伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, Cp)是重要的兼性胞内寄生人兽共患病原菌，主要引起羊体表及内脏器官脓肿和干酪性淋巴结炎，给羊养殖业带来严重的经济损失^[1]。同时该病原菌感染可引起人的淋巴结炎^[2-3]、嗜酸性肺炎^[4]等，对公共卫生安全构成潜在威胁。敲除毒力/假定毒力基因是研究Cp感染致病机理和制定防控措施的重要途径。目前，细菌基因敲除方式主要包括同源重组技术和CRISPR/Cas9编辑技术等^[5]。同源重组技术存在操作烦琐的不足，需要2轮筛选，并且需要引入抗生素抗性基因作为筛选标记等。本实验室前期利用同源重组技术部分敲除Cp宣汉株(XH02)磷脂酶D基因(pld)，发现敲除的速度慢、效率很低^[6]。因此，深入研究能够更高效敲除Cp靶基因的新方法显得尤为重要。CRISPR/Cas9是源于古细菌抵御噬菌体入侵的获得性免疫机制，能准确、高效地修改基因组中的特定位置，具有操作简单、效率高、作用靶点多等优势。通过将人工设计的引导RNA (guide RNA, gRNA)与Cas9结合，将其导向到靶向DNA序列上，Cas9便会切割该DNA序列，产生双链断裂位点，随后，细胞的自身修复机制介入，通过不同的修复途径，实现对靶基因的编辑^[5]。目前CRISPR/Cas9已在大肠杆菌(Escherichia coli)^[7]、布氏杆菌^[8]、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)^[9]等原核生物中成功应用。本研究构建了CRISPR/Cas9基因编辑系统，成功获得Cp的丝氨酸蛋白酶编码基因(cp40)敲除株，并对其生物学特性及致病性进行评价，为Cp的工程菌改造及致病机制研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

LB肉汤、LB营养琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司；胎牛血清购自Biological Industries公司；小牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；Opti-MEM培养基购自Gibco公司；氯霉素、卡那霉素、pEASY^®-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit、2×TransFast^® Taq PCR SuperMix (+dye)和质粒小提试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；IPTG、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；庆大霉素、碘化丙锭(propidium iodide, PI)购自北京索莱宝科技有限公司；PrimeSTAR高保真酶、DNA Ligation Kit和DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；鼠白细胞介素(interleukin, IL)-1β ELISA检测试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2 试验动物及细胞

昆明系小鼠购自西南医科大学实验动物中心[实验动物使用许可证号：SYXK(渝) 2019-0003]，J774A.1巨噬细胞为本实验室保存。

1.3 菌株、质粒、培养基和抗生素

Cp宣汉株(XH02)和E. coli DH5α均由本实验室保存，E. coli Trans1-T1购自北京全式金生物技术股份有限公司。大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pECXK99E和pCas9gRNA-ccdB由中国科学院天津工业生物技术研究所孙际宾研究团队惠赠，pEC-cp40gRNA和pEC-cp40gRNA-HDarm由本研究构建。

LB平板：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂15.0 g/L，配置时加入5%兔血。LB肉汤(g/L)：胰蛋白胨8.0 g/L，酵母浸粉2.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，含10%小牛血清和0.1%吐温80。

抗生素：氯霉素终浓度为20 mg/L，卡那霉素终浓度为50 mg/L。

1.4 PCR引物

根据GenBank公布的cp40 (OL347712.1)序列，用SnapGene软件设计引物(表 1)，并送往北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

1.5 pEC-cp40gRNA质粒的构建

通过网站http://crispor.tefor.net/设计cp40的间隔序列(spacer)，并将间隔序列的20 bp序列连同EcoR I酶切位点加入引物cp40gRNA-F的5′端。以质粒pCas9gRNA-ccdB为模板，cp40gRNA-F和gRNA-R (5′端带有Sal I酶切位点)为引物，使用PrimeSTAR扩增cp40gRNA，凝胶电泳鉴定并回收PCR产物，以EcoR I和Sal I双酶切cp40gRNA和pECXK99E，用DNA Ligation Kit连接酶切后的cp40gRNA和pECXK99E质粒，连接产物化学转化至E. coli DH5α感受态细胞，小提质粒，用pECjd-F/R鉴定，将构建好的质粒命名为pEC-cp40gRNA (图 1A)。

