微生物学报  2024, Vol. 64 Issue (4): 1306-1321   DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230729.
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20230729
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会

文章信息

高贻宙, 何四明, 王艺潼, 李海博, 王雨晴, 吴志宏. 2024
GAO Yizhou, HE Siming, WANG Yitong, LI Haibo, WANG Yuqing, WU Zhihong.
层出镰刀菌乌头酸酶家族的功能研究
Functions of the aconitase family in Fusarium proliferatum
微生物学报, 64(4): 1306-1321
Acta Microbiologica Sinica, 64(4): 1306-1321

文章历史

收稿日期：2023-11-29
网络出版日期：2024-01-26
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引用本文
高贻宙, 何四明, 王艺潼, 李海博, 王雨晴, 吴志宏. 层出镰刀菌乌头酸酶家族的功能研究[J]. 微生物学报, 2024, 64(4): 1306-1321.
Gao Yizhou, He Siming, Wang Yitong, Li Haibo, Wang Yuqing, Wu Zhihong. Functions of the aconitase family in Fusarium proliferatum[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024, 64(4): 1306-1321.
层出镰刀菌乌头酸酶家族的功能研究
高贻宙 #, 何四明 #, 王艺潼 , 李海博 , 王雨晴 , 吴志宏     
浙江科技学院生物与化学工程学院, 浙江 杭州 310023
收稿日期：2023-11-29；接受日期：2024-01-25；网络出版日期：2024-01-26
基金项目：浙江科技学院人才引进启动经费(F701103M09)；浙江省教育厅一般科研项目(Y202351867)
摘要：[目的] 层出镰刀菌是引起苜蓿根腐病的主要病原菌之一，探究层出镰刀菌中乌头酸酶家族蛋白的功能特性，为深入认识层出镰刀菌基础生理代谢的分子机制提供依据。[方法] 利用hmmsearch工具，对真菌中含有乌头酸酶结构域的蛋白进行检索，并进行系统进化分析；通过实时荧光定量PCR及SWISS MODEL建模技术分别分析FpACO基因的表达模式与蛋白结构；利用同源重组双交换方法构建层出镰刀菌乌头酸酶基因敲除突变体；分析ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2敲除突变体的生长、产孢、孢子形态、环境胁迫响应及致病力等表型变化；进一步测定敲除突变体中线粒体代谢相关生理生化指标的变化情况。[结果] FpACO4-1与FpACO4-2在产孢及孢子形态发生中发挥作用；FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2参与调控层出镰刀菌对细胞壁胁迫及金属离子胁迫的敏感性；FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2影响线粒体代谢，包括总乌头酸酶活性、ATP含量、过氧化氢含量及三羧酸循环关键基因表达等。[结论] 乌头酸酶家族参与调控层出镰刀菌产孢、孢子形态分化、细胞壁胁迫及金属离子胁迫响应和线粒体代谢等过程。
关键词：层出镰刀菌    苜蓿根腐病    乌头酸水合酶    线粒体代谢    
Functions of the aconitase family in Fusarium proliferatum
GAO Yizhou #, HE Siming #, WANG Yitong , LI Haibo , WANG Yuqing , WU Zhihong     
School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science & Technology, Hangzhou 310023, Zhejiang, China
Received: 29 November 2023; Accepted: 25 January 2024; Published online: 26 January 2024
*Corresponding author: WU Zhihong, E-mail: wulab_zust@163.com.
Foundation item: This work was supported by the Scientific Research Foundation of Zhejiang University of Science & Technology (F701103M09) and the General Scientific Research Project from the Education Department of Zhejiang Province (Y202351867)
#These authors contributed equally to this work.
Abstract: [Objective] Fusarium proliferatum is one of the major pathogens causing root rot of alfalfa. This study aims to investigate the function of the aconitase family in F. proliferatum and give insights into the molecular mechanisms underlying the physiological metabolism of this pathogen. [Methods] We employed the hmmsearch tool to identify the proteins containing the aconitase domain in F. proliferatum and then carried out the phylogenetic analysis. real-time PCR and SWISS-MODEL were employed to analyze the expression profiles of FpACO genes and the protein structures, respectively. The homologous recombination method was used to construct the FpACO-deleted mutants of F. proliferatum. Furthermore, we explored the growth, sporulation, spore morphology, stress responses, and pathogenicity of ΔFpACO3, ΔFpACO4-1, and ΔFpACO4-2 and measured the mitochondrial metabolism indicators of the mutants. [Results] FpACO4-1 and FpACO4-2 were involved in sporulation and spore morphogenesis. FpACO3, FpACO4-1, and FpACO4-2 were responsible for regulating the sensitivity of F. proliferatum to cell wall stress and metal ion stress. Moreover, FpACO3, FpACO4-1, and FpACO4-2 affected the mitochondrial metabolism indicators, including the total aconitase activity, the ATP level, the hydrogen peroxide level, and the expression of key genes in the tricarboxylic acid cycle. [Conclusion] The aconitase family members are involved in the regulation of the processes such as sporulation, spore morphogenesis, response to cell wall stress and metal ion stress, and mitochondrial metabolism in F. proliferatum.
Keywords: Fusarium proliferatum    root rot of alfalfa    aconitase    mitochondrial metabolism    

