2024, Vol. 64
表1(Table 1)
疮痂链霉菌拮抗菌的筛选鉴定及特性研究
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20240018
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 王紫薇, 茹素龙, 豆梦言, 赵盼, 李楠, 苏伟强, 徐玉梅, 仲乃琴. 2024
- WANG Ziwei, RU Sulong, DOU Mengyan, ZHAO Pan, LI Nan, SU Weiqiang, XU Yumei, ZHONG Naiqin.
- 疮痂链霉菌拮抗菌的筛选鉴定及特性研究
- Screening, identification, and characterization of Streptomyces scabies antagonists
- 微生物学报, 64(8): 2713-2730
- Acta Microbiologica Sinica, 64(8): 2713-2730
-
文章历史
- 收稿日期：2024-01-06
- 网络出版日期：2024-03-26
引用本文 |
王紫薇, 茹素龙, 豆梦言, 赵盼, 李楠, 苏伟强, 徐玉梅, 仲乃琴. 疮痂链霉菌拮抗菌的筛选鉴定及特性研究[J]. 微生物学报, 2024, 64(8): 2713-2730.
Wang Ziwei, Ru Sulong, Dou Mengyan, Zhao Pan, Li Nan, Su Weiqiang, Xu Yumei, Zhong Naiqin. Screening, identification, and characterization of Streptomyces scabies antagonists[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024, 64(8): 2713-2730.
疮痂链霉菌拮抗菌的筛选鉴定及特性研究
1. 山西农业大学植物保护学院, 山西 晋中 030600;
2. 宁夏大学农学院, 宁夏 银川 750021;
3. 山西农业大学农学院, 山西 晋中 030600;
4. 中国科学院微生物研究所, 北京 100101;
5. 内蒙古自治区马铃薯肥料农药高效利用技术企业重点实验室, 内蒙古 呼伦贝尔 021000;
6. 中科菌悦(惠州)科技有限公司, 广东 惠州 516000
2. 宁夏大学农学院, 宁夏 银川 750021;
3. 山西农业大学农学院, 山西 晋中 030600;
4. 中国科学院微生物研究所, 北京 100101;
5. 内蒙古自治区马铃薯肥料农药高效利用技术企业重点实验室, 内蒙古 呼伦贝尔 021000;
6. 中科菌悦(惠州)科技有限公司, 广东 惠州 516000
摘要：由致病性链霉菌疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)引起的疮痂病已成为威胁马铃薯产业可持续发展的重要瓶颈，以菌治菌是目前最为理想的措施。[目的] 筛选具有解磷功能的拮抗菌株，研究其对马铃薯疮痂病防控的增益效果，为研制复合功能菌剂提供候选菌种。[方法] 采用平板对峙和解磷试验筛选目标菌株，利用形态学观察、生理生化实验及16S rRNA基因测序确定其分类地位；通过盆栽和大田试验研究目标菌株对致病性链霉菌的抑制效果，并分析解磷功能对拮抗效果的增益。[结果] 获得4株对致病链霉菌具有明显拮抗作用的菌株，分别为BN4-4、BN4-5、BN5-2和YN17-2，经鉴定BN4-4、BN4-5为深褐芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)，BN5-2和YN17-2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其中BN4-4和BN5-2具有较强的降解无机磷的能力。4株菌的盆栽试验相对防效分别为71.35%、38.70%、62.18%和36.22%，BN4-4和BN4-5的田间防效分别为69.07%和56.20%。4株菌对茄链格孢菌、尖孢镰孢菌、立枯丝核菌、大丽轮枝菌等植物病原菌具有明显的抑制效果，可耐受pH 1.0−13.0、1%−13% NaCl及80 ℃的高温环境，对阿维菌素、中生菌素、甲基硫菌灵、春雷霉素、多菌灵等生产上常用的杀菌剂不敏感。4株菌均可代谢产生吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)，表现良好的促生增产效果。相比之下，具有解磷功能的BN4-4和BN5-2对疮痂链霉菌的抑制作用较对应的非解磷菌种更佳。[结论] 具有解磷功能的深褐芽孢杆菌BN4-4对致病性链霉菌具有良好防效，该菌株具有较好的广谱抗病性、热稳定性、耐盐碱、促生和定殖能力，对防控马铃薯疮痂病等农作物土传病害具有良好的前景。
关键词：马铃薯疮痂病 疮痂链霉菌 拮抗菌 解磷
Screening, identification, and characterization of Streptomyces scabies antagonists
1. College of Plant Protection, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030600, Shanxi, China;
2. School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, Ningxia, China;
3. College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030600, Shanxi, China;
4. Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
5. The Enterprise Key Laboratory of Advanced Technology for Potato Fertilizer and Pesticide, Hulunbuir 021000, Inner Mongolia, China;
6. Zhongke Junyue (Huizhou) Technology Co., Ltd, Huizhou 516000, Guangdong, China
