2024, Vol. 64
表1(Table 1)
地衣芽孢杆菌HDTN对817肉鸡生长性能及肠道菌群的影响
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20230798
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 丁红霞, 潘朝阳, 孟凡丛, 陈聘聘, 许萍, 王婕, 范鑫, 李世杰, 周祖涛, 石德时, 肖运才. 2024
- DING Hongxia, PAN Chaoyang, MENG Fancong, CHEN Pinpin, XU Ping, WANG Jie, FAN Xin, LI Shijie, ZHOU Zutao, SHI Deshi, XIAO Yuncai.
- 地衣芽孢杆菌HDTN对817肉鸡生长性能及肠道菌群的影响
- Effects of Bacillus licheniformis HDTN on growth performance and intestinal flora of '817' broilers
- 微生物学报, 64(7): 2479-2492
- Acta Microbiologica Sinica, 64(7): 2479-2492
-
文章历史
- 收稿日期：2023-12-26
- 网络出版日期：2024-04-02
引用本文 |
丁红霞, 潘朝阳, 孟凡丛, 陈聘聘, 许萍, 王婕, 范鑫, 李世杰, 周祖涛, 石德时, 肖运才. 地衣芽孢杆菌HDTN对817肉鸡生长性能及肠道菌群的影响[J]. 微生物学报, 2024, 64(7): 2479-2492.
Ding Hongxia, Pan Chaoyang, Meng Fancong, Chen Pinpin, Xu Ping, Wang Jie, Fan Xin, Li Shijie, Zhou Zutao, Shi Deshi, Xiao Yuncai. Effects of Bacillus licheniformis HDTN on growth performance and intestinal flora of '817' broilers[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024, 64(7): 2479-2492.
地衣芽孢杆菌HDTN对817肉鸡生长性能及肠道菌群的影响
1. 华中农业大学 农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室, 湖北 武汉 430070;
2. 湖北省预防兽医学重点实验室, 湖北 武汉 430070;
3. 华中农业大学动物医学院, 湖北 武汉 430070;
4. 湖南宝东农牧科技股份有限公司, 湖南 邵阳 422000
2. 湖北省预防兽医学重点实验室, 湖北 武汉 430070;
3. 华中农业大学动物医学院, 湖北 武汉 430070;
4. 湖南宝东农牧科技股份有限公司, 湖南 邵阳 422000
摘要：“饲料禁抗”对于畜牧养殖业而言是个重要转折点，标志着饲料行业和养殖行业步入转型升级的新阶段。[目的] 探究饲料中添加地衣芽孢杆菌HDTN对817肉鸡生长性能及肠道菌群的影响。[方法] 将地衣芽孢杆菌HDTN菌粉(7.0×1010 CFU/g)添加至饲料中饲喂817肉鸡，探究不同添加剂量(高剂量组：1 000 g/t；中剂量组：500 g/t；低剂量组：250 g/t；对照组：0 g/t)在1−56 d内对817肉鸡生长性能、血清生化指标、肠道形态及菌群结构的影响。[结果] 与对照组相比1−35 d添加低剂量地衣芽孢杆菌HDTN可以使肉鸡平均体重(average body weight, ABW)显著提高105.47 g (P < 0.01)，料重比显著降低0.25 (P < 0.05)。肉鸡血清中部分抗氧化指标的含量与HDTN添加量呈正相关，从而减少肉鸡氧化应激。丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量与HDTN添加量呈负相关，提示HDTN可以减少肉鸡细胞损伤。肠道切片结果显示低剂量组十二指肠的肠绒毛高度与隐窝深度比值(villus height/crypt depth, VH/CD)显著高于对照组(P < 0.01)。另外中剂量组(P < 0.01)、低剂量组(P < 0.05)的厚壁菌门(Firmicutes)菌群丰度显著上升，中剂量组拟杆菌属(Bacteroides)的菌群丰度同样出现显著上升(P < 0.05)。[结论] 在1−35 d添加低剂量地衣芽孢杆菌HDTN，可以提高817肉鸡生长性能、降低料重比、改善肠道形态并加快建立肠道优势菌群。
关键词：地衣芽孢杆菌HDTN 817肉鸡 生长性能 肠道菌群
Effects of Bacillus licheniformis HDTN on growth performance and intestinal flora of '817' broilers
1. National Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China;
2. Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hubei Province, Wuhan 430070, Hubei, China;
3. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China;
4. Hunan Baodong Agriculture and Animal Husbandry Co., Ltd., Shaoyang 422000, Hunan, China
2. Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hubei Province, Wuhan 430070, Hubei, China;
3. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China;
4. Hunan Baodong Agriculture and Animal Husbandry Co., Ltd., Shaoyang 422000, Hunan, China
Abstract: The proposal of ban on antibiotics in feed is a turning point for the animal husbandry, marking that the feed industry and animal husbandry have entered a new stage of transformation and upgrading. [Objective] To investigate the effects of adding Bacillus licheniformis HDTN to feed on the growth performance and intestinal flora of '817' broilers. [Methods] B. licheniformis HDTN powder (7.0×1010 CFU/g) was added to the feed for '817' broilers. The effects of high-, medium-, and low-dose (1 000, 500, and 250 g/t) bacterial addition on the growth performance, serum biochemical indexes, intestinal morphology, and intestinal flora structure of the '817' broilers during 1–56 days were studied, with the group without bacterial addition as the control. [Results] Compared with the control group, the addition of low-dose B. licheniformis HDTN increased the average body weight by 105.47 g (P < 0.01) and reduced the feed-to-weight ratio by 0.25 (P < 0.05) during days 1–35. The antioxidant indexes in the broiler serum were positively correlated with the dose of HDTN, which reduced oxidative stress in broilers. The content of malondialdehyde was negatively correlated with the dose of HDTN, which suggested that HDTN reduced cellular damage in broilers. The ratio of villus height to crypt depth in the duodenum of the low-dose group was higher than that of the control group (P < 0.01). In addition, compared with the control group, medium-dose (P < 0.01) and low-dose (P < 0.05) groups showed increased relative abundance of Firmicutes, and the medium-dose group showed increased relative abundance of Bacteroides (P < 0.05). [Conclusion] Addition of low-dose B. licheniformis HDTN for '817' broilers can improve the growth performance, reduce the feed-to-weight ratio, improve the intestinal morphology, and accelerate the assembly of intestinal flora during days 1–35.