苜蓿(Medicago sativa)是一种多年生豆科植物，具有较高的营养价值、良好的耐旱性与环境适应性、产量较高，作为一种优良牧草在畜牧业中具有重要地位，且苜蓿具有固氮效应，可提升土壤肥力，具有显著的生态效益，在国内被广泛种植[1]。然而，苜蓿根腐病严重影响苜蓿产量，对我国苜蓿种植业造成巨大的经济损失，该病害由镰刀菌(Fusarium spp.)、腐霉菌(Pythium spp.)及立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等病原菌引起，其中，层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)为优势致病菌[2-3]。作为一种寄主范围广泛的土传真菌，层出镰刀菌不仅危害苜蓿，还可侵染其他重要农作物，如水稻、小麦、玉米和大豆等。此外，层出镰刀菌可分泌单端孢霉烯毒素、伏马菌素、串珠镰孢菌素等真菌毒素，污染谷物饲料，危害人畜健康[4]，但关于其致病机理的深入研究相对不足，因此对层出镰刀菌的生物学特性及其致病性分子机制的研究对于制定有效的病害防治策略、保障农业生产和食品安全至关重要。

乌头酸酶(aconitase, ACO)是一种包含[4Fe−4S]簇的铁硫蛋白，具有两种同工酶，分别为细胞质乌头酸酶和线粒体乌头酸酶[5]。细胞质乌头酸酶在低铁状态下可与铁响应元件(iron-responsive elements, IRE)结合，影响编码铁蛋白基因mRNA的翻译过程，而线粒体乌头酸酶是三羧酸循环中的关键酶之一，负责将柠檬酸转化为异柠檬酸[6]。乌头酸酶在不同物种中均具有重要的生物学功能，人体线粒体乌头酸酶缺陷影响小脑和视网膜发育，且与多种神经退行性疾病有关，胞质乌头酸酶则参与维持脂肪细胞分化[7-8]。在梨、柑橘等果实中，乌头酸酶的活性与果实中柠檬酸含量密切相关，影响果实酸性风味形成[9-10]。此外，在植物抗病信号转导中，一氧化氮可使乌头酸酶失活，中断三羧酸循环，减少活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，从而调控植物抗病性[11-12]。微生物中乌头酸酶的生物学功能也逐步被揭示：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)乌头酸酶的失活抑制了其指数生长后期的增殖[13-14]；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中乌头酸酶基因CitB与孢子形成密切相关[15]；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)中乌头酸酶缺陷突变体ΔacnB表现出运动性下降、对氧化胁迫更加敏感等表型变化[16]；此外，植物病原细菌野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) acnB敲除突变体诱导寄主细胞坏死的能力下降，致病力减弱[17]；水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) citB的敲除影响其运动性、致病力及氧化胁迫响应能力[18]。然而，目前尚无关于乌头酸酶在植物病原真菌中的功能报道，在基本生物学过程中发挥的作用也不明确。

本研究通过结构域搜索、同源比对等方法筛选出层出镰刀菌中5个编码乌头酶的基因，构建了3个敲除突变体，通过对敲除突变体的表型观察，明确了乌头酸酶家族在层出镰刀菌产孢、孢子形态分化、环境胁迫响应中发挥的功能，并分析了其对三羧酸循环、线粒体代谢的影响。本研究结果为深入探究乌头酸酶家族在真菌中的生物学功能及作用机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株及植物材料

层出镰刀菌野生型菌株HM19-1-1由中国农业科学院草原研究所分离鉴定[2]。用于致病力测定的苜蓿品种为阿尔冈金。

1.1.2 主要试剂

PCR扩增使用的高保真酶Phanta Max及逆转录(HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis)、荧光定量PCR (ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix)使用的酶均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；敲除转化子筛选所使用的潮霉素B试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司；原生质体制备所使用的溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶购自上海瑞永生物科技有限公司；葡萄糖、NaCl等其他常规化学试剂均购自中国医药集团有限公司；ATP测定试剂盒、过氧化氢含量测定试剂盒均购自南京碧云天生物技术有限公司；乌头酸酶活性测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 乌头酸酶家族蛋白的生物信息学分析

