±7.98%。应用新鲜胆汁对菌体进行处理，尚未见其他来源植物乳杆菌的相关研究报道。结果表明，该植物乳杆菌具有良好的胃肠道定殖能力，具有在动物体内存活的潜力。
为应用于海水养殖环境或高渗透压的食物中存活，菌体需要对渗透压有一定的耐受性。海水的平均盐度为3.5%。本研究使用3.0%的海盐溶液和不同梯度的NaCl培养。在4.0%的NaCl溶液中仍然能够较好生长，在3.0%的海盐处理16 h后，存活率高达97.58%±7.14%。
3.3 植物乳杆菌的安全性分析由于益生菌可以作为抗生素抗性基因的宿主，将它们转移到病原菌中，因此从安全性的角度考虑，乳酸杆菌的抗生素敏感性被认为是评估其作为潜在益生菌的重要标准[28-29]。本研究结果显示L. plantarum HY21对绝大部分测试抗菌药物具有较高敏感性，不存在耐药性，表明该菌株有着良好的安全性能。乳酸菌对常用抗生素的多重耐药已成为普遍现象，不同来源的菌株表现出了不同的耐药性[27]。Manzoor等[27]和Zago等[30]研究发现其他来源的植物乳杆菌对红霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素表现敏感。本研究结果与之相反，其他植物乳酸杆菌被发现对使用的一些常规抗生素具有耐药性[14, 19]，可能是由于细菌菌株类型的差异[27-31]。
3.4 植物乳杆菌作为益生菌的特性益生菌可以在肠道黏附。黏附后可以与大肠杆菌等肠道病原菌发生黏附竞争，从而抑制病原体生长、调节肠道菌群、增强免疫力和防治肠道感染[32-33]。对肠上皮细胞的黏附能力是益生菌发挥其有益作用的原因之一。聚集、共聚集和疏水能力被认为与细胞黏附特性相关[19]。益生菌在进入宿主肠道内的过程中，首先在黏蛋白上黏附，因此益生菌与宿主肠黏液的黏附能力是反映其黏附性的重要标准之一[34]。本研究测得植物乳杆菌HY21的疏水性达到60.42%±2.78%，与多株水产病原菌共聚性达到25.33%±0.81%以上，肠道黏液蛋白黏附量达到106 CFU/mL，由此说明植物乳杆菌HY21在肠道具有较强的吸附能力与定殖能力。本研究使用的体外黏液黏附模型结果与其他研究的体外细胞黏附模型、体外肠组织模型得到的结果一致[28, 35]。
益生菌黏附机体肠道后，可以通过分泌有机酸、多糖类、抗菌肽类等物质来抑制微生物[36]。本研究对比其他乳杆菌研究，乳杆菌均体现了良好的抑菌性能，但是不同菌株的抑菌效果存在差别[37-39]。在嗜水气单胞菌的抑制效果上，与郭凤茹的研究一致[39]。在迟缓爱德华氏菌的抑制效果上，比陆晓岑筛选的菌株BA09效果更佳[40]。而对于无乳链球菌有抑制作用的益生菌主要是芽孢杆菌类[38]。对比以上研究，本研究的植物乳杆菌在水产上抑菌范围广、效果好，丰富了防控致病菌的益生菌资源。
益生菌可以作为抗氧化剂来维持肠道中的氧化还原平衡，减少自由基引起的氧化损伤[41-42]。植物乳杆菌HY21通过清除不同浓度的DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子，显示出其作为理想抗氧化剂的潜力。Liu等[41]研究来源发酵泡菜中分离的植物乳酸杆菌LP9010和LP6595时发现，上清液的羟基自由基、超氧阴离子和DPPH自由基清除能力均高于细菌沉淀。本研究在DPPH自由基和羟基自由基清除能力上与其结果一致，而超氧阴离子与其结果相反，考虑可能是菌株来源不同的影响。植物乳杆菌HY21在还原能力上远高于刘珊春发酵乳分离的植物乳酸菌[13]，总体均体现了较高的抗氧化力，因此该植物乳杆菌是一种十分有潜力的天然抗氧化物。
4 结论本研究从健康仿刺参肠道分离纯化一株具有良好耐酸碱性能、适温适盐范围广的植物乳酸杆菌，具有良好的生物安全性和肠道黏附性；对人工模拟的胃肠液、胆汁内环境和高渗透压外环境有一定的耐受性；对水产致病菌具有明显抑制作用，具有较强的抗氧化能力。本研究为该菌株开发成为水产用新的益生菌制剂提供理论参考。
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