2024, Vol. 64
表1(Table 1)
花生根际促生复合菌剂对连作花生生理生化指标和根际细菌群落的影响
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20230681
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 于宏, 王孟亮, 刘希建, 董静怡, 王丹丹, 解志红, 余义发. 2024
- YU Hong, WANG Mengliang, LIU Xijian, DONG Jingyi, WANG Dandan, XIE Zhihong, YU Yifa.
- 花生根际促生复合菌剂对连作花生生理生化指标和根际细菌群落的影响
- Effects of a compound inoculant of peanut growth-promoting rhizobacteria on physiological and biochemical indexes of peanut plants in a continuous cropping system and rhizosphere bacterial community
- 微生物学报, 64(4): 1233-1248
- Acta Microbiologica Sinica, 64(4): 1233-1248
-
文章历史
- 收稿日期：2023-11-06
- 网络出版日期：2024-01-04
引用本文 |
于宏, 王孟亮, 刘希建, 董静怡, 王丹丹, 解志红, 余义发. 花生根际促生复合菌剂对连作花生生理生化指标和根际细菌群落的影响[J]. 微生物学报, 2024, 64(4): 1233-1248.
Yu Hong, Wang Mengliang, Liu Xijian, Dong Jingyi, Wang Dandan, Xie Zhihong, Yu Yifa. Effects of a compound inoculant of peanut growth-promoting rhizobacteria on physiological and biochemical indexes of peanut plants in a continuous cropping system and rhizosphere bacterial community[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024, 64(4): 1233-1248.
花生根际促生复合菌剂对连作花生生理生化指标和根际细菌群落的影响
1. 山东农业大学资源与环境学院, 山东 泰安 271018;
2. 南宁汉和生物科技股份有限公司, 广西 南宁 201315
2. 南宁汉和生物科技股份有限公司, 广西 南宁 201315
摘要：[目的] 利用多功能根际促生菌剂促进花生生长，缓解连作障碍对花生的生长抑制。[方法] 从10年连作花生根际土中筛选根际微生物，测定其促生及拮抗能力，并经16S rRNA基因测序确定菌株分类。选取3株功能互补且相互之间无生长抑制的根际促生菌制备微生物复合菌剂，利用发芽及盆栽试验验证微生物复合菌剂的促生效应。利用高通量测序技术对花生根际土壤细菌的16S rRNA基因的V3−V4区进行测序分析。[结果] 从连作花生根际中共筛选获得37株具有促生及抑制植物病原菌生长能力的根际促生菌，选取3株制备微生物复合菌剂。与空白对照相比，复合菌剂显著提升花生发芽率13.22%；与单独使用根际促生菌相比，复合菌剂显著提升花生发芽率分别为6.99%、7.51%、8.87%。施用复合菌剂对花生根系形态、根瘤数量、叶绿素含量、植株光合参数和植株抗氧化酶活均有显著促进作用，花生根系总长、根尖数、主根直径、根系体积和根系活力分别增加了43.50%、49.31%、15.11%、16.92%和112.16%；花生苗期、花针期叶片叶绿素含量和光合作用均得到显著的提高；花生根瘤数量每株增加34个。施用复合菌剂后对花生的根际细菌多样性影响并不显著，在门水平上的优势菌门变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)和拟杆菌门(Bacteroidota)占70%以上。在属水平上新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是优势菌属。[结论] 本研究研制的花生根际促生复合菌剂可有效促进花生种子发芽、花生根系生长、提高叶片叶绿素含量以及促进植物光合作用，为缓解花生连作障碍及丰产增收提供有效的技术支持。
关键词：花生 根际促生菌 复合菌剂 连作障碍 促生
Effects of a compound inoculant of peanut growth-promoting rhizobacteria on physiological and biochemical indexes of peanut plants in a continuous cropping system and rhizosphere bacterial community
1. College of Resources and Environment, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, Shandong, China;
2. Nanning Hanhe Biotechnology Co., Ltd., Nanning 201315, Guangxi, China
2. Nanning Hanhe Biotechnology Co., Ltd., Nanning 201315, Guangxi, China