2. School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, Ningxia, China;
3. College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030600, Shanxi, China;
4. Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
5. The Enterprise Key Laboratory of Advanced Technology for Potato Fertilizer and Pesticide, Hulunbuir 021000, Inner Mongolia, China;
6. Zhongke Junyue (Huizhou) Technology Co., Ltd, Huizhou 516000, Guangdong, China
Abstract: Potato scab caused by Streptomyces scabies has become a bottleneck threatening the sustainable development of the potato industry. Using biocontrol strains to combat bacterial infections is considered an ideal approach. [Objective] We screened the phosphorus-solubilizing antagonistic strains of S. scabies and investigated their effects on the prevention and control of potato scab, aiming to provide candidate strains for the development of composite functional bacterial agents. [Methods] The target strains were screened by plate confrontation and phosphorus-solubilizing tests. Their taxonomic status was determined by morphological observation, physiological and biochemical tests, and 16S rRNA gene sequencing. Pot and field experiments were carried out to measure the inhibitory effects of the target strains on S. scabies, and the relationship between phosphorus-solubilizing function and antagonistic effect was analyzed. [Results] Four antagonistic strains BN4-4, BN4-5, BN5-2, and YN17-2, were screened out. Among them, BN4-4 and BN5-2 showed strong ability to degrade inorganic phosphorus. BN4-4 and BN4-5 were identified as Bacillus atrophaeus, while BN5-2 and YN17-2 as Bacillus subtilis. The pot experiments showed that the relative control effects of the four strains were 71.35%, 38.70%, 62.18%, and 36.22%, respectively. In the field experiments, BN4-4 and BN4-5 showed the control effects of 69.07% and 56.20%, respectively. The four strains exerted inhibitory effects on four plant pathogens: Alternaria solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, and Verticillium dahliae. The four strains showed tolerance to pH 1.0–13.0, NaCl concentration of 1%–13%, and high temperatures (up to 80 ℃). Furthermore, they were insensitive to commonly used fungicides such as avermectin, zhongshengmycin, thiophanate-methyl, kasugamycin, and carbendazim. All the four stains exhibited the ability to metabolize and produce indole-3-acetic acid (IAA), which has been shown to promote the growth and increase the yield of plants. Notably, strains BN4-4 and BN5-2 capable of solubilizing phosphorus exhibited stronger inhibitory effects on S. scabies than the non-phosphorus-solubilizing strains. [Conclusion] B. atrophaeus BN4-4 with phosphorus-solubilizing function demonstrated promising preventive effects against S. scabies. This strain demonstrated broad-spectrum disease resistance, thermal stability, salinity tolerance, plant growth-promoting effect, and colonizing ability, serving as a potential functional strain for preventing and controlling potato scab and other soil-borne diseases in crops.