Keywords:
Bacillus licheniformis HDTN '817' broiler growth performance intestinal flora
益生菌指可以改善宿主健康状态的活体微生物。微生态制剂则是运用微生态学原理，以益生菌为原料制成的活菌制剂[1]。益生菌及其代谢产物多具有预防疾病、调节宿主动物肠道菌群平衡、提高生长性能和减少氧化应激等一系列作用[2]。随着畜禽养殖产业的发展，抗生素残留及细菌耐药性的不断提高已经成为亟待解决的问题。2020年7月起我国禁止使用除中草药外的所有促生长类药物饲料添加剂[3]。因此，在畜禽养殖领域研发具有减抗替抗效果的微生态制剂是顺应发展、拥有广阔前景的研究[4]。
益生菌的功能与菌体本身及其代谢产物息息相关。首先是益生菌菌体，畜禽胃肠道菌群绝大部分为厌氧菌，益生菌进入肠道与需氧型致病菌争夺氧气、营养物质和生存空间，从而控制有害菌的数量，维持肠道微生态平衡。另外在黏膜受损的情况下，细胞外基质(extracellular matrix, ECM)会发生暴露，允许有害微生物定殖和感染，而益生菌则可以黏附在基质上与病原体竞争相同受体，并占据潜在结合位点[5-6]。He等[7]在饲料中添加枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合制剂，使肉鸡空肠黏膜中的胞质紧密粘连蛋白1 (zonula occludens-1, ZO-1)显著升高，降低有害细菌及毒素穿过肠道进入血液引起肠源性感染的风险。可见益生菌在促进肠道菌群平衡，减少有害微生物定殖及感染方面发挥着有益作用。
益生菌代谢产物如短链脂肪酸、吲哚、维生素和细菌素，参与宿主与微生物群的互作，如吲哚衍生物与芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AHR)结合，调节宿主屏障功能和免疫稳态[8]。Aliakbarpour等[9]在肉鸡饲粮中添加枯草芽孢杆菌，其代谢产物甘露寡糖提高了粘糖蛋白2 (mucin-2, MUC2)基因的表达，增加了杯状细胞数量和空肠绒毛高度。以上多项研究均表明，益生菌及其代谢产物在畜禽养殖过程中发挥着重要作用。
本研究中的HDTN是一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。地衣芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，具有安全性和优良的耐受性。地衣芽孢杆菌可产生多种抗生素，包括脂肽类[10]、肽类、多烯类和氨基酸类等。Ham等[11]在地衣芽孢杆菌中分离出含有特殊咪唑环的抗生素芽孢杆菌咪唑G，对多种动物、植物及人类病原菌起到很好的抑制作用。另一方面部分地衣芽孢杆菌能产生很强的蛋白酶[12]、淀粉酶[13]活性。因此，地衣芽孢杆菌被广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工和环境污染治理等各个行业。
1 材料与方法 1.1 菌株和试剂地衣芽孢杆菌HDTN由湖北华大瑞尔科技有限公司提供，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020536。
4%多聚甲醛(g/L)：NaH2PO4‧2H2O 17.80 g，Na2HPO4‧12H2O 35.82 g，多聚甲醛40.00 g。
1.2 试验动物和日粮1日龄817肉鸡购自衡阳县大安乡湘禽苗孵化场。所有试验均按照相关法律和制度指导进行，并经过华中农业大学动物伦理委员会批准进行。伦理编号：HZAUCH-2024-0003。
基础日粮参照817肉鸡标准配制。基础日粮配方和营养水平如表 1所示。
表 1. 817肉鸡基础日粮配方和营养水平
Table 1. '817' broilers base diet formulation and nutrient levels
| Items | 1−21 d | 21−56 d |
| Ingredients | ||
| Corn (%) | 64.00 | 64.00 |
| Soybean meal (%) | 27.00 | 28.00 |
| Fishmeal (%) | 5.00 | 2.00 |
| Premix (%) | 5.00 | 5.00 |
| Nutritional levels | ||
| Crude protein (%) | 21.00 | 19.00 |
| Metabolic energy (kcal/kg) | 2 900 | 3 000 |
| Lysine (%) | 1.36 | 1.25 |
| Methionine (%) | 0.44 | 0.40 |
| Total Ca (%) | 1.00 | 0.90 |
| Available P (%) | 0.45 | 0.40 |