Abstract: [Objective] To apply multifunctional plant growth-promoting rhizobacteria to enhance peanut growth and mitigate the inhibitory effects caused by continuous cropping. [Methods] Plant growth-promoting rhizobacteria were screened from the rhizosphere soil of peanut plants in a system with continuous cropping for ten years, and their growth-promoting and antagonistic abilities were determined. The strains were identified by 16S rRNA gene sequencing. Three plant growth-promoting rhizobacterial strains with complementary functions and no growth inhibition between each other were selected to prepare a compound microbial inoculant, the plant growth-promoting effect of which was examined by seed germination and pot experiments. High-throughput sequencing was carried out for the V3–V4 region of bacterial 16S rRNA gene. [Results] A total of 37 plant growth-promoting rhizobacterial strains capable of promoting plant growth and inhibiting pathogen growth were screened from the rhizosphere of peanut plants in a continuous cropping system. Three strains were selected to prepare the compound inoculant. Compared with the blank control, the compound inoculant increased the germination rate of peanut by 13.22%. Compared with the treatments with the three strains alone, the compound inoculant increased the germination rate by 6.99%, 7.51%, and 8.87%, respectively. The application of the compound inoculant had significant promoting effects on the root morphology, number of nodules, chlorophyll relative content (SPAD), photosynthetic parameters, and antioxidant enzyme activity of peanut plants. Specifically, it increased the total root length, number of root tips, taproot diameter, root volume, and root activity by 43.50%, 49.31%, 15.11%, 16.92%, and 112.16%, respectively. The application of the compound inoculant significantly increased the leaf SPAD value and promoted the photosynthesis of peanut plants at seedling stage and flowering stage. Furthermore, it increased the number of root nodules by 34 nodules per plant. However, the application of the compound inoculant had no significant effect on the bacterial diversity in peanut rhizosphere. The dominant phyla were Proteobacteria, Actinobacteriota, and Bacteroidota, accounting for more than 70%. Novosphingobium and Sphingomonas were the dominant genera. [Conclusion] The compound inoculant of plant growth-promoting rhizobacteria improved the seed germination, root growth, leaf SPAD value, and photosynthesis of peanut plants, providing technical support for alleviating continuous cropping obstacles and promoting the healthy growth of peanut plants.
Keywords:
peanut plant growth-promoting rhizobacteria compound bacterial inoculant continuous cropping obstacles growth promotion