1.6 pEC-cp40gRNA-HDarm质粒的构建

以XH02基因组为模板，cp40UP-F/R和cp40 DOWN-F/R为引物，使用PrimeSTAR扩增cp40上、下游同源臂。以pEC-cp40gRNA为模板，pEC-cp40-F/R为引物扩增片段1，PCR反应体系(25 μL)：2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板0.5 µL，ddH₂O 10 µL。PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃终延伸5 min。电泳鉴定、回收产物，用cp40UP-F和cp40DOWN-R为引物将cp40上、下游同源臂用Overlap PCR方法扩增连接，作为同源修复DNA模板，PCR产物经电泳鉴定、回收，用无缝克隆试剂盒连接片段1和同源修复DNA模板。连接产物化学转化至Trans1-T1感受态细胞，将构建好的质粒命名为pEC-cp40gRNA-HDarm (图 1A)。

1.7 cp40基因敲除及验证

参照文献[10]制备感受态细胞，将pCas9gRNA-ccdB电转化至XH02感受态细胞，涂布在含有氯霉素的LB平板上，再制备含pCas9gRNA-ccdB的感受态细胞(培养时加入终浓度为20 mg/L的氯霉素)。将pEC-cp40gRNA-HDarm电转化至带有pCas9gRNA-ccdB的感受态细胞，涂布在含有氯霉素、卡那霉素以及0.05 mmol/LIPTG的LB平板，37 ℃培养48 h。用引物cp40-JD-F和cp40-JD-R鉴定单克隆，并将其PCR产物送北京擎科生物科技股份有限公司测序验证(图 1B)。

1.8 质粒的消除

将鉴定正确的cp40敲除株接种至LB肉汤中，37 ℃、200 r/min摇床培养18 h，传代5 d后分别涂布含有氯霉素和卡那霉素平板上，若在氯霉素和卡那霉素平板上均没有菌落长出，则证明pCas9gRNA-ccdB质粒和pEC-cp40gRNA-HDarm质粒均已被消除。

1.9 敲除cp40对Cp菌落形态及生长曲线的影响

将XH02和XH02Δcp40接种于LB平板上，37 ℃培养24 h，观察菌落形态。挑取单克隆至1.5 mL LB肉汤，37 ℃、200 r/min培养18 h，调整OD₅₉₅为0.2，吸取100 μL菌液于30 mL LB肉汤中，37 ℃、200 r/min培养，每6 h测定一次OD₅₉₅值，绘制生长曲线。

1.10 体外试验评价敲除cp40对Cp感染J774A.1细胞活力和IL-1β分泌影响 1.10.1 Cp感染J774A.1细胞LDH释放水平检测

取J774A.1接种于48孔板，2.5×10⁵细胞/孔，37 ℃培养过夜。将XH02和XH02Δcp40以感染复数为10 (MOI=10)侵染J774A.1，1 h后用PBS洗去胞外菌，加入含庆大霉素(终浓度100 mg/L)的Opti-MEM培养基，培养12 h。根据LDH检测试剂盒说明书检测LDH释放水平。

1.10.2 Cp感染J774A.1细胞的碘化丙锭(PI)染色比例检测

将J774A.1接种于12孔细胞板，1×10⁶细胞/ 孔，37 ℃培养过夜。将XH02和XH02Δcp40以MOI=10侵染J774A.1细胞，1 h后用PBS洗去胞外菌，加入含庆大霉素(终浓度100 mg/L)的DMEM培养液，培养12 h。弃上清，PBS洗2次后，加入100 μL稀释后的PI溶液(10 μg/mL)，37 ℃培养10 min后再以PBS洗2次，加入50 μL抗荧光淬灭封片液(含DAPI)。参考文献[11]的方法，通过荧光显微镜拍照，每组随机选择6个视野，统计细胞总数和PI染成红色的细胞数，计算PI染色细胞百分比：PI染色细胞百分比=PI染成红色的细胞数/细胞总数×100%。判断敲除cp40对Cp感染J774A.1细胞膜损伤影响情况。

1.10.3 Cp感染J774A.1细胞IL-1β分泌水平检测

将J774A.1接种于12孔细胞板，1×10⁶细胞/孔，37 ℃培养过夜。用XH02和XH02Δcp40按MOI=10侵染J774A.1细胞，1 h后用PBS洗去胞外菌，加入含庆大霉素(终浓度100 mg/L)的DMEM培养液，培养24 h。收集细胞上清，用IL-1β检测试剂盒检测IL-1β分泌水平。

1.11 体内感染试验评价敲除cp40对Cp感染小鼠致病性及脏器载菌水平的影响 1.11.1 生存曲线试验

将24只昆明系小鼠[体重(18±2) g]随机均分为3组(XH02组、XH02Δcp40组和PBS对照组)，每组8只。以PBS将菌液稀释为8×10⁷ CFU/mL，感染组小鼠分别腹腔注射XH02或XH02Δcp40菌液(0.2 mL/只)，对照组小鼠腹腔注射0.2 mL PBS。在注射后记录14 d内小鼠的死亡情况，绘制生存曲线。