| The premix provided the following per kg of diets: VA 9 600 IU, VD3 2 700 IU, VE 36 mg, VK 33 mg, VB1 3 mg, VB2 10.5 mg, VB6 2 mg, VB12 0.03 mg, folic acid 1.5 mg, niacinamide 60 mg, ᴅ-calcium pantothenate 18 mg, ᴅ-biotin 0.25 mg, iron 80 mg, copper 8 mg, manganese 80 mg, zinc 60 mg, iodine 0.35 mg, selenium 0.15 mg. | ||
1.3 试验设计
选取雄性1日龄817肉鸡400只，仔鸡适应环境3 d后，选取体重无显著差异的仔鸡384只，随机分成4组，每组6个重复，每个重复16只肉鸡，试验周期全程56 d (不包含适应环境的3 d)，试验设计如表 2所示。
表 2. 试验分组及HDTN添加量
Table 2. Test groups and HDTN addition levels
| Group | HDTN (7.0×1010 CFU/g) |
| High-dose group | Basic diet+1 000 g/t HDTN |
| Middle-dose group | Basic diet+500 g/t HDTN |
| Low-dose group | Basic diet+250 g/t HDTN |
| Control group | Basic diet+0 g/t HDTN |
1.4 饲养管理
试验周期全程56 d，另外保证饲料及饮水始终充足，肉鸡可自由采食饮水。每日早晚通风，消毒一次。每天记录采食量，每周进行称重，计算料重比。
1.5 样品的采集及制备试验期间每天记录采食量、死亡鸡数，于7、21、35、56日龄的早晨空腹称重计算体重、日增重、日采食量和料重比。
从每个重复中选择6只与平均体重相近的肉鸡，称取空腹12 h后的体重，真空促凝管翅静脉采血，室温静置2 h后置于冰上，待血清析出，3 000 r/min离心10 min，于−20 ℃保存。对肉鸡进行屠宰，取肠道组织于4%多聚甲醛溶液中固定；采样鸡打开腹腔后，分离出盲肠，将盲肠内容物挤出至事先标记好的冻存管中，液氮速冻，后于−80 ℃保存。
1.6 指标测定 1.6.1 生长指标测定计算7、21、35、56日龄的平均体重、平均日增重(average daily gain, ADG)及料重比(feed to gain ratio, F/G)。
1.6.2 血清抗氧化指标测定血清抗氧化指标采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，包括总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、微量还原谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)及丙二醛(malondialdehyde, MDA)。
1.6.3 肠道形态结构检测截取肠段(十二指肠、空肠、回肠)采用生理盐水漂洗，多聚甲醛固定。组织经过脱水、透明、包埋、修蜡、切片、经苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色封片。测定完整绒毛高度(villus height, VH)和隐窝深度(crypt depth, CD)，计算隐窝深度比(VH/CD)。
1.6.4 盲肠内容物检测首先提取盲肠菌群总DNA，以正向引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和反向引物806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′)，使用GeneAmp 9700 PCR仪(Applied Biosystems)扩增细菌16S rRNA基因V3−V4高变区。将PCR扩增产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光系统进行检测定量。建立MiSeq并上机测序，利用Qiime (version 1.8, http://qiime.org)平台进行操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)聚类和物种注释，使用Qiime软件(version 1.9.1)计算Shannon、Simpson、ACE指数及β多样性(beta diversity)分析。本研究产生的原始读数已存入NCBI的Sequence Read Archive (SRA)数据库，登录号为PRJNA1056289。
1.7 数据处理试验数据用Excel 2020软件进行初步处理后，用SPSS26.0软件进行统计分析，利用方差分析(analysis of variance, ANOVA)、最小显著差异法(least significant difference, LSD)进行差异显著性检验和Duncan多重比较，试验结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。采用SPSS 26.0软件进行统计分析，利用双变量相关性分析对变量进行相关性比较得到Sig值及Spearman相关性系数。
16S rRNA基因测序结果使用R软件(version 2.15.3)进行α、β多样性指数组间差异分析。使用R软件(version 2.15.3)对各分类水平下的组间差异物种进行t检验。*表示P < 0.05；**表示P < 0.01；***表示P < 0.001；****表示P < 0.000 1。