从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载40种真菌的蛋白数据，作为蛋白数据库。使用HMMER3.0 (http://hmmer.janelia.org/)软件的hmmsearch程序，以乌头酸酶保守结构域aconitase family的隐马尔可夫模型(PF00330)作为探针，对40种真菌的蛋白数据库进行筛选，E-value设置为1e−04，在40种真菌中筛选具有乌头酸酶结构域的候选蛋白，并下载候选蛋白的序列。利用ClustalW软件对乌头酸酶蛋白进行多重序列比对后，在MEGA 7中使用最大似然法构建系统发育树，设置进化模型为JonesTaylor-Thornton，采用自举法检测，bootstrap值设为1 000。

1.3 层出镰刀菌乌头酸酶家族蛋白的结构分析

使用NPS@：SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)进行层出镰刀菌FpACO蛋白的二级结构分析，统计α螺旋、β折叠、β转角结构在FpACO蛋白中的比例。使用SWISS-MODEL工具(http://swissmodel.expasy.org/)进行蛋白三级结构模型构建，获取蛋白三级结构模型后，使用PyMOL4.6进行可视化处理，标明各类二级结构在蛋白模型中的位置。

1.4 FpACO家族基因的敲除及回补

基于同源重组双交换原理进行FpACO家族基因的敲除。首先通过PCR技术，使用特异性

引物从基因组DNA中扩增出目的基因上、下游各1 000 bp左右的同源臂序列，将其与潮霉素抗性基因片段通过Double-joint PCR技术融合为1个敲除大片段后[19]，将回收纯化的敲除大片段采用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)介导的原生质体转化法转入层出镰刀菌HM19-1-1菌株中，过程参照Ferrara等[20]的方法进行，将转化混合液加入再生培养基(regeneration medium, RM)中过夜复苏细胞壁后，使用加有潮霉素的平板对转化子进行筛选并提取转化子DNA进行后续PCR验证，引物信息见表 1。回补菌株的构建则通过将启动子片段、mcherry荧光片段、FpACO家族基因片段及G418硫酸盐(G418 sulfate, G418)抗性片段组成的回补大片段转化到相应敲除突变体中，使用G418进行回补转化子的筛选。

表 1. 本研究所用引物 Table 1. Primers used in this study
Primer name Forward sequence (5′→3′) Reverse sequence (5′→3′)
FpACO3-5′UTR GAAGCAGACATTCGCAGAG CAAAATAGGCATTGATGTGTT
GACCTCCTAGTAGGCAACGGCACCA
FpACO3-3′UTR CGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTA
GAAATGCCGAATGATAGATTG		 ACATTGACGAGGAAGCAAA
FpACO3-QC CGTGCGACGATTTCTTCAA GAGGATAAGGCGACTGTGC
FpACO3-MD ATGGTTTCAATGGAGGTCG TTATATGCCCTTAGACAGCA
FpACO4-1-5′UTR ATTCATAACTGCCGTAACCC CAAAATAGGCATTGATGTGTTGACCT
CCTAGCCCGAACTCAGAAACC
FpACO4-1-3′UTR CGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAG
TCGCCATAATCTCACCAAT		 ATCGCCTCCAGAACTACCT
FpACO4-1-QC TTTCCCAGTCTTGATAACCG TTGCCATTTCATCTTGTGC
FpACO4-1-MD ATGCCGCTGACAGCATCAC TCAAGCCGTGCTGCCCAA
FpACO4-2-5′UTR AGGACGCTTGCACGGTTAG CAAAATAGGCATTGATGTGTTGACCT
CCTGCCGAGCAGGTAAGGATT
FpACO4-2-3′UTR CGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAG
GTTGAGCGCCCATGTCTTT		 GAATAGCGGCAGCCTTGT
FpACO4-2-QC TTCATAATGCGGCTTAGAGG TGGGCACTGAGGAGATACG
FpACO4-2-MD ATGCTTGCTACACGCCAGGTC TTAGTTCTTGGTGGCCTTGGC
HPH GGAGGTCAACACATCAATGCCTATT GGAGGTCAACACATCAATGCCTATT
FpACO1-1-RT TTCACTGGCATTCTTCCCCC AAGCGCTCGTCGATAGTGAG
FpACO1-2-RT TCCAAAGATCGTGGGTGGTG AGTGCCGAGTCTGACACAAG
FpACO3-RT GTTGCCACTGTCGGTCTGTA ACCGCGTGTTTAGTGGGAAT
FpACO4-1-RT TCTTGGGTGTTCGTCTCACG TCGATGACCTTGCCCTTTCC
FpACO4-2-RT CGTGGCAAGAGCTACCTCAA GTGGACAGTAGTGGGGTTGG
Fpactin-RT CCCCATTGAGCACGGTGTTG CTCACGGTTGGACTTGGGGT
Promoter CCCATCAACCAAATTCGAG ATCCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGA
CAAATGTTCGTGAGAATTAA
mcherry ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGAT CTTGTACAGCTCGTCCATGC
G418 GGAGGTCAACACATCAATGCT TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG
FpACO3-C GCATGGACGAGCTGTACAAGATGGTT
TCAATGGAGGTCG		 AGCATTGATGTGTTGACCTCCTATGC
CCTTAGACAGCA
FpACO4-1-C GCATGGACGAGCTGTACAAGATGCCG
CTGACAGCATCAC		 AGCATTGATGTGTTGACCTCCAGCCG
TGCTGCCCAA
FpACO4-2-C GCATGGACGAGCTGTACAAGATGCTT
GCTACACGCCAGGTC		 AGCATTGATGTGTTGACCTCCGTTCT
TGGTGGCCTTGGC
FpIdh-RT AGCAGATCGAGGTCTCTGGT GCAGGATACCCTTGAGACCG
FpKgd-RT GAGAAGGGCCTTGTTACCCC TGTTGTCGCGAGCCTTTTTG
FpScs-RT CATTCGACAATGGGTTCCGC GCCACCAACACCTTTTCGAC
FpSdh-RT TGCAGACTGATGTCAGCGTT TCCAGATCATGCTGCGATCC
FpFum-RT CTGTTATGCACATCGCTGCC GCGTCCTGGAGATGAGTACG
FpMdh-RT TGGTTTCCGATTTGCCGAGA GAAGAAGTCGGTGCCAGTCA
FpCit-RT TCCCGCGTACATGAATACCG GCTCTTCTCGACCAACTGCT
表选项