Keywords:
potato scab Streptomyces scabies antagonists solubilizing phosphorus
马铃薯是全球范围内仅次于水稻、小麦的第三大粮食作物[1]，具有生长周期短、产量高、营养丰富、耐贫瘠、耐干旱、适应性强等优势，对于维持世界人口增长和粮食安全作出了重要贡献[2]。中国是世界上最大的马铃薯生产国，种植面积约4 606千hm2，约占全球总播种面积的1/3[3-4]。
近年来，由致病性链霉菌疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)引起的疮痂病在马铃薯种植区普遍发生，危害程度逐年加重，已成为威胁产业可持续发展的重要瓶颈[5-6]。致病菌具有多样性，其在不同区域差异化分布[7]，主要危害马铃薯块茎表皮，产生疮痂状硬斑，影响其品质和商品性，造成巨大经济损失。病原菌主要通过土壤和种子传播[8]，也可危害胡萝卜和甜菜等根茎类作物。国际上开展疮痂病的防控研究已有100多年，但一直未取得突破性进展，至今尚无值得大面积推广的技术和产品。灌溉[9]、轮作[10]和调节土壤pH值[11]等传统农业措施虽有一定防控效果，但受耕地面积、环境条件等因素的制约，操作难度较大[12-19]。相对而言，生物防治具有对环境友好、使用便捷、防效持久稳定等优势[20-22]，越来越受到人们的重视。目前可用于大面积推广的菌种资源十分有限，迫切需要筛选更多具有活化养分、抗病增产功能的微生物，以实现马铃薯疮痂病的高效防控。
Cao等[23]研究发现，磷肥施用量与马铃薯疮痂病危害程度密切相关，疮痂链霉菌对Ca3(PO4)2的吸收具有趋向性，随着基质中Ca3(PO4)2含量的升高，病原菌繁殖速度加快，块茎发病率和病情指数也随之升高。可见，筛选具有解磷功能的拮抗菌，可能是降低土壤中Ca3(PO4)2含量、实现对马铃薯疮痂病有效控制的重要方向。因此，本研究筛选兼具拮抗和解磷功能的生防菌株，并通过大田和盆栽试验，验证目标菌株对马铃薯疮痂病的防控效果，分析其在土壤中的定殖情况和环境适应性，从而评价菌株产业化应用的前景，为研制高效防控马铃薯疮痂病的复合菌剂奠定理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料土壤样本采自内蒙古自治区呼伦贝尔市海拉尔区马铃薯田(pH为5.9，有机质58.20 g/kg，全氮3.25 g/kg，总磷1.06 g/kg，全钾20.90 g/kg，有机碳33.80 g/kg)，从中分离、纯化获得具有拮抗和解磷功能的菌株。
供试植物病原菌：疮痂链霉菌(S. scabies)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茄链格孢菌(Alternaria solani)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，馆藏编号分别为CGMCC 4.1765、CGMCC 3.1496、CGMCC 3.3758、CGMCC 3.12834和CGMCC 3.2888。
供试马铃薯品种：盆栽试验马铃薯品种为‘夏波蒂’，马铃薯脱毒试管苗由本实验室保存；田间试验品种为‘荷兰15’，脱毒马铃薯种薯由呼伦贝尔市北雪农业科技有限公司提供。
胰蛋白胨大豆肉汤培养(trypticase soy broth, TSB)购自BD公司，30.0 g/L，pH 7.3±0.2；LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，琼脂粉15.0，蒸馏水定容至1 L，pH 7.2；PDA培养基(g/L)：马铃薯200.0，葡萄糖20.0，琼脂粉15.0，蒸馏水定容至1 L，pH 7.2；解磷培养基(g/L)：葡萄糖10.0，(NH4)2SO4 0.5，NaCl 0.3，MgSO4 0.3，MnSO4 0.03，K2SO4 0.3，FeSO4 0.03，CaCO3 5.0，琼脂15.0，蒸馏水定容至1 L，pH 7.0−7.5；King氏液体培养基(g/L)：蛋白胨20.0，K2HPO4 1.5，MgSO4 1.5，琼脂10.0，甘油10 mL，pH 7.0−7.2。
盆栽马铃薯营养液(g/L)：KNO3 50.0，MgSO4·7H2O 5.0，NaH2PO4·H2O 3.0，CaCl2·2H2O 3.0，(NH4)2SO4 2.7，FeSO4·7H2O 5.56，EDTA-2Na 7.46，H3BO3 3.0，MnSO4·4H2O 10.0，ZnSO4·7H2O 2.0，NaMoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，KI 0.75，蒸馏水定容至1 L。
1.2 拮抗菌的分离和筛选细菌培养液的制备：称取5 g土壤样品，加入50 mL无菌水充分振荡后稀释1 000倍。吸取100 µL悬浮液均匀涂布于LB固体培养基上，28 ℃培养24 h，挑取单菌落接种于液体LB培养基中，28 ℃、200 r/min振荡培养24 h。
拮抗菌的筛选：吸取疮痂链霉菌孢子悬浮液100 µL均匀涂布于PDA培养基，接种6 µL待测细菌培养液，28 ℃、200 r/min培养3 d后测量抑菌圈直径。
菌株解磷能力测定：在解磷培养基上接种待测细菌培养液6 µL，28 ℃、200 r/min培养7 d后观察解磷效果。
1.3 拮抗菌的鉴定菌株形态观察：将待测菌液均匀涂布于LB平板上，37 ℃培养24 h，观察菌落形态，扫描电子显微镜观察菌体形状，记录菌株革兰氏染色后的状态。