花生是我国主要油料作物、经济作物，其种植面积次于大豆和油菜籽，位居第三，产量仅次于大豆，居第二位[1-2]。近年来，全球花生种植面积、产量持续增长。2022年中国花生总种植面积4.75×105 hm2，总产量1 820万t，每公顷产量为3 831.15 kg。由于我国耕地资源有限，且受到气候条件、土壤质量和种植习惯的影响，导致我国连作花生种植面积不断增加。因此，解决花生连作障碍成为一项迫切需要解决的问题。连续种植花生会导致产量降低和品质变差，主要与病原菌富集、营养元素缺乏等因素相关[3-4]。
为防治花生连作障碍可采取多种措施，包括深耕翻土、重视有机肥的施用、轮作、覆膜栽培以及有益微生物的配施等方式[5-6]。近年来，采用有益微生物缓解花生连作障碍取得了显著成效。崔利等[7]研究报道摩西管柄囊霉(Funneliformis mosseae)可以使花生根际曲霉、镰刀菌和赤霉菌丰度降低，增加细菌盖勒氏菌(Gaiella)丰度，增强连作土壤对致病菌的抵御能力，从而提高花生产量和品质。王丹丹等[8]筛选出芽孢杆菌属(Bacillus sp.) B28根际促生菌可显著缓解酚酸对花生种子发芽的抑制，并明显促进花生幼苗的生长。李丽娜[9]通过光合细菌调理花生连作土壤具有明显的效果。但是单一促生菌存在功能单一、适应能力弱等问题，施用过程中会受到环境的限制。将不同能力的功能菌株组合可得到促生功能更强、更稳定的微生物复合菌剂[10]。研究证明，国内外已经具有优势互补并且功能多样的微生物复合菌剂。刘畅等[11]利用具有溶磷固氮能力的伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.) P10与具有解钾能力的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus) GD12复合配施显著提高了花生的株高和生物量。赵思崎等[12]利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) FH-1与短波单胞菌(Brevundimonas sp.) NYM-3按照1:1的比例混合施用可提升水稻鲜重3.93%−32.90%。
根际促生菌对植物健康生长具有重要意义，目前，针对缓解花生连作障碍的微生物复合菌剂研究较少。本研究通过筛选多功能根际促生菌，配制复合菌剂，验证对花生发芽及生长促生能力，为缓解花生连作障碍提供有效的技术支撑，也对根际促生菌的机制研究提供一定的理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试土壤花生根际土样取自山东省农业科学院连作10年的花生试验田，将花生整株采集，取花生根系1 cm内的根际土，于4 ℃保藏。盆栽土壤样品取自山东农业大学试验站连作10年的花生田，土壤的理化性质如表 1所示。
表 1. 供试土壤理化性质
Table 1. Basic physical and chemical properties of tested soil
| Basic physical and chemical properties | Results |
| pH值pH value | 6.90±0.02 |
| 电导率EC (μs/cm) | 280.12±0.15 |
| 全氮Total nitrogen (g/kg) | 1.64±0.32 |
| 有效磷Olsen-P (mg/kg) | 51.06±0.11 |
| 速效钾Available potassium (mg/kg) | 183.03±0.31 |
| 有机碳Soil organic carbon (g/kg) | 20.51±0.08 |
1.1.2 培养基
LB培养基、无氮(nitrogen free medium, NFM)培养基参考文献[13]配制，无机磷(inorganic phosphorus, PKO)培养基(Pikovaskaia’s)、有机磷培养基参考文献[14]配制，铬天青(chrome azurol S, CAS)培养基参考文献[15]配制。
1.2 根际细菌的分离及筛选取约1 g的花生根系土，将其放置于装有10 mL灭菌的PBS缓冲溶液的离心管中，振荡5 min获得土壤悬浮液。按浓度梯度稀释到10−4、10−5、10−6，吸取100 μL涂布于LB固体培养基上，每个梯度做3次重复，30 ℃培养24 h。
1.2.1 菌株的能力测定固氮能力测定：将分离纯化后的菌株分别接种于无氮固体培养基上，30 ℃培养24 h观察菌株生长情况，确定其是否具有固氮能力。
产铁载体能力测定：采用CAS检测法，记录橙色晕圈的颜色和大小，使用游标卡尺测量单菌落橙色铁载体晕圈直径(D)和菌落直径(d)，通过D/d的比值来判断菌株产铁载体能力[16]。
溶磷能力测定：通过钼锑抗比色法测定培养液中可溶性磷的含量[17]。最后根据有效磷标准曲线计算解磷量。
产生长素吲哚乙酸(3-indoleacetic acid, IAA)能力测定：采用Salkowski比色法测定菌株产IAA能力。反应后红色越深，菌株产IAA能力越强。在530 nm下测定其吸光度，然后根据IAA的标准曲线计算产IAA量。
抑制病原菌能力测定：选取4株植物病原性真菌，采用平板对峙法进行生长抑制实验，通过观察拮抗圈的大小，检测目标根际促生菌对植物病原菌的生长抑制活性。4株植物病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢菌(Fungi imperficti)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)和疫霉菌(Phytophthora capsici)。
1.2.2 菌株的分子生物学鉴定提取菌株基因组DNA，使用引物对27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1429R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增其16S rRNA基因序列，PCR预混液体系(50 μL)：2×PCR缓冲液25 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物各1.25 μL，用dd H2O补至50 μL。反应条件：94 ℃预热3 min；90 ℃变性30 s，58 ℃复性30 s，35个循环；72 ℃延伸90 s，10 ℃保存。将所得产物送青岛睿博兴科生物技术有限公司测序。将所得序列上传至EzBioCloud网站数据库与已知序列进行比对[18]，选取相关序列利用MEGA X采用邻接法(neighbor-joining)绘制系统发育树，自展值为1 000次[19]。