1.5 层出镰刀菌基本生物学表型分析

层出镰刀菌营养生长速率的测定采用平板十字交叉测量法，将待测菌株的菌块放置于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)平板上，于26 ℃培养箱中倒置培养7 d后，测量菌落直径。层出镰刀菌的产孢培养于羧甲基纤维素(carboxylmethyl cellulose, CMC)培养基中进行，将待测菌株的菌饼加入CMC液体培养基后，26 ℃、250 r/min振荡培养，于48 h时在显微镜下进行孢子计数及形态记录。后续将拍摄的孢子形态图片在Image J软件中进行孢子长度统计。层出镰刀菌环境胁迫敏感性测定按照下述方法进行：将待测菌株分别接种到含有0.2%刚果红(congo red, CR)、0.05%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)、0.2%荧光白试剂(calcofluor white, CFW)、2 mol/L NaCl、1.5 mol/L CaCl2、2 mol/L MgCl2的PDA平板上，同时以不含任何胁迫试剂的PDA培养基作为对照，26 ℃培养7 d后统计菌落直径，计算抑制率。

1.6 层出镰刀菌致病力测定

参照孔前前等[21]描述的方法测定层出镰刀菌的致病力。将待测菌株的菌饼接种在1%水琼脂培养基平板上，培养约7−10 d。对苜蓿种子进行1次灭菌水冲洗、3次75%乙醇消毒、1次次氯酸钠溶液消毒和3次灭菌水冲洗后，置于超净工作台中吹干，夹取种子至水琼脂平板上菌落边缘位置，围绕菌落边缘均匀排布1圈，置于26 ℃培养箱内，10 d后观察、记录种子及幼苗的发病程度，计算病情指数。

1.7 层出镰刀菌的基因表达量分析

首先进行样品RNA的提取，将待测菌丝样品收集好后，液氮研磨成粉末状，加入1 mL RNA提取试剂TRIzol中，混匀后加入200 µL氯仿，剧烈振荡片刻后于室温静置10 min，4 ℃、13 200 r/min离心10 min后，小心吸取上清液至新的离心管中，加入200 µL氯仿再次抽提1次后，取上清，加入等体积异丙醇，−20 ℃静置至少30 min，再次离心，弃上清，使用70%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，晾干，溶解RNA沉淀于RNAase free水中。随后立刻进行反转录反应，反转录操作按照HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书进行。cDNA合成后，按照ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix试剂说明，配制总体积为20 µL的反应体系，进行荧光定量PCR分析。

1.8 层出镰刀菌线粒体代谢相关指标测定

FpACO家族基因敲除突变体的总乌头酸酶活性的测定参照试剂盒说明书，将待测菌株的菌丝液氮研磨成粉末状后加入1 mL试剂一中，振荡混匀后于4 ℃、13 200 r/min离心15 min，取上清置于冰上，随后将室温预热的180 µL试剂四与20 µL待测酶液混匀，静置5 min后，测定OD240值。过氧化氢含量测定试验使用过氧化氢检测试剂盒，使用过氧化氢检测裂解液处理菌丝后，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，吸取上清50 µL，加入100 µL过氧化氢检测试剂，吹打混匀后，室温放置30 min，测定OD560值。ATP含量测定试验参照ATP检测试剂盒说明书进行，使用ATP检测裂解液处理菌丝，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，吸取上清待用，依据样品个数取适量的ATP检测试剂，按照1:9的比例用ATP检测试剂稀释液稀释ATP检测试剂，在20 µL待测样品中加入100 µL ATP检测工作液，迅速混匀，至少间隔2 s后，使用化学发光仪测定相对发光强度值(relative light unit, RLU)。