16S rRNA基因序列分析：采用细菌16S rRNA基因通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′; 1492R: 5′-CTACGGCTACC TTGTTACGA-3′)和gyrB基因引物(5′-GCCTTGT CGACCACTCTTGA-3′; 5′-AATGGCAGTCAGC CCTTCTC-3′)分别进行测序，所得结果在NCBI上比对，采用BioEdit和MEGA 11.0软件构建系统发育树，核酸序列数据存储在国家微生物科学数据中心(National Microbiology Data Center, NMDC)，参试菌株核酸序列编号：NMDCN000370S、NMDCN000370T、NMDCN000370U和NMDCN000370V。
菌株生理生化特性分析：利用梅里埃API 50CHB G+芽孢杆菌鉴定试剂盒(北京兰伯瑞生物技术有限责任公司)测定菌株生理生化性质，挑取单菌落，用无菌水配制高浓度菌悬液，滴入API 50CHB培养基安瓿混匀接种。参照API 50CH试验条说明书判读测试结果，除25号七叶灵柠檬酸铁指示剂由红变黑为阳性外，其余培养基颜色呈现黄色则为阳性。
1.4 盆栽及田间试验盆栽试验：将S. scabies孢子接种于TSB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养7 d，4 000 r/min离心25 min收集菌体，用无菌水悬浮，调节孢子数至1×107 CFU/mL，将500 mL孢子悬浮液均匀拌入蛭石并装至直径17 cm的花盆中，移栽培养20 d的‘夏波蒂’脱毒试管苗，每盆3株，24 ℃恒温培养，15 d后向马铃薯幼苗根部浇施10 mL孢子数为1×108 CFU/mL的拮抗菌悬浮液。以未接种任何菌株的处理为CK1，以只接种S. scabies的处理为CK2。每个处理重复3次，每间隔7 d浇水2 L。
田间试验：试验安排在内蒙古自治区呼伦贝尔市海拉尔区鄂温克旗马铃薯连作3年的地块，2023年5月19日播种。试验设置3个处理，每处理3次重复，随机区组排列，小区面积120 m2，种植密度75 963株/hm2，底肥采用施可丰牌通用型复合肥(总养分≥45%，N: P2O5: K2O=13:17:15)，用量1 124.4 kg/hm2。生育期间追施复合肥2次(N: P2O5: K2O=14:18:12)，每次373.1 kg/hm2，2023年9月3日收获。
结果统计：参考石莹莹等[24]的方法，生长期间定期测定株高、茎粗、叶绿素等指标，收获后测定块茎质量，并依据马铃薯疮痂病分级标准统计发病率、病情指数，计算防治效果。
病害分级标准：0级，薯皮健康，无病斑；1级，块茎病斑面积为0−1/6；2级，病斑面积为1/6−1/3；3级，病斑面积为1/3−1/2；4级，病斑面积为1/2以上。
发病率(%)=发病块茎数/收获总块茎数×100；
病情指数=∑(各病级块茎数×该病级数代表值)/(调查个体总和×最高病级数)×100；
相对防效(%)=(对照组病情指数–处理组病情指数)/对照组病情指数×100。
1.5 菌株特性研究菌株生长状况测定：将待试菌株分别接入LB液体培养基中，实时测定菌液生长量与pH。
菌株抗逆特性分析：将待测菌株分别接种至不同梯度pH和不同NaCl浓度的液体LB培养基中，28 ℃、200 r/min振荡培养12 h后测定其OD600值；待测菌株用不同温度的水浴处理30 min后，取6 µL滴在均匀涂布了疮痂链霉菌的PDA平板上，28 ℃培养24 h后观察拮抗圈大小。
菌株广谱耐药性分析：参考李曦等[9]和李建萍[10]的研究方法，选择15种常见杀菌剂和生物农药，试验测试浓度参考产品说明书。将直径8 mm的滤纸片在药剂溶液中充分浸泡5 min，置于均匀涂布菌株的LB固体培养基上，以浸泡无菌水的滤纸片为对照，28 ℃培养12 h后，观察记录菌株的生长状况。
菌株促生长特性分析：参照李培根等[11]的方法，将吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)标准品配置成10、20、30、40、50 mg/L的标准溶液，与Salkowski比色剂1:1比例混合后，避光常温静置30 min，以蒸馏水与Salkowski比色剂混合为空白对照，测定OD530处的吸光度，并以IAA浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。将待测菌株接种到LB液体培养基中，28 ℃、200 r/min培养48 h，4 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液加入等量的Salkowski比色剂，测定OD530的吸光度，将上述吸光度代入IAA标准曲线获得菌株的IAA产量。
菌株在土壤中的定殖：采用抗生素标记法，将4株待测菌株用利福平和卡那霉素分别进行梯度标记(0.5、1.5、10、50、100、200、300 μg/mL)，以区别马铃薯土壤根际菌，直至获得能够在含300 μg/mL利福平及卡那霉素的LB培养基中稳定生长的双抗菌株。将获得的抗性稳定菌株标记为BN4-4-K、BN4-5-K、BN5-2-K和YN17-2-K，28 ℃培养2 d备用。用灌根法将浓度为1×107 CFU/mL的双抗菌株菌悬液接种于马铃薯幼苗根部周围，每株10 mL，以等量的无菌水作为对照。
分别于处理1、7、14、21、28、35 d后测定马铃薯根际土壤双抗标记菌株的菌体数量。称取1 g植株根际周围2 cm内、深度3−5 cm的土壤，用100 mL无菌水进行梯度稀释，选择10−4、10−5、10−6稀释液200 μL均匀涂布于含300 μg/mL的利福平和卡那霉素平板中，根据定殖量绘制菌株定殖动态曲线[25]。
1.6 数据处理采用Excel和Origin 2019b软件处理数据，系统发育树利用MEGA 11.0软件构建邻位连接法(neighbor-joining, NJ)的Kimura 2-parameter模型，重抽样法(bootstrap test)对发育树分支点的置信度进行评价，重复抽取次数为1 000。
2 结果与分析 2.1 疮痂链霉菌拮抗菌的分离筛选及其解磷效果研究 2.1.1 拮抗菌的分离和筛选经过初筛和复筛分离得到4株对S. scabies具有明显拮抗作用的细菌，编号分别为BN4-4、BN4-5、BN5-2和YN17-2，抑菌圈直径分别为(31.00±1.24)、(31.95±0.91)、(35.82±1.65)和(35.19±1.10) mm，其中BN5-2和YN17-2的抑菌率相近，约为42%，BN4-4和BN4-5抑菌率相近，约为37% (图 1)。