1.3 复合菌剂的制备 1.3.1 根际促生菌拮抗性验证选择3株根际促生菌制备复合菌剂，挑取单菌落于LB固体培养基上交叉划线，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察是否存在生长抑制。
1.3.2 复合菌剂的配制将3株促生菌分别在LB固体培养基中活化，然后挑取单菌落接种到LB液体培养基的试管中，37 ℃、180 r/min培养至OD600为0.8，将种子液按照1%的量接种到200 mL LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养12 h，无菌PBS缓冲溶液将其洗涤3次后重悬，按照1:1:1的比例混合得到微生物复合菌剂。
1.4 试验设计 1.4.1 花生发芽试验促生细菌：细菌在OD600为0.8时，5 000 r/min离心3 min，收集菌体，菌体用磷酸缓冲溶液清洗3次后重悬，接种量为1%。
CK为只加入无菌水的空白对照。设置4个处理，分别为T1、T2、T3、T4。T1、T2、T3是在CK的基础上分别加入筛选到的促生细菌，T4为复合菌剂。每个处理20粒(已消毒)种子，设置3次重复，培养4 d。
发芽指标测定：以露白 > 1/2种子长为标准。
发芽率(势)=(发芽种子数/供试种子数)× 100%。
1.4.2 花生盆栽试验盆栽试验于2023年4月23日在山东农业大学试验田温室进行。盆栽试验采用高17 cm、上直径19 cm、底直径14 cm的花盆，每盆装入土壤、蛭石、珍珠岩的比例为3:1:1。
将活化好的菌株菌液统一调节OD600值为0.8，每盆加入37.5 mL菌液，将菌液与土壤充分混合后进行花生移苗。共2个试验处理，分别为CK (不做任何处理)、T4 (加入37.5 mL复合菌剂菌液)，每个处理设置5个重复，每盆种1株花生。花生种子催芽7 d，催芽结束后选取长势相同植株移栽到花盆中，在花盆中培养45 d后测定花生根系形态、根瘤数量、花生叶片叶绿素含量(chlorophyll relative content, SPAD)、光合参数、花生酶活。
花生根系形态测定：采用植物根系分析仪(山东方科仪器有限公司)扫描花生根系，扫描后保存图像，采用WinRHIZO根系分析系统对根系扫描图像进行根系总长、根尖数、主根直径和根系体积等分析。
花生根系活力测定：使用植物根系活力检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)测定(TTC比色法)。
花生根瘤及鲜重测定：整株取出后将根瘤摘下，统计根瘤个数并称鲜重。
花生叶片SPAD值测定：通过叶绿素分析仪进行测定花生苗期、花针期的叶片SPAD值。
花生酶活测定：超氧化歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性按照超氧化歧化酶(SOD)试剂盒、过氧化物酶(POD)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书测定。
花生光合参数的测定：使用光合仪测定。
1.5 数据处理利用Microsoft Excel进行数据分析与图表制作，利用SPSS 13.0进行最小差异显著性(least-significant difference, LSD)及相关性分析。
2 结果与分析 2.1 根际促生菌的筛选从连作花生根际土中共筛选获得37株根际细菌，其中30株具有固氮能力，2株为产铁载体菌株，5株为解磷菌株，11株为产IAA菌株，9株为抗病原菌菌株。从筛选出的根际细菌中挑选2株具有较强溶磷、固氮、产铁载体和产IAA功能菌株J28和J1-3 (表 2)，以及1株具有拮抗植物病原菌能力的菌株T14 (表 3、图 1)，进行进一步验证。
表 2. 菌株促生功能鉴定
Table 2. Identification of growth promoting function of strain
| 菌株 Strain |
固氮能力 Nitrogen fixing capacity |
产铁载体能力 Siderophore capacity (cm) |
溶有机磷能力 Organophosphates solubility (mg/mL) |
溶无机磷能力 Inorganic phosphate solubility (mg/mL) |
IAA产率 IAA production (mg/L) |
| J28 | + | 3.22±0.27 | 161.00±0.23 | 209.00±0.15 | 11.00±0.14 |
| J1-3 | + | 1.91±0.14 | 228.00±0.03 | 183.00±0.12 | 56.68±0.12 |
| T14 | + | − | 157.00±0.13 | − | − |
| +: This function exists; −: No this function. | |||||
表 3. 菌株拮抗能力的测定
Table 3. Determination of antagonistic ability of strains
| 菌株 Strain |
尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum |
腐皮镰孢菌 Fungi imperficti |
曲霉菌 Aspergillus flavus |
疫霉菌 Phytophthora capsici |
| T14 | ++ | ++ | + | ++ |
| J28 | − | − | − | − |
| J1-3 | − | − | − | − |