2 结果与分析 2.1 真菌乌头酸酶家族蛋白的系统进化分析

利用hmmsearch工具，搜索出40种真菌中包含乌头酸酶结构域(PF00330)的蛋白，共筛选到155个乌头酸酶蛋白，通过NCBI中CD-search功能对筛选出的乌头酸酶蛋白进行验证，显示所得全部蛋白序列符合乌头酸酶结构域特征。使用MEGA 7进一步构建了真菌乌头酸酶家族的系统发育树，同时将CD-search数据库中的乌头酸酶结构域种类信息体现在系统发育树中，155个蛋白的乌头酸酶结构域可分为3个类型，分别为：H_aconitase、Aconitase_mito及Aconitase_swivel，其中H_aconitase为高乌头酸酶类型(homoaconitase)，主要参与赖氨酸的生物合成[22]。Aconitase_mito为线粒体中参与三羧酸循环的一类乌头酸酶。Aconitase_swivel为乌头酸酶旋转结构域，主要分布在蛋白C端[23]。依据进化树中的亲缘关系及结构域类型，将真菌乌头酸酶分为4组：ACO1、ACO2、ACO3和ACO4，其中ACO1为高乌头酸酶类型，其余3组为线粒体乌头酸酶类型，ACO2组的蛋白大多在C端具有Aconitase_swivel结构域(图 1)。依据上述分类，层出镰刀菌中的5个ACO蛋白分别属于ACO1、ACO3、ACO4类群，将其命名为FpACO1-1 (FPRO_11169)、FpACO1-2 (FPRO_07489)、FpACO3 (FPRO_07808)、FpACO4-1 (FPRO_06900)、FpACO4-2 (FPRO_06391)。

图 1 真菌乌头酸酶家族蛋白系统进化树及保守结构域分析 Figure 1 Phylogenetic tree and conserved domains of the ACO proteins in fungi.
图选项

2.2 FpACO基因的表达模式及蛋白结构分析

FpACO基因在CM平板上及侵染苜蓿幼苗过程中的表达量分析结果显示，这5个FpACO基因均不同程度地受到寄主诱导表达，在侵染状态下表现出显著上调(图 2)。通过NPS@SOPMA工具进行了FpACO蛋白的二级结构预测分析，统计了α螺旋、β折叠、β转角及coil卷曲结构的比例分布，结果显示3类FpACO蛋白之间各二级结构的比例存在较大差异(图 3A)。进一步通过SWISS MODEL工具，基于比较建模法，进行了FpACO蛋白三级结构分析，对模型进行了可视化处理(图 3B)，各模型与模板蛋白的一致性均在80%以上，建模质量评价结果也在0.7以上，表明与模板蛋白的匹配度较高，获取的FpACO蛋白结构模型可靠性较高。结合FpACO蛋白三级结构模型及二级结构比例分析可以看出，FpACO1-1与FpACO1-2虽均属于高乌头酸酶，但结构差异较大，FpACO4-1与FpACO4-2蛋白较为相似，均属于线粒体乌头酸酶，而FpACO3与另外2类乌头酸酶结构并不相似。以上结果表明，层出镰刀菌中的5个FpACO蛋白在结构上归属于不同类型的乌头酸酶，暗示了其功能的多样性。

图 2 层出镰刀菌FpACO家族基因表达模式分析 Figure 2 Expression profiles of FpACO genes in Fusarium proliferatum. Expression of FpACO genes in CM medium and during infection for 4, 10, and 20 days (*: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001). Error bars indicate the mean±SD of three independent replicates.
图选项

图 3 层出镰刀菌FpACO蛋白结构分析 Figure 3 Structural analysis of the FpACO proteins. A: Percentage of the secondary structures of the ACO proteins. B: The model graphs of the tertiary structures for FpACO proteins.
图选项