2 结果与分析 2.1 HDTN对817肉鸡生产性能的影响饲料中添加不同剂量HDTN对817肉鸡生长性能影响结果如表 3所示。结果表明：中剂量组和低剂量组的料重比在试验前期(1−35 d)较对照组分别降低了0.31 (P < 0.01)、0.25 (P < 0.01)，试验全程(1−56 d) 低剂量组料重比略低于其他组；35日龄中剂量组、低剂量组与对照组相比平均体重差值达到最大，分别提高了111.73 g (P < 0.01)、105.47 g (P < 0.01)，表明添加HDTN可以提高817肉鸡生长性能。
表 3. HDTN对817肉鸡生产性能的影响
Table 3. Effect of HDTN on the production performance of '817' broilers
| Items | High-dose group | Middle-dose group | Low-dose group | Control group | |
| ABW (g) | 7 d | 68.74±2.35 | 69.50±7.76 | 72.56±5.41 | 66.89±7.39 |
| 21 d | 283.16±5.46Aa | 279.02±7.10Aa | 276.61±8.49ABa | 265.60±7.52Bb | |
| 35 d | 722.35±45.25B | 817.19±33.08A | 810.93±30.20A | 705.46±32.07B | |
| 56 d | 1 411.05±42.95Bb | 1 496.16±27.21ABa | 1 545.35±70.79Aa | 1 538.38±56.03Aa | |
| ADG (g) | 1−35 d | 19.65±1.30B | 22.38±0.95A | 22.20±0.85A | 19.18±0.89B |
| 1−56 d | 24.58±0.78BCb | 26.11±0.48Ba | 26.99±1.26ABa | 26.86±1.00ABa | |
| F/G | 1−35 d | 1.72±0.16Aa | 1.53±0.07B | 1.59±0.90Bb | 1.84±0.07Aa |
| 1−56 d | 2.21±0.08 | 2.17±0.08 | 2.15±0.10 | 2.22±0.10 | |
| Data in the table are means±SD; Different lowercase letters in the same row indicate significant differences (P < 0.05), and different capital letters indicate highly significant differences (P < 0.01). | |||||
2.2 HDTN对817肉鸡血清抗氧化指标的影响
HDTN对817肉鸡血清抗氧化指标的影响如表 4所示。添加HDTN能极显著降低血清中MDA的含量(P < 0.01)；升高GSH、CAT、SOD和T-AOC的含量。MDA对细胞具有严重的毒性作用，其含量可以反映细胞受损程度。将各指标与HDTN添加量进行相关性分析，可以看到各指标的Sig值均 < 0.001、Spearman相关性系数绝对值均 > 0.80，说明其均具有强相关性。地衣芽孢杆菌HDTN添加量与血清中MDA含量呈负相关，提示HDTN的添加可以降低肉鸡细胞受损程度。血清中GSH、CAT、SOD和T-AOC的含量与HDTN添加量呈正相关，提示HDTN的添加可以使肉鸡抗氧化应激能力得到提高。
表 4. HDTN对35日龄817肉鸡血清抗氧化指标的影响及相关性分析
Table 4. Effect of HDTN on serum antioxidant indexes of 35-day-old '817' broilers and its correlation analysis
| Items | High-dose group | Middle-dose group | Low-dose group | Control group | Sig | Spearman ρ |
| T-AOC (U/mL) | 4.67±0.42Aa | 3.64±0.39Ba | 3.03±0.67BCb | 2.61±0.51Cb | < 0.001 | 0.82 |
| SOD (nmol/mL) | 22.21±0.51A | 20.36±0.56B | 18.60±0.85C | 15.49±1.19D | < 0.001 | 0.96 |
| GSH (U/mL) | 47.22±5.54Aa | 39.24±5.21ABb | 34.02±5.88Bb | 20.49±5.65Ca | < 0.001 | 0.89 |
| CAT (U/mL) | 28.45±3.39Aa | 20.21±2.72Bb | 12.64±1.71Ca | 9.4±2.41Cb | < 0.001 | 0.94 |
| MDA (nmol/mL) | 5.77±1.17D | 8.46±0.97C | 11.92±1.44B | 18.97±1.98A | < 0.001 | −0.97 |