| ++: Strong inhibition (the radius > 2 mm); +: Inhibition (< 2 mm); −: No inhibition. | ||||
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| 图 1 T14对4种病原菌的拮抗图 Figure 1 Antagonism of T14 against four pathogens. |
2.2 根际促生菌分子生物学鉴定
如图 2所示经过核苷酸序列比对，发现菌株J1-3与变形假单胞杆菌(Pseudomonas plecoglossicida)的16S rRNA基因序列相似度最高；菌株J28与分散泛菌(Pantoea dispersa)的16S rRNA基因序列相似度最高；菌株T14与特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)的16S rRNA基因序列相似度最高，相似度均高于99%。
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| 图 2 三株菌的系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree of three strains. The GenBank accession numbers of aligned sequences are shown before the name of the strain. Values at branch nodes represent bootstrap value. The length of branch represents the evolutionary distance. 序号为序列GenBank登录号；分支点数值代表进化树bootstrap值；分支长度代表进化距离 |
2.3 菌株拮抗实验
将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis) T14、分散泛菌(Pantoea dispersa) J28、变形假单胞杆菌(Pseudomonas plecoglossicida) J1-3交叉划线验证菌株之间的拮抗性，结果如图 3所示，3个菌株之间未出现两两拮抗的现象。
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| 图 3 三株菌间的拮抗验证 Figure 3 Verification of antagonism between three strains. |
2.4 根际促生菌对花生发芽的影响
花生发芽试验如图 4所示，不同促生菌及复合菌剂对花生种子萌发的影响如图 5所示，J1-3 (T1)、J28 (T2)、T14 (T3)与CK相比在相同的外界条件下对花生发芽具有显著的促进作用。各处理24 h后开始发芽，生长到96 h后观察花生种子发芽情况。结果发现清水处理的空白对照花生发芽率为82.62%，菌株J1-3处理组(T1)花生发芽率为87.41%，菌株J28处理组(T2)花生发芽率为87.00%，菌株T14处理组(T3)花生发芽率为85.91%，复合菌剂处理组(T4)花生发芽率为93.53%。结果表明这3株促生菌均能促进花生种子的萌发，并且按比例混合后能够显著地提高花生的发芽率。
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| 图 4 不同处理下花生的发芽情况 Figure 4 Germination of peanuts with different treatments. |
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| 图 5 不同菌剂处理下花生的发芽率 Figure 5 Germination rate of peanut treated with different bacteria. Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05). |
2.5 复合菌剂对花生植株的影响 2.5.1 复合菌剂对花生叶片SPAD值及光合参数的影响
花生盆栽试验如图 6所示，叶片SPAD值的变化如图 7所示，苗期、花针期添加复合菌剂后SPAD含量分别增加了5.30%、7.50%，说明微生物复合菌剂能够显著促进花生叶绿素含量的积累。
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| 图 6 花生盆栽试验 Figure 6 The pot experiment of peanut. |
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| 图 7 不同时期花生叶片SPAD值 Figure 7 SPAD values of peanut leaves in different periods. Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05). |
花生不同时期光合参数如图 8所示，施用复合菌剂后花生光合参数除胞间二氧化碳含量外，气孔导度、净光合速率、蒸腾速率均显著增加，其中在苗期分别增加了161.71%、52.53%、108.34%；花针期分别增加了27.92%、6.61%、14.70%。说明复合菌剂可显著提高花生植株的光合速率，促进花生生长。
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| 图 8 施用微生物菌剂后不同时期的光合参数 Figure 8 Photosynthetic parameters of different periods after application of microbial inoculants. A: Stomatal conductance. B: Room carbon dioxide. C: Transpiration rate. D: Net photosynthetic rate. Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05). |