2.3 FpACO基因敲除菌株及回补菌株的构建

为了探究FpACO家族各成员在层出镰刀菌中的功能，利用同源重组双交换策略构建FpACO家族基因的敲除突变体，使用位于基因上、下游的同源臂片段内部的验证引物ID1-F、ID1-R及位于被敲除基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)区内的验证引物ID2-F、ID2-R对敲除转化子进行验证(图 4A)。结果显示，成功获得FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2基因的敲除转化子(图 4B)。经过3次以上独立的敲除试验，验证了100个以上转化子后，均未能成功敲除FpACO1-1、FpACO1-2基因，考虑其可能敲除致死。随后，在ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2突变体中转入了由FpACO基因启动子片段、mcherry荧光片段、FpACO基因片段及G418抗性片段所组成的回补大片段，使用G418筛选出阳性转化子，并进行了PCR验证(图 4B)。为了进一步验证敲除菌株与回补菌株，采用qRT-PCR方法分析了各FpACO基因突变体中目的基因的表达水平，结果显示，与野生株(wild type, WT)相比，ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2敲除突变体中被敲除的基因表达几乎检测不到，而各回补菌株中，基因的表达恢复到WT菌株水平(图 4C)。

图 4 FpACO基因敲除突变体及回补菌株的构建 Figure 4 Generation and validation of FpACO genes-targeted disruption strains and complemented strains. A: Strategy for generation of FpACO-targeted disruption strains. B: PCR identification of the ΔFpACO and ΔFpACO-C. C: Transcript levels of the FpACO genes in WT, ΔFpACO and ΔFpACO-C strains. HPH: Hygromycin B resistance gene; ID1-F/R, ID2-F/R: Primers used for identification; M1, M2, M3: Deletion mutants; C1, C2, C3: Complemented strains; NA: Not available. Error bars in C indicate the mean±SD of three independent replicates.
图选项

2.4 FpACO影响层出镰刀菌基本生物学过程

对ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2菌株进行表型观察，敲除突变体的生长速率与野生型菌株无明显差异，且形态无变化，表明FpACO基因的单敲不影响菌丝的生长(图 5A)。产孢测定实验结果显示，在CMC培养基中培养48 h时，ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2菌株的产孢量分别减少了66.7%、15.7%，回补菌株ΔFpACO4-1-C、ΔFpACO4-2-C的产孢量则恢复到野生型菌株的产孢水平(图 5B)。显微镜下观察并统计分生孢子长度，ΔFpACO4-1所产生的大型分生孢子长度在0−20 μm的占71%，ΔFpACO4-2所产大型分生孢子长度在20−40 μm的占79%，而野生型菌株所产分生孢子长度为0−20 μm与20−40 μm的比例分别为43%、56%，回补菌株ΔFpACO4-1-C、ΔFpACO4-2-C所产生的大型分生孢子长度分布比例与野生型菌株无明显差异(图 5C)。以上结果表明FpACO4-1与FpACO4-2基因参与调控层出镰刀菌产孢及孢子形态发育过程。

图 5 FpACO在层出镰刀菌基本生物学过程中的功能 Figure 5 FpACO genes are involved in fundamental biological processes in Fusarium proliferatum. A: Colony morphology and growth rates of WT, ΔFpACO3, ΔFpACO4-1, ΔFpACO4-2 on PDA plates. B: Macroconidia production of WT, ΔFpACO3, ΔFpACO4-1, ΔFpACO4-2 strains. C: Length of macroconidia of WT, ΔFpACO3, ΔFpACO4-1, ΔFpACO4-2 and complemented strains. Error bars indicate the mean±SD of three independent replicates (*: P < 0.05). Values followed by different letters (a, b) are significantly different.
图选项

2.5 FpACO参与调控层出镰刀菌环境胁迫响应过程

环境胁迫敏感性测定试验结果显示，相较于WT，ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2敲除突变体在细胞壁胁迫因子CR及金属离子CaCl2处理下，生长抑制率降低，抗性增强，回补菌株ΔFpACO3-C、ΔFpACO4-1-C及ΔFpACO4-2-C对这两种胁迫的敏感性则与野生型菌株一致。ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2敲除突变体在金属离子MgCl2胁迫处理下的抑制率降低，表明其对MgCl2胁迫的抗性增强，而回补菌株对MgCl2胁迫的敏感性恢复到野生型菌株的水平。ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2突变体对另外两种细胞壁胁迫因子SDS、CFW以及渗透压胁迫因子NaCl的敏感程度无变化(图 6A、6B)。以上结果表明，FpACO家族成员可参与调控层出镰刀菌响应细胞壁胁迫及金属离子胁迫的过程。

图 6 FpACO在层出镰刀菌响应环境胁迫过程中的作用 Figure 6 FpACO functions in regulating the response to environmental stress. A: Colony morphology. B: Inhibition rates of WT, ΔFpACO3, ΔFpACO4-1, ΔFpACO4-2 and complemented strains on media containing different stress agents. Error bars indicate the mean±SD of three independent replicates (*: P < 0.05).
图选项