| Data in the table are means±standard deviation; Different lowercase letters in the same row indicate significant differences (P < 0.05), and different capital letters indicate highly significant differences (P < 0.01). | ||||||
2.3 HDTN对817肉鸡肠道形态的影响
如表 5所示，十二指肠：绒毛高度高剂量组、中剂量组、低剂量组均高于对照组，但无显著差异；隐窝深度低剂量组显著低于高剂量组、中剂量组、对照组；低剂量组十二指肠VH/CD值显著高于对照组(P < 0.01)。对于空肠形态：对照组与高剂量组、中剂量组、低剂量组的空肠隐窝深度及VH/CD值均差异不显著。另外对照组与高剂量组、中剂量组、低剂量组相比回肠绒毛高度、隐窝深度和VH/CD值差异均不显著。
表 5. HDTN对35日龄817肉鸡肠道绒毛形态的影响
Table 5. Effect of HDTN on the morphology of intestinal villi in 35-day-old '817' broilers
| Items | High-dose group | Middle-dose group | Low-dose group | Control group | |
| Duodenum (μm) | VH | 1 458.40±189.49 | 1 355.11±150.57 | 1 386.46±144.39 | 1 271.4±169.77 |
| CD | 184.89±22.31ABa | 185.82±29.80ABa | 140.21±15.57Ab | 181.71±36.87Ba | |
| VH/CD | 7.99±1.48AB | 7.53±2.05AB | 9.14±0.75A | 6.44±2.27B | |
| Jejunum (μm) | VH | 980.75±152.79 | 1 118.47±76.12 | 1 124.71±102.02 | 1 193.17±155.01 |
| CD | 170.66±25.56 | 125.34±13.50 | 188.89±37.99 | 160.84±30.69 | |
| VH/CD | 5.75±0.45 | 8.54±1.87 | 6.11±1.17 | 7.61±1.77 | |
| Ileum (μm) | VH | 859.64±22.32 | 817.67±81.38 | 900.66±82.43 | 816.66±85.79 |
| CD | 145.14±27.81 | 149.87±22.81 | 155.45±23.40 | 166.62±24.21 | |
| VH/CD | 6.09±1.10 | 5.45±1.07 | 5.91±1.12 | 5.03±1.01 | |
| Data in the table are means±standard deviation; Different lowercase letters in the same row indicate significant differences (P < 0.05), and different capital letters indicate highly significant differences (P < 0.01). | |||||
2.4 HDTN对817肉鸡肠道菌群和功能的影响 2.4.1 肉鸡盲肠菌群的稀释曲线及Shannon-Wiener曲线
本研究测序结果的稀释曲线最终逐渐趋于平缓，说明此次测序样本数量及测序深度均足够。图 1展示了结果的合理性及准确性。Shannon-Wiener曲线反映了各样本在不同测序数量时的微生物多样性，当曲线趋向平坦时说明测序数据可以反映样本中绝大多数的微生物信息(图 2)。
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| 图 1 35日龄盲肠菌群稀释曲线 Figure 1 Dilution curve of 35-day-old cecal flora. A: High-dose group; B: Middle-dose group; C: Low-dose group; D: Control group. |
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| 图 2 35日龄盲肠菌群Shannon-Wiener曲线 Figure 2 Shannon-Wiener curve of 35-day-old cecal flora. A: High-dose group; B: Middle-dose group; C: Low-dose group; D: Control group. |
2.4.2 HDTN对817肉鸡盲肠微生物α多样性及β多样性的影响