2.5.2 复合菌剂对花生根际形态的影响
复合菌剂对花生根系形态影响显著，施用复合菌剂后与对照处理相比花生根系总长、根尖数、主根直径和根系体积分别增加了43.50%、49.31%、15.11%和16.92% (表 4)。总体来看施用复合菌剂显著促进了花生根系的生长。
表 4. 复合菌剂对花生根系的影响
Table 4. Effects of compound bacteria on peanut root morphology
| 处理 Treatment |
根系总长 Total root length (cm) |
根尖数(株/个) Number of apex (plant/piece) |
主根直径 Taproot diameter (mm) |
根系体积 Root volume (cm3) |
| CK | 344.10±0.24b | 754.00±0.54b | 0.65±0.12b | 378.70±0.21b |
| T4 | 493.80±0.15a | 1 126.00±0.43a | 0.76±0.09a | 435.91±0.22a |
| Different lowercase letters in a column indicate significant differences among treatments at (P < 0.05), respectively. | ||||
2.5.3 复合菌剂对花生根瘤数目及鲜重的影响
图 9为花生根系形态扫描图，如图 10所示，施用复合菌剂后花生根瘤数显著增加，较对照相比根瘤数每株平均增加了34个，根瘤鲜重增加了25.82%，根系活力增加了112.16%。总体来看，施用复合菌剂后提高了根系活力，促进根系生长。
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| 图 9 复合菌剂对花生根系形态的影响 Figure 9 Effect of compound bacteria on peanut root morphology. |
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| 图 10 复合菌剂对花生根系的影响 Figure 10 Effects of compound inoculants on peanut roots. A: Number of nodules. B: Fresh weight of nodules. C: Root activity. Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05). |
2.6 复合菌剂对花生植株酶活的影响
POD、SOD和CAT是生物适应和抵抗逆境胁迫的重要酶，也是清除活性氧的关键酶，被称为抗氧化酶。如图 11所示施用微生物复合菌剂后，显著提高花生植物抗氧化酶的活性，POD、SOD和CAT酶活分别提高了30.51%、12.60%、57.62%。这说明微生物复合菌剂可以提高花生对外界环境胁迫的适应性，使植株细胞免受外界环境的伤害。
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| 图 11 复合菌剂对花生植株酶活的影响 Figure 11 Effect of compound bacteria on peanut plant enzyme activity. A: SOD. B: POD. C: CAT. Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05). |
2.7 复合菌剂对花生根际土壤微生物的影响 2.7.1 对根际土壤微生物α多样性和β多样性的影响
α多样性分析表明，复合菌剂处理后，根际细菌的Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数无显著差异，Goods_coverage指数显著低于对照处理(图 12)。Goods_coverage指数越高说明物种丰富度越低，这表明施用复合菌剂后显著提高了物种的丰富度。
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| 图 12 不同处理花生根际细菌α多样性 Figure 12 Alpha diversity of bacterial in rhizosphere under different treatments. *: Existence significance, P≤0.05. |
对花生根际土壤样本进行主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)，结果如图 13A所示，PC1为82.40%，PC2为7.80%，共解释了细菌群落结构差异的90%。两个投影之间的距离越近表明两个样本群里的结构越相似。从图 13A可以看出施用复合菌剂后花生根际细菌群落组成与对照处理相比有一定的相似度。从图 13B聚类分析看出施用复合菌剂与对照处理分成了不同的分支，样本间的分支长度越短，说明两样本越相似。对照组分支较复合菌剂处理的分支短，说明对照组3个分支之间样本相似度较高。而复合菌剂处理后两个分支之间较长说明组间具有一定的差异，但与对照处理之间的差距不大，说明施用复合菌剂和对照组细菌群落组成差异不大。因此施用微生物菌剂后根际土壤细菌群落具有一定的相似性。
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| 图 13 不同处理花生根际细菌β多样性分析(A)和PCA分析(B)层次聚类分析 Figure 13 Beta diversity analysis of rhizosphere bacteria under different treatments (A) and PCA analysis (B) hierarchical cluster analysis. |