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| 图 1 拮抗菌株对疮痂链霉菌的抑制效果A−D：依次为BN4-4、BN4-5、BN5-2、YN17-2的拮抗圈 Figure 1 Inhibitory effects against Streptomyces scabies CGMCC 4.1765. A−D: Inhibition zone of BN4-4, BN4-5, BN5-2, and YN17-2. |
2.1.2 菌株对无机磷的降解效果
四株菌在解磷培养基上培养7 d后发现，BN4-4和BN5-2的生长速度较快，菌落直径明显大于BN4-5和YN17-2，周围形成半透明状的解磷圈，直径分别为11.20 mm和10.00 mm，表明二者皆具有较强的解磷能力(图 2)。
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| 图 2 拮抗菌株对Ca3(PO4)2的利用效果A−D：依次为BN4-4、BN4-5、BN5-2、YN17-2的解磷圈 Figure 2 Utilization of Ca3(PO4)2 by antagonistic strains. A−D: Inhibition zone of BN4-4, BN4-5, BN5-2, and YN17-2. |
2.2 疮痂链霉菌拮抗菌株的鉴定 2.2.1 菌株形态学观察
如图 3所示，参试菌株的菌落均呈圆形，白色半透明，革兰氏染色呈阳性，菌体杆状，两端钝圆，大小为(0.5−1.5) μm×(0.3−0.6) μm，单个排列。其中BN4-4和BN4-5的菌落边缘光滑，BN5-2和YN17-2表面粗糙不整齐。
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| 图 3 BN4-4、BN4-5、BN5-2和YN17-2的菌落和细胞形态特征A−D：依次为BN4-4、BN4-5、BN5-2、YN17-2的菌落形态. E−H：依次为BN4-4、BN4-5、BN5-2、YN17-2的革兰氏染色结果. I−L：依次为BN4-4、BN4-5、BN5-2、YN17-2的扫描电镜图片 Figure 3 Strain and cell morphological characteristics of BN4-4, BN4-5, BN5-2, and YN17-2. A−D: Colony morphology of BN4-4, BN4-5, BN5-2, and YN17-2. E−H: Gram staining of BN4-4, BN4-5, BN5-2, and YN17-2. I−L: Bacteria of BN4-4, BN4-5, BN5-2, and YN17-2. |
2.2.2 菌株生理生化特性分析
如表 1所示，4株菌均可利用葡萄糖、果糖、山梨醇，均无法分解半乳糖和鼠李糖。BN5-2、YN17-2、BN4-4可以木糖作为唯一碳源；BN5-2和YN17-2能利用阿拉伯糖、甘露醇和核糖，菌株BN4-4和BN4-5可分解山梨糖和甘露糖，但不能分解肌醇。各菌株对七叶灵柠檬酸铁反应均为阳性，可裂解七叶灵分子，释放的葡萄糖分子作为碳源被利用。菌株BN4-4和BN4-5的葡萄糖酸钾反应呈阳性，表明其可氧化葡萄糖酸盐生成2-酮基葡萄糖酸盐。API 50CHB鉴定系统分析表明，4株菌均为枯草芽胞杆菌，鉴定率在97.3%−99.6%之间。依据深褐芽孢杆菌能利用甘露糖，不能利用甘露醇，枯草芽孢杆菌能利用甘露醇，不能利用甘露糖的特点[26]，初步推断菌株BN4-4和BN4-5为深褐芽孢杆菌，BN5-2和YN17-2为枯草芽孢杆菌。
表 1. 菌株BN4-4、BN4-5、BN5-2和YN17-2的生理生化特性
Table 1. Physiological and biochemical properties of BN4-4, BN4-5, BN5-2, and YN17-2
| Test items | BN4-4 | BN4-5 | BN5-2 | YN17-2 |
| d-galactose | − | − | − | − |
| l-arabinose | − | − | + | + |
| d-ribose | − | − | + | + |
| d-xylose | + | − | + | + |
| d-glucose | + | + | + | + |
| d-fructose | + | + | + | + |
| d-mannose | + | + | − | − |
| l-rhamnose | − | − | − | − |
| l-sorbose | + | + | − | − |
| Inositol | − | − | + | + |
| Mannitol | − | − | + | + |
| Sorbitol | + | + | + | + |
| 6, 7-dihydroxycoumarin | + | + | + | + |
| Potassium gluconate | + | + | − | − |
| +: Positive; −: Negative. | ||||
2.2.3 基于16S rRNA和gyrB基因序列的分子生物学鉴定
通过PCR扩增获得4个菌株的16S rRNA基因片段，将各自的序列提交至NCBI数据库进行BLAST分析比对，菌株BN4-4和BN4-5与深褐芽孢杆菌的相似性达到99.0%，BN5-2和YN17-2与枯草芽孢杆菌的一致性达到99.9%以上。利用MEGA 11.0构建系统发育树，如图 4所示，菌株BN4-4和BN4-5与深褐芽孢杆菌B. atrophaeus处于同一分支上，自展值达95.0%；菌株BN5-2和YN17-2与枯草芽孢杆菌B. subtils处于同一分支上，自展值达87.0%。
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| 图 4 基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树括号中数值为GenBank登录号；分支处标注有自展值；标尺0.01代表核苷酸替换率 Figure 4 Phylogenetic tree constructed based on the 16S rRNA gene sequences. Numbers in parentheses are GenBank accession numbers; The bootstrap values are shown at the node; The scale bar indicates 0.01 substitutions per nucleotide position. |