1.11.2 脏器载菌量试验

将9只昆明系小鼠[体重(25±1) g]随机均分为XH02组、XH02Δcp40组和PBS对照组，每组3只。以PBS将菌液稀释为8×10⁷ CFU/mL，感染组小鼠分别腹腔注射XH02或XH02Δcp40菌液(0.2 mL/只)，对照组小鼠腹腔注射0.2 mL PBS。参考文献[6]的方法，于感染后72 h无菌摘取小鼠的肝脏、脾脏和肾脏，加入灭菌PBS，用匀浆机充分匀浆，以PBS稀释涂板计数。

1.12 数据分析

采用GraphPad Prism 8.0.1作图，以双尾非配对t检验统计分析。试验结果用平均数±标准误(x±SE)表示。P < 0.05为差异显著。

2 结果与分析 2.1 cp40敲除结果

成功构建出pEC-cp40gRNA和pEC-cp40gRNA-HDarm，DNA扩增片段证实所构建质粒正确(图 2、图 3)。挑取单个菌落进行PCR鉴定，XH02野生株的PCR扩增条带为2 540 bp，而XH02Δcp40敲除株PCR扩增条带为1 400 bp (图 4)。在所挑取的33个单菌落中，有4个菌落PCR扩增条带符合预期，敲除效率为12.12% (4/33)。测序比对证实成功敲除了XH02的cp40全部序列。

2.2 XH02、XH02Δcp40菌落形态及生长曲线的测定

在LB平板上，XH02和XH02Δcp40均为圆形、乳白色、干燥菌落，无明显差异(图 5A、5B)。生长曲线测定显示，XH02与XH02Δcp40在液体培养基中生长状态基本一致(图 5C)。

2.3 敲除cp40对Cp感染J774A.1细胞活力的影响

本研究检测XH02、XH02Δcp40感染J774A.1的LDH释放情况及PI染色的细胞比例，评价敲除cp40对Cp感染J774A.1细胞活力的影响。与XH02感染细胞相比，XH02Δcp40感染J774A.1细胞的LDH释放水平下降(图 6A)，PI染色的细胞百分比显著降低(图 6B)。

2.4 敲除cp40对Cp感染J774A.1细胞IL-1β分泌水平的影响

Cp感染巨噬细胞后可引起促炎细胞因子IL-1β的分泌水平升高，本研究评价了敲除cp40对Cp感染J774A.1分泌IL-1β水平的影响。结果显示，与XH02感染细胞相比，XH02Δcp40感染J774A.1细胞的IL-1β分泌水平显著降低(图 7)。

2.5 敲除cp40对Cp体内感染小鼠生存曲线和脏器载菌量的影响

致病力试验显示，XH02感染组小鼠在注射后第2天出现死亡，在14 d内死亡率达到75% (6/8)，而XH02Δcp40组仅在感染后第3天和第4天各死亡1只，死亡率为25%，相较于XH02组，XH02Δcp40组小鼠死亡率下降50% (图 8A)。脏器载菌量检测显示，除了脾脏载菌量无显著差异外，XH02Δcp40感染小鼠肝和肾的载菌量均显著低于XH02感染小鼠(图 8B−8D)。

3 讨论与结论 3.1 构建Cp靶基因敲除的CRISPR/Cas9编辑系统需要同源修复模板

CRISPR/Cas9以其高效的基因编辑效率广泛应用于真核和原核生物中，在gRNA和Cas9蛋白的参与下，待编辑的DNA将被看作病毒或外源DNA，进而被精确剪切。在谷氨酸棒状杆菌中，已有基于CRISPR/Cas9、CRISPR-Cpf1、CRISPR/Cas9和ReCT的耦合重组系统等，可快速、高效、无痕敲除多个基因^{[9, 12-14]}，这为同为棒状杆菌属微生物的Cp靶基因敲除提供了参考。与经典的同源重组技术敲除Cp基因需要2次筛选和效率低相比，CRISPR/Cas9编辑技术只需要一次筛选，并且具有较高的敲除效率。由于谷氨酸棒状杆菌缺乏有效的非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)修复途径，不能很好地修复因Cas9切割产生双链断裂(double stand breaks, DSB)^[14-15]，推测在Cp中可能没有NHEJ修复途径。因此，本研究后续构建CRISPR/Cas9编辑系统时，采用同源重组(homology-directed repair, HR)进行修复。构建CRISPR/Cas9编辑系统有多种方案，可以将Cas9、gRNA和同源修复模板置于一个质粒或不同的质粒上，也可通过外源提供单链DNA (single stranded DNA, ssDNA)修复模板^[9]。在试验前期，本研究尝试将Cas9和gRNA设计在同一载体上，修复模板置于另一载体上，但由于在Cp中Ptac启动子控制下的Cas9泄漏表达导致获得的转化子数很少，未筛选到敲除株，因此改为将gRNA和同源修复模板置于同一载体上。最终以pCas9gRNA-ccdB为表达Cas9的载体，以大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pECXK99E为载体骨架，构建pEC-cp40gRNA-HDarm以提供引导Cas9切割的cp40gRNA和切割后修复基因组的上、下游同源臂HDarm，成功建立了敲除cp40的CRISPR/Cas9双质粒编辑系统。