2.7.2 对根际土壤微生物组成分析
对盆栽花生根际土壤微生物分类组学成分分析发现，在门水平变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、拟杆菌门(Bacteroidota)是优势菌门，占70%以上。如图 14A所示，施用复合菌剂后变形菌门、拟杆菌门相对丰度增加。从属水平进行分析发现新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Allorhizobium、Burkholderia和溶杆菌属(Lysobacter)是优势菌属，如图 14B所示，施用复合菌剂后Novosphingobium、Sphingomonas属细菌相对丰度降低，Lysobacter属相对丰度增加。
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| 图 14 花生根际细菌门水平(A)和属水平(B)的相对丰度 Figure 14 Relative abundance at the phyla level (A) and genus level (B) in the rhizosphere. |
3 讨论
根际促生菌通过特定的功能来促进植物生长的研究已有很多报道，Preston[20]提出许多与植物相关的假单胞菌通过抑制病原微生物、合成植物激素和促进植物抗病性的增加来促进植物生长。Purtschert-Montenegro等[21]研究发现恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)定殖与植物根际能够借助IVB型分泌系统(type IVB secretion system, T4BSS)杀死多种土壤和植物相关的革兰氏阴性细菌。Jeon等[22]的研究发现内生的Bacillus tequilensis可以提高藻类细胞密度、干重、叶绿素含量和虾青素含量。Azeem等[23]的研究发现沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis) PM22促进植物生长和耐盐的能力，原因是B. safensis PM22在盐胁迫的条件下产生大量的胞外多糖、IAA、铁载体和1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase, ACC-脱氨酶)。Jiang等[24]研究发现Pantoea dispersa可以抑制甘薯植株中的黑腐病，突出了其作为生物防治剂的潜力。Singh等[25]首次报道了Pantoea dispersa AA7和Enterobacter asburiae BY4对甘蔗生长的促进作用。本研究从连作花生根际土中筛选出的3株根际促生菌株J1-3、J28、T14，经鉴定分别为Pseudomonas plecoglossicida、Pantoea dispersa及Bacillus tequilensis，均具有促进花生种子发芽及植株生长的能力，具有较好的应用前景。
研究发现使用植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)菌株不仅能有效提高植物产量，而且还能有效防控植物病害[26]。衣政凯[27]筛选获得的Bacillus amyloliquefaciens 41B-1能有效抑制花生白绢病病原菌。杨倩倩[28]从花生根际土壤中筛选出的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) Y14对花生白绢病病原菌具有显著拮抗作用，抑菌率为67.10%，防病效果显著。与上述研究相同，本研究筛选出的芽孢杆菌对病原菌也具有显著的拮抗作用，与上述研究结果不同的是B. tequilensis T14对病原真菌的拮抗作用具有广泛性，如表 3所示，可同时抑制多种病原菌。然而，T14不具有溶无机磷、产铁载体、产IAA的功能，这意味着它不能利用溶无机磷途径、产铁载体以及产IAA途径来抑制病原真菌的生长，其抑制病原真菌的能力可归因于利用其他分子途径来抑制真菌病原体的生长。本研究结果与Baard等[29]的研究结果相同，B. tequilensis具有拮抗4种病原真菌的能力。
微生物复合菌剂克服了单一菌剂目标单一、功能单一的缺点，它具有功能全面、配伍合理、经济效益高的优点。前人研究表明，微生物复合菌剂可有效地改善作物品质并促进作物生长。如赵晓玲[30]研究发现，叶面喷施EM微生物菌剂可以使辣椒产量提高44.05%。何嘉等[31]研究表明，使用丛枝菌根真菌和解淀粉芽孢杆菌复合菌剂可使枸杞产量提高46.22%。刘畅等[11]研究表明B. flexus GD12和Burkholderia sp. P10复合对花生生长有显著促进作用，与对照组相比花生株高增加37.60%。何飞燕[32]认为，微生物复合菌剂在花生不同生长期对花生叶片SPAD值均具有提高的作用。本研究与上述结果相同，将芽孢杆菌(Bacillus tequilensis) T14、分散泛菌(Pantoea dispersa) J28、变形假单胞杆菌(Pseudomonas plecoglossicida) J1-3等比例混合显著促进花生根系的生长、增加花生根瘤数量以及提高叶片SPAD值，可有效提高花生抗逆性。与上述结果不同的是，本研究中利用了促生效果较强的分散泛菌进行复合菌剂的制备。本研究在探讨微生物复合菌剂对连作花生生长的影响中菌株配比单一，后续将进一步优化不同菌株之间的配施比例。
4 结论本研究筛选出3株功能较强的菌株，经鉴定为变形假单胞杆菌属(Pseudomonas plecoglossicida) J1-3、分散泛菌属(Pantoea dispersa) J28、芽孢杆菌属菌(Bacillus tequilensis) T14，3株菌复合菌剂功能最强，对花生的发芽、植株的生长起到显著的促进作用，并未改变花生根际细菌群落的多样性。本研究为生物缓解花生连作障碍提供理论依据，为缓解花生连作障碍及促进花生生长提供了良好的菌种资源。
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