进一步扩增菌株的gyrB基因片段，并利用MEGA 11.0软件构建系统发育树，发现BN4-4和BN4-5与深褐芽孢杆菌JCM 9070聚类到一个分支，BN5-2和YN17-2与枯草芽孢杆菌NCIB 3610聚类到一个分支(图 5)，结合形态学观察和生理生化特性分析结果，确定菌株BN4-4和BN4-5为深褐芽孢杆菌(B. atrophaeus)，BN5-2和YN17-2均为枯草芽孢杆菌(B. subtilis)。
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| 图 5 基于gyrB基因序列构建的系统发育树括号中数值为GenBank登录号；分支处标注有自展值；标尺0.01代表核苷酸替换率 Figure 5 Phylogenetic tree constructed based on the gyrB gene sequences. Numbers in parentheses are GenBank accession numbers; The bootstrap values are shown at the node; The scale bar indicates 0.01 substitutions per nucleotide position. |
2.3 疮痂链霉菌拮抗菌株解磷功能对其拮抗效果的增益 2.3.1 盆栽抑病试验
试验结果如表 2和图 6所示，各组总结薯数除菌株BN5-2处理组略少外，其他各组间无显著差异。其中，水处理组CK1未发生疮痂病，不同拮抗菌处理组发病率均显著低于病原菌处理组CK2，菌株BN4-4处理组发病率最低，为(15.87±3.61)%，显著低于菌株BN4-5处理组；菌株BN5-2处理组发病率为(20.97±3.70)%，显著低于菌株YN17-2处理组。各拮抗菌处理组的病情指数均显著低于病原菌处理组CK2，最低的菌株BN4-4处理组为12.46±1.51，其相对防效较菌株BN4-5处理组提高45.76%，差异达到显著水平。菌株BN5-2处理组病情指数为13.03±4.07，其相对防效达(62.18±7.59)%，较菌株YN17-2处理组提高41.75%，差异达到显著水平。
表 2. 盆栽试验结果
Table 2. Results of pot experiment
| Treatment | Number of grains | Occurrence rate (%) | Disease index | Relative control effects (%) |
| CK1 | 15.00±1.15a | 0.00 | 0.00 | − |
| CK2 | 16.00±1.00a | 95.69±3.73a | 55.68±1.46a | − |
| BN4-4 | 15.00±0.58a | 15.87±3.61c | 12.46±1.51b | 71.35±7.01a |
| BN4-5 | 15.00±0.58a | 33.97±5.74b | 22.99±4.58b | 38.70±11.67b |
| BN5-2 | 13.00±0.58b | 20.97±3.70c | 13.03±4.07b | 62.18±7.59a |
| YN17-2 | 15.00±2.00a | 35.35±4.62b | 26.65±5.80b | 36.22±9.77b |
| Data were presented as mean±SD, means with different letters are significantly different at P < 0.05. “−” indicates that the results will not be discussed. | ||||
|
| 图 6 马铃薯盆栽试验结果 Figure 6 Pot experiment results of potato. A: CK1. B: CK2. C: BN4-4. D: BN4-5. E: BN5-2. F: YN17-2. |
分析上述结果发现，具有解磷功能的深褐芽孢杆菌BN4-4和枯草芽孢杆菌BN5-2对马铃薯疮痂病的防控效果较对应的非解磷菌种更佳。
2.3.2 田间防病试验挑选盆栽试验中效果较好的BN4-4和BN4-5进行田间试验，结果如表 3所示，未施用菌剂的对照组发病率为(94.04±1.25)%，病情指数为45.84±8.00；浇施BN4-4菌液的处理组发病率为(29.10±6.03)%，病情指数为29.11±6.03，相对防效为(69.07±6.29)%；浇施BN4-5菌液的处理组发病率为(41.21±4.94)%，病情指数为41.21±4.94，相对防效为(56.20±4.79)%。上述数据与盆栽试验结果一致，即具有解磷功能的菌株田间防效更佳。可见，筛选具有拮抗和解磷功能的生防菌是实现疮痂病有效防控的重要措施。
表 3. 田间试验结果
Table 3. Results of field experiment
| Treatment | Occurrence rate (%) | Disease index | Relative control effects (%) |
| CK | 94.04±1.25a | 45.84±8.00a | − |
| BN4-4 | 29.10±6.03c | 29.11±6.03b | 69.07±6.29a |
| BN4-5 | 41.21±4.94b | 41.21±4.94ab | 56.20±4.79b |
| Data were presented as mean±SD, means with different letters are significantly different at P < 0.05. “−” indicates that the result will not be discussed. | |||
2.4 疮痂链霉菌拮抗菌株的特性研究 2.4.1 菌株的生长繁育特性