3.2 关于CRISPR/Cas9编辑系统对Cp靶基因敲除效率的探索

本研究前期曾探究所建立的CRISPR/Cas9编辑系统对Cp的pld基因敲除效率较经典同源重组技术是否有提升，发现在0.05 mmol/L IPTG诱导下pld基因的敲除效率为3.0%，远高于实验室前期以经典同源重组敲除pld的效率(< 0.1%，数据未展示)，但低于同样以双质粒模型进行谷氨酸棒状杆菌基因敲除的效率(16.7%−83.3%)^[16]，也低于用单质粒模型的敲除效率(55.1%−91.3%)^[9]。影响该系统编辑效率的因素主要考虑为PAM位点、gRNA设计、IPTG浓度以及同源臂的长度^[16]。在cp40敲除中我们提升了IPTG浓度到0.05 mmol/L，发现诱导得到的转化子数明显减少，编辑效率得到了提高，达到12.12%。若要对编辑效率进一步优化可以尝试增加同源臂长度、更换gRNA和PAM位点等。

3.3 cp40在Cp感染致病中的作用

cp40编码丝氨酸蛋白酶CP40，该蛋白是Cp中研究最多的蛋白之一，但这些研究主要是表达获得CP40重组蛋白或融合蛋白制备疫苗进行免疫保护研究^[17-18]，尚无明确证据直接表明该蛋白是Cp的毒力因子。有文献报道，丝氨酸蛋白酶在肺炎球菌的黏附、定殖和扰乱宿主细胞免疫中发挥着至关重要的作用^[19]。此外，丝氨酸蛋白酶是幽门螺杆菌重要的毒力因子，可扰乱胃上皮细胞，使幽门螺杆菌能够跨上皮迁移^[20]。Cp为一种兼性胞内寄生菌，可引起内脏器官脓肿、干酪性淋巴结炎、嗜酸性肺炎等炎性病变^[1-4]，该病原菌感染巨噬细胞的特征之一是引起促炎细胞因子IL-1β分泌增加^[21]。本研究发现，敲除cp40基因后，Cp感染巨噬细胞促炎因子IL-1β的分泌水平显著下降，提示cp40在Cp感染促炎中发挥作用。Cp感染可造成巨噬细胞死亡，其特征为LDH释放增加^[6]。本研究发现，敲除cp40的Cp感染巨噬细胞LDH释放水平降低，由于LDH释放与死亡或受损细胞数量成正比^[22]，提示cp40与该病原菌感染引起巨噬细胞死亡有关。同时，本研究还通过PI染色观察评价敲除cp40对Cp感染损伤巨噬细胞的影响，PI是一种不渗透膜的红色荧光染料，可穿透受损的细胞染色DNA，PI染色细胞比例常被认为是细胞膜受损的指标^[23]，结果显示敲除cp40的Cp感染巨噬细胞后，PI染色细胞比例显著低于野生株，进一步证实敲除cp40可降低Cp对被感染巨噬细胞的致病力。综上所述，本研究发现被感染巨噬细胞LDH释放和PI染色细胞比例均低于野生株，提示CP40与Cp感染损伤巨噬细胞有关。此外，本研究发现，XH02Δcp40体内感染小鼠存活率高于XH02感染小鼠，被XH02Δcp40感染小鼠肝、肾的脏器载菌量显著减少，提示缺失敲除cp40可降低Cp对肝、肾的入侵，降低Cp对小鼠的致病力，证实CP40是Cp的毒力因子之一，但该蛋白在Cp感染过程如何促进其致病的详细机制有待于进一步研究。

综上，本研究基于CRISPR/Cas9技术在Cp中成功构建cp40敲除菌株，为该病原菌其他毒力基因敲除及功能研究提供了技术储备。同时，证实cp40是Cp致病相关基因，为深入探究cp40感染致病作用机制奠定了基础。