2.6 部分FpACO基因的单独敲除不影响层出镰刀菌致病性

致病力测定结果显示，WT接种组及ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2菌株接种组的幼苗被菌丝包裹较为明显，根部褐变严重，部分种子甚至由于完全被菌丝包裹，无法萌发，而对照组中大部分幼苗完全健康(图 7A)。统计结果显示ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2菌株接种组幼苗的病情指数与WT接种组无显著差异(图 7B)。以上结果表明，FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2基因的单敲并不影响层出镰刀菌致病力。

图 7 FpACO家族基因的敲除不影响层出镰刀菌对苜蓿的致病力 Figure 7 Knockout of FpACO genes show no effect on the virulence of Fusarium proliferatum on alfalfa. A: Disease phenotypes of alfalfa seedlings inoculated by WT, ΔFpACO3, ΔFpACO4-1, ΔFpACO4-2 strains. B: Disease index of the WT, ΔFpACO3, ΔFpACO4-1, ΔFpACO4-2 inoculated alfalfa seedlings.
图选项

2.7 FpACO参与层出镰刀菌线粒体代谢调控

线粒体代谢相关指标测定结果显示，ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2中总乌头酸酶的活性分别下降了28%、31%、54% (图 8A)。ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2中ATP含量均显著低于野生型，其能量代谢存在缺陷(图 8B)。ΔFpACO3及ΔFpACO4-2中过氧化氢的含量相比于野生型分别下降了41%、46% (图 8C)。随后，检测了ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2中编码7个三羧酸循环关键酶的基因表达情况，结果显示，ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2中，编码异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase, FpIdh)、α酮戊二酸脱氢酶(α ketoglutarate dehydrogenase, FpKgd)、琥珀酰辅酶A合成酶(sucinyl-CoA synthetase, FpScs)、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, FpSdh)、富马酸酶(fumarate, FpFum)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, FpMdh)、柠檬酸合成酶(citrate synthase, FpCit)的基因均显著下调表达，表明FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2基因的敲除严重影响三羧酸循环中的关键酶(图 8D、8E)。以上结果表明，FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2基因在线粒体代谢相关过程中具有调控作用。

图 8 FpACO家族参与调控层出镰刀菌线粒体代谢 Figure 8 FpACO proteins are involved in regulating the mitochondrial-related metabolism of Fusarium proliferatum. A: Relative total aconitase activity of ΔFpACO3, ΔFpACO4-1, ΔFpACO4-2 strains compared with WT. B: ATP production in WT, ΔFpACO3, ΔFpACO4-1, ΔFpACO4-2 strains. C: H2O2 production in WT, ΔFpACO3, ΔFpACO4-1, ΔFpACO4-2 strains. D: Schematic diagram showing the down-regulated TCA cycle genes in ΔFpACO3, ΔFpACO4-1, ΔFpACO4-2 strains. Green font indicates down-regulated genes. E: Relative expression levels of the genes in the TCA cycle mentioned above. Error bars indicate the mean±SD of three independent replicates (*: P < 0.05).
图选项

3 讨论与结论

乌头酸酶在不同物种中高度保守[5]。本研究对40种真菌中的155个包含乌头酸酶结构域(PF00330)的蛋白进行了系统进化分析，基于进化关系及保守结构域的亚分类，将其分为4个类型，每类ACO酶中在不同真菌中相对保守，蛋白结构域的分布及蛋白长度也较为接近(图 1)，其中除ACO1为高乌头酸酶类外，其余3类均为线粒体乌头酸酶类型。Makarova等[23]曾将乌头酸酶蛋白分为5类，线粒体乌头酸酶、具有铁调节蛋白功能的乌头酸酶类及与甘氨酸合成有关的高乌头酸酶类均为真核生物中广泛存在的类型，其分类结果与本研究中的系统进化分类结果相似，表明该分类依据较为可靠。层出镰刀菌中不存在具有Aconitase_swivel旋转结构域的ACO2类型，而Secgin等[24]对番茄乌头酸酶蛋白的研究结果中提到，旋转结构域是乌头酸酶蛋白C端的典型特征之一，而同时具有旋转结构域与乌头酸酶结构域的蛋白属于经典的乌头酸酶。结构域分析结果显示，Aconitase_swivel旋转结构域在真菌中却并不普遍存在，推测该结构域可能在不同物种中并不保守，其功能也有待探究。