为了进一步了解拮抗菌株的生长繁育特性，将菌株BN4-4、BN4-5、BN5-2和YN17-2分别接入LB培养基中，对其生长量与pH值进行实时测定(图 7)。结果表明，培养8 h时4株菌均结束了对数生长，OD600值分别为1.18、1.08、1.00、1.01，此时培养液pH值分别为6.7、6.7、6.7、6.8。BN4-4和BN4-5在培养18 h后生物量最大，OD600值分别为1.31和1.31，BN5-2和YN17-2在培养20 h后生物量最大，OD600值分别为1.27和1.29。YN17-2在培养24 h时pH达到峰值6.9，菌株BN4-4、BN4-5和BN5-2在培养26 h时pH达到最高值，分别为6.9、6.9、7.0。
|
| 图 7 菌株BN4-4、BN4-5、BN5-2和YN17-2的生长曲线和pH实时测定A：生长量变化曲线. B：pH变化曲线 Figure 7 The growth curves and the pH monitoring values of BN4-4, BN4-5, BN5-2, and YN17-2. A: The growth curves. B: The pH monitoring values. Error bar: Represent standard error, with data from three data duplications. |
2.4.2 菌株耐高温和耐盐碱特性
为了探究目标菌株对环境的适应性，将4株菌分别在37、60、80、100 ℃水浴中处理30 min，结果如图 8A所示。100 ℃处理后4株菌均失去抑菌活性；80 ℃处理后，BN4-4的抑菌圈直径最大，为29.00 mm，BN4-5的抑菌圈直径最小，为19.00 mm。平板计数法统计结果表明，37、60、80 ℃处理后，BN4-4的活菌数分别为6.0×106、1.2×106、2.0×104 CFU/mL，BN4-5分别为5.2×106、8.0×104、1.0×104 CFU/mL，BN5-2分别为5.0×106、6.0×104、1.0×104 CFU/mL，YN17-2分别为7.0×106、6.0×104、1.0×104 CFU/mL。相比较而言，BN4-4具有较好的热稳定性。
|
| 图 8 拮抗菌耐高温及耐盐碱范围 Figure 8 Resistance range of antagonistic bacterial to high-temperature and salt-alkali. A: Inhibitory effect against Streptomyces scabies after heating. B−E: pH resistance test. F−I: NaCl resistance test. Error bar: Represent standard error, with data from three data duplications. A：高温处理后菌株拮抗疮痂链霉菌效果. B−E：pH耐受试验. F−I：NaCl耐受试验 |
将4个菌株分别接种于pH 1.0−13.0、NaCl含量为1%−11%的LB液体培养基中培养24 h发现，4个菌株均可耐受NaCl浓度为11%的高盐环境，在pH 1.0−13.0的条件下均可存活。其中菌株BN4-4、BN4-5和YN17-2可在pH为5.0−9.0的环境中正常生长，菌株BN5-2仅适应pH 5.0−7.0的弱酸性环境。随着培养基NaCl浓度的增加，菌株BN4-4和BN4-5的生物量有所下降；BN5-2和YN17-2在NaCl含量为1%−7%的培养基上可正常生长，OD600值达1.00−1.50。
2.4.3 菌株对常用化学杀菌剂的敏感性不同拮抗菌株对常用杀菌剂的敏感性测试结果见表 4。在沾有无菌水的滤纸片周围4株芽孢杆菌均可正常生长；氟硅唑、氟啶胺、苯醚甲环唑及百菌清对4株菌均有抑制作用。菌株BN4-4、BN4-5、BN5-2对代森锰锌敏感，菌株BN5-2对联苯·啶虫脒和异菌脲敏感。4株拮抗菌的生长均不受阿维菌素、中生菌素、甲基硫菌灵、春雷霉素、多菌灵、噻虫嗪和氟菌·霜霉威的影响。
表 4. 杀菌剂对菌株BN4-4、BN4-5、BN5-2和YN17-2的影响
Table 4. Effect of fungicides on BN4-4, BN4-5, BN5-2, and YN17-2
| Fungicide | Concentration (%) | Resistance | |||
| BN4-4 | BN4-5 | BN5-2 | YN17-2 | ||
| H2O | + | + | + | + | |
| Avermectin | 0.10 | + | + | + | + |
| Zhongshengmycin | 0.10 | + | + | + | + |
| Thiophanate-methyl | 0.01 | + | + | + | + |
| Kasugamycin | 0.05 | + | + | + | + |
| Mancozeb | 0.10 | − | − | − | + |
| Pyraclostrobin | 0.10 | + | + | + | + |
| Carbendazim | 0.10 | + | + | + | + |
| Thiamethoxam | 0.10 | + | + | + | + |
| Flusilazole | 0.10 | − | − | − | − |
| Fluazinam | 0.10 | − | − | − | − |
| Difenoconazole | 0.10 | − | − | − | − |
| Bifenthrin & Acetamiprid | 0.01 | + | + | − | + |
| Iprodione | 0.10 | + | + | − | + |
| Fluopicolide & Propamocarb | 0.10 | + | + | + | + |
| Chlorothalonil | 0.01 | − | − | − | − |
| “+” indicates that fungicides do not affect antagonist growth; “−” indicates that fungicides inhibit antagonist growth. | |||||
2.4.4 菌株的广谱抗病性