α多样性多用于评估群落内物种多样性，β多样性反映的是样本间微生物群落的差异。Chao1指数反映群落中物种丰富度(图 3A)；Shannon指数反映群落的多样性(图 3B)。可以观察到中剂量组在物种丰富度、群落多样性上都要高于其他组。β多样性反映的是样本间微生物群落的差异，中剂量组和低剂量组菌群结构相似度高，高剂量组和对照组与中剂量组和低剂量组的菌群聚类均较远(图 4)。
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| 图 3 35日龄盲肠菌群α多样性指数 Figure 3 Alpha diversity index of 35-days-old cecal colony. A: Species richness Chao1 index. B: Community diversity Shannon index. |
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| 图 4 35日龄盲肠菌群β多样性主坐标分析 Figure 4 Principal coordinates analysis of beta diversity of 35-day-old cecum flora. |
2.4.3 地衣芽孢杆菌对817肉鸡盲肠内容物菌群结构的影响
在门水平上，相对丰度大于1%的有7种菌门，其中厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)是817肉鸡盲肠主要优势菌群。HDTN的添加改变了肠道的优势菌群占比，中剂量组(P < 0.01)和低剂量组(P < 0.05)的厚壁菌门相对丰度均显著高于对照组(图 5)。
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| 图 5 HDTN对肉鸡肠道菌群组成在门水平上的影响 Figure 5 Effect of HDTN on the intestinal flora composition of broiler chickens at the phylum level. A: Distribution of phyla in the top 6 relative abundance of cecum contents. B: Statistical results of phyla in the top 5 relative abundance. The symbol "*" indicates a statistical difference (P < 0.05), and the symbol "**" indicates a significant difference (P < 0.01). |
在属水平上，35日龄时中剂量组拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度与对照组相比增加了4.38%，低剂量组相对丰度与对照组相比也有上升趋势但并不显著；4组间巴恩斯氏菌(Barnesiella)相对丰度差异显著(P < 0.05)，其中中剂量组相对丰度显著低于对照组(P < 0.000 1)；4组间粪杆菌属相对丰度占比分别为高剂量组6.45%、中剂量组7.99%、低剂量组8.68%和对照组5.07%，低剂量组粪杆菌属(Faecalibacterium)相对丰度显著高于对照组(P < 0.05) (图 6)。
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| 图 6 HDTN对肉鸡肠道菌群组成在属水平上的影响 Figure 6 Effect of HDTN on the intestinal flora composition of broiler chickens at the genus level. A: Distribution of the top 18 genera of relative abundance of cecum contents. B: Statistical results of the top 6 genera of relative abundance. The symbol * indicates a statistically significant difference (P < 0.05) and the symbol **** indicates a highly significant difference (P < 0.000 1). |
3 讨论 3.1 生长性能
在养殖业全面限抗的背景下，益生菌制剂可以在对宿主动物无毒副作用、无抗生素残留的前提下，达到提高生长性能和疾病预防的目的。这一优势使益生菌在畜禽养殖业的应用与研究得到发展。