为了探究乌头酸酶家族在层出镰刀菌中的生物学功能，本研究试图对层出镰刀菌中5个编码乌头酸酶的基因进行敲除，然而未能成功敲除FpACO1-1、FpACO1-2基因，考虑其可能具有不可替代的生化特性，导致敲除致死。FpACO4-1、FpACO4-2的敲除导致层出镰刀菌产孢量减少，且对产生的分生孢子长度有一定影响(图 5B、5C)。其他微生物中，乌头酸酶在生长、繁殖过程中也具有类似的调控作用，乌头酸酶的失活不仅影响金黄色葡萄球菌指数生长期的增殖速度，还影响其在平台期的存活率[13]。枯草芽孢杆菌CitB蛋白C端区域突变后，菌株出现产孢缺陷[15]。此外，本研究发现，FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2还参与调控层出镰刀菌对细胞壁胁迫、金属离子胁迫的响应过程(图 6)，而幽门螺杆菌AcnB及沙门氏菌(Salmonella Pullorum) CitB也可参与不同的胁迫响应过程[16, 25]。以上均表明微生物中乌头酸酶家族蛋白在基本生物学过程中发挥重要作用，且其功能具有一定保守性。

乌头酸酶在病原菌致病过程中发挥的作用已被证实，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中高乌头酸酶基因lysF的敲除突变体毒力几乎丧失[26]，而新隐球菌(Crytococcus neofonmans)中高乌头酸酶基因lys4的敲除突变体对小鼠模型的致病力显著下降[27]。此外，植物病原细菌野油菜黄单胞菌中，乌头酸酶基因acnB的敲除导致其对辣椒的致病力下降[17]。水稻黄单胞菌citB的敲除影响其诱导植物过敏反应的能力，导致致病力下降[18]。然而，本研究发现FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2基因的单敲并不影响层出镰刀菌致病力(图 7)，推测可能由于其均属于线粒体乌头酸酶类，主要负责在三羧酸循环中发挥催化活性，催化反应类型可能存在重叠，生化活性类似，表现出一定的功能冗余，在后续的研究中，可通过亚细胞定位观察、体外的乌头酸酶活性测定等手段，验证FpACO3、FpACO4-1及FpACO4-2酶的生化功能是否具有相似性，也可以通过构建双敲突变体、三敲突变体，深入探究这3个线粒体乌头酸酶在致病性调控中发挥的作用。

干扰病原菌的能量代谢是杀菌剂的主要作用机制之一，糖酵解、脂质氧化、乙酰辅酶A合成、三羧酸循环、呼吸链以及旁路氧化呼吸等途径中的许多关键酶，均为多种杀菌剂的作用靶标，例如代森类杀菌剂通过与乌头酸酶的辅助因子铁离子结合形成螯合物，使乌头酸酶活性被抑制，干扰病原菌呼吸作用[28]；琥珀酸脱氢酶抑制剂(succinate dehydrogenase inhibitor, SDHI)类杀菌剂通过靶标线粒体三羧酸循环系统中的琥珀酸脱氢酶，抑制真菌的呼吸作用[29]。植物病原真菌中，呼吸抑制剂类杀菌剂靶标的生物学功能已有部分研究，尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)中苹果酸脱氢酶基因的敲除可导致显著的生长、产孢缺陷，ΔFonmdh2突变体致病力几乎丧失[30]。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)中琥珀酸脱氢酶FgSDHC1的敲除可导致菌丝生长速率降低、分枝增多、致病力下降等[31]。稻巨座壳菌(Magnaporthe oryzae)中两个编码柠檬酸合酶的基因敲除均可导致产孢缺陷，且在水稻叶片上的致病力明显减弱[32]。然而作为代森类杀菌剂的靶标之一，植物病原真菌中乌头酸酶的生物学功能尚不清楚，本文对层出镰刀菌乌头酸酶功能的研究，有助于在杀菌剂靶标的理论层面阐明三羧酸循环关键代谢酶的功能，从而为探究代森类杀菌剂的抗性机理、新型农药靶标挖掘提供思路。

本研究分析了层出镰刀菌中5个乌头酸酶家族基因的表达模式，明确了其受寄主诱导表达的特性，并明确FpACO蛋白在结构上的多样性与保守性。通过分析ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2敲除突变体的表型，明确了FpACO4-1与FpACO4-2基因在调控产孢及孢子形态发生中的作用，此外，FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2还可影响层出镰刀菌对细胞壁胁迫及金属离子胁迫的敏感性。FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2在层出镰刀菌三羧酸循环、ATP产生、过氧化氢含量等线粒体代谢相关过程中发挥作用，为深入探究其对能量代谢的调控作用奠定了基础。综上，本研究对乌头酸酶家族的部分成员在层出镰刀菌中的功能进行研究，提出了其作为基础代谢酶的重要作用，从而为深入认识层出镰刀菌的致病性分子机制与基础生理代谢分子机制奠定基础，以期为病害防治、呼吸抑制剂类杀菌剂的开发提供思路。

致谢

感谢中国农业科学院草原研究所张园园老师所提供的层出镰刀菌HM19-1-1菌株。

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层出镰刀菌乌头酸酶家族的功能研究
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