益生菌代谢物中的乳酸及抑菌素等可以调节肉鸡肠道菌群结构、增加饲料转化率，从而使肉鸡生长性能得到提高[14]。秦宋柯等[15]在饲粮中添加地衣芽孢杆菌显著降低了黄羽肉鸡平均日采食量和料重比。Chen等[16]使用地衣芽孢杆菌发酵产物饲喂白羽肉鸡，结果显示3 g/kg的发酵产物在饲养前期即1−35 d，可以提高肉仔鸡的体重和平均日增重并显著提高肉鸡粪便中厚壁菌门的丰度。Gong等[17]在饲粮中添加地衣芽孢杆菌，可提高肉仔鸡的体重和日增重。本研究的动物试验结果显示，在817肉鸡生长前期(1−35 d)添加HDTN表现出良好的促生长作用，在第35天差异达到最大，后期差异逐渐不显著。有研究表明，肠道微生物对氨基酸、碳水化合物等的代谢能力在生长前期逐渐增强，28 d达到最强，后期出现降低或持平[18]。肉鸡肠道发育过程中的换料期即第21天，是肠道菌群变化的关键时期[19]，肉鸡的日龄变化是肠道菌群变化的重要驱动力，同时饮食也在微生物的组成中发挥重要作用，并对肠道环境产生影响[20]。Yang等[21]研究发现，肉鸡肠道微生物多样性和组成在28 d后仍处于动态变化状态，但微生物α多样性已呈下降趋势，肉鸡肠道微生物Shannon指数在第35天达到最大。随着肉鸡日龄的增加，肠道菌群变化趋于平缓、微生物的代谢能力稳定于同一水平，这可能是大多数益生菌在前期发挥促生长作用而后期促生长效果降低的部分原因。
3.2 血清氧化应激指标在家禽养殖过程中环境狭小、养殖密度高、通风保温条件差都容易导致禽类氧化应激，从而抑制家禽的正常生长并诱导疾病及炎症的发生[22]。HDTN的添加提高了肉鸡血清中GSH、CAT、SOD和T-AOC的含量，提示肉鸡抗氧化应激能力得到提高。MDA是脂质过氧化的产物，对细胞有强烈毒性，其含量的降低反映细胞所受损伤降低。益生菌主要通过螯合作用、自身的抗氧化酶系统、抗氧化代谢物(如丁酸盐和叶酸)、介导抗氧化信号通路等方式达到抗氧化应激的作用[23]。Du等[24]研究发现地衣芽孢杆菌代谢物可以使热应激肉鸡空肠SOD活性显著提高，血清、肝脏和空肠黏膜MDA含量降低。宦海琳等[25]研究显示地衣芽孢杆菌可以显著降低十二指肠黏膜MDA含量。邢文杰[26]于饲料中添加丁酸钠，显著降低了母鸡肝脏中MDA的含量，并提高了试验组血清中CAT的水平。本研究中盲肠内容物菌群结果显示，添加HDTN增加了主要产丁酸的厚壁菌门相对丰度。目前已知的产丁酸细菌多属于厚壁菌门[27]。HDTN可能是通过提高肠道丁酸盐含量而进一步提升肉鸡抗氧化应激能力。
3.3 肠道形态饲料在整个家禽生产成本中的占比较高，提高饲料的有效利用率从而提升肉鸡的生产性能，可以有效减少养殖成本[28]。肉鸡的十二指肠和空肠在饲料养分消化和吸收中起着重要作用，小肠发育得好会使肉鸡摄入的营养得到充分吸收，加快生长速度，提高生长性能。长绒毛、低隐窝产生了较高的黏膜表面积和较高的消化效率[29]。周梦佳等[30]使用高、中、低剂量地衣芽孢杆菌饲喂肉鸡，3组的隐窝深度较空白组均有降低。其中高剂量组下降最为显著，使得VH/CD值发生显著升高。本研究结果显示添加HDTN可以提高817肉鸡十二指肠绒毛高度，降低隐窝深度，最终使VH/CD值显著增加，而HDTN对空肠、回肠的影响并不显著。这种对肠道形态的影响，使得817肉鸡更高效地吸收营养物质，降低了饲养成本。
3.4 盲肠菌群禽类的盲肠中含有大量黏液，无食物颗粒，内容物的流速较慢，创造了禽类盲肠复杂的微生物区系环境[31]。陈家祥等[32]研究证明地衣芽孢杆菌可以提高肉鸡盲肠内双歧杆菌和乳酸杆菌的数量。这是因为地衣芽孢杆菌为需氧菌，繁殖过程中消耗氧气促进了厌氧环境的形成，与厌氧益生菌形成共生或促生长关系[33-34]。
本研究选择了生长性能差异最显著的35日龄817肉鸡，并对其盲肠内容物进行了微生物测序。α多样性结果显示中剂量组肠道菌群多样性与丰富度高于其他3组，β多样性中剂量组和低剂量组的菌群相似度高，而高剂量组和对照组有着各自的菌群聚类。结合第35日龄中剂量组与低剂量组之间平均体重差异不显著且均显著高于高剂量组和对照组，提示我们添加适宜剂量的HDTN可能促进817肉鸡形成了利于机体增重的菌群结构。
中剂量组和低剂量组中厚壁菌门的相对丰度发生显著提高，脱硫杆菌门相对丰度发生下降。高剂量组、中剂量组和低剂量组中粪杆菌属含量与对照组相比均有升高，但只有低剂量组的升高具有显著性。粪杆菌属也是丁酸盐的重要生产者之一[35]。郑力维[36]的研究显示饲喂丁酸甘油酯可以提高肉鸡生长性能及肠道微生物多样性。结合以上研究结果，HDTN可能通过提高肉鸡盲肠菌群中产丁酸的厚壁菌门微生物相对丰度，最终达到促进817肉鸡体重增加，提高肉鸡生长性能的结果。拟杆菌具有消化膳食纤维多糖和宿主聚糖的能力，促进营养物质的消化吸收[37]。中剂量组和低剂量组盲肠菌群中拟杆菌属相对丰度与对照相比均有上升趋势。Pan等[38]证实地衣芽孢杆菌DSM5749可以提高蛋鸡盲肠内容物中拟杆菌属的丰度并使空肠VH/CD比值升高，提高生长性能，维持肠道微生态平衡，与本研究结果相同。巴恩斯菌属是新发现菌种，属于拟杆菌门[39]。Rodriguez-Diaz等[40]研究发现非酒精性脂肪肝小鼠的肠道菌群中巴恩斯菌的丰度出现显著性降低。高剂量组、中剂量组和低剂量组肉鸡在第35天较对照组体重出现极显著上升，中剂量组体重最高，快速的体重增加可能导致脂肪堆积使中剂量组盲肠中巴恩斯菌显著降低[40]。
4 结论中剂量组和低剂量组中地衣芽孢杆菌HDTN可用于提高817肉鸡生长前期(1−35 d)的生产性能。地衣芽孢杆菌HDTN在817肉鸡日粮中最适添加剂量为250 g/t (菌粉活菌数为7.0×1010 CFU/g)，最适添加时间为生长前期1−35 d，可加快建立肠道优势菌群，缓解肠道应激。地衣芽孢杆菌HDTN的添加可以改善817肉鸡肠道形态、增强机体抗氧化能力，并加快肉鸡盲肠优势菌群的建立。
致谢
感谢湖北华大瑞尔科技有限公司的彭宏鑫在肉鸡饲养方面的帮助。
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