为了进一步探究拮抗菌株的生防潜能，通过平板对峙试验测试了其对多种重要植物病原菌的拮抗效果，结果如图 9所示。参试菌株对茄链格孢菌、尖孢镰孢菌、立枯丝核菌和大丽轮枝菌均具有不同程度的抑制效果，具有较好的广谱抗病性。
|
| 图 9 四株菌的广谱抗性 Figure 9 Broad-spectrum resistance of four strains. A−E: Inhibitory effect against Verticillium dahliae. F−J: Inhibitory effect against Rhizoctonia solani. K−O: Inhibitory effect against Fusarium oxysporum. P−T: Inhibitory effect against Alternaria solani. A−E：菌株对大丽轮枝菌的拮抗效果. F−J：菌株对立枯丝核菌的拮抗效果. K−O：菌株对尖孢镰孢菌的拮抗效果. P−T：菌株对茄链格孢菌的拮抗效果 |
2.4.5 菌株促生长效果
将4株菌在King氏液体培养基培养24 h，上清液与比色液混合，观察到混合液均显粉红色，表明4株菌皆可产IAA (图 10A)。对照标准曲线计算(图 10B)，菌株IAA的产量分别为0.012 4、0.010 7、0.003 5和0.004 7 mg/mL。
|
| 图 10 菌株分泌IAA能力测定 Figure 10 Detection of the ability to secrete IAA of strains. A: The result of chromogenic reaction: from left to right are positive control, bacterial solution, and blank control in sequence. B: IAA standard curve. A：显色反应结果：从左至右依次为阳性对照、菌液、空白对照. B：IAA标准曲线 |
用自来水悬浮发酵菌体浇施马铃薯幼苗，45 d后统计叶片叶绿素相对含量(soil and plant analyzer development, SPAD)、株高、茎粗，块茎收获后称取质量。经4株菌处理的植株长势均优于对照(图 11A)，其中，BN4-4处理后的株高、茎粗、SPAD值和块茎质量分别较对照增加了15.05%、19.84%、17.49%和100.35%，差异均达到极显著水平；BN4-5处理后株高、茎径、SPAD值和块茎质量分别较对照增加了11.91%、13.19%、7.72%和52.38%，差异均达到极显著水平；BN5-2处理后株高与块茎质量分别较对照增加了15.78%和41.09%，差异均达到极显著水平，SPAD增加了6.26%，差异达到显著水平；YN17-2处理后块茎质量较对照增加了46.38%，差异达到极显著水平。上述结果表明，4株拮抗菌均表现出良好的促生增产效果，其中BN4-4表现最佳。
|
| 图 11 拮抗菌促生试验 Figure 11 Growth promotion assay of antagonistic bacterial. A: Growth promotion assay in pot. B: Plant height. C: Stem diameter. D: SPAD. E: Tuber mass. The presented values are the means of three determinations, with standard deviations indicated. The presented values are the means of three determinations, with standard deviations indicated; Means with different letters are significantly different at P < 0.05. A：盆栽促生试验. B：植株株高. C：植株茎粗. D：植株叶绿素含量. E：块茎质量 |
2.4.6 菌株在土壤中的定殖力
不同双抗菌株在马铃薯根际土壤中定殖量如图 12所示。随着时间的推移，根际土壤中的4株拮抗菌的数量均呈现下降-上升-下降的趋势。其中菌株BN4-4-K在21 d时的活菌数最多，达9.50×106 CFU/g，35 d时稳定在8.10×106 CFU/g，定殖量相对高于其他菌株。在未添加双抗菌株菌悬液的对照中无标记菌株。
|
| 图 12 不同菌株在根际土壤中的定殖量 Figure 12 The amount of colonization of strains in rhizosphere soil. The presented values are the means of three determinations, with standard deviations indicated. Error bar: Represent standard error, with data from three data duplications. |
3 讨论与结论
随着人们对绿色环保型农产品需求的日益增加，利用生防菌替代化学农药抑制农作物病害的技术越来越受重视。目前，芽孢杆菌是最主要的土壤生防菌，已被应用于多种作物[27-30]，其中，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌，可通过分泌次生代谢物或者影响土壤微生物群落结构，抑制致病性链霉菌生长[31-34]，降低马铃薯疮痂病的危害程度，而关于利用深褐芽孢杆菌防控马铃薯疮痂链霉菌的研究较少[35]。本研究中的2株深褐芽孢杆菌BN4-4和BN4-5对于马铃薯疮痂病的盆栽防效分别为(71.35±7.01)%和(38.70±11.67)%，大田防效达(69.07±6.29)%和(56.20±4.79)%，生防效果优于苏云金芽孢杆菌[24]、解淀粉芽孢杆菌[34]、枯草芽孢杆菌[32]等。
土壤胶体对磷具有较强的吸附和固定作用，磷肥可与土壤中的金属阳离子结合形成包括Ca3(PO4)2在内的不溶性磷酸盐，在土壤中逐年积累[36]。最新研究发现，高磷肥用量会加重马铃薯疮痂病的危害，致病链霉菌对Ca3(PO4)2具有嗜好性，Ca3(PO4)2的逐年富集是加重疮痂病危害的关键因素，筛选解磷拮抗菌是实现高效防控的主要方向[23]。关于拮抗菌解磷能力对病害防控效果增益方面的研究目前尚未见报道。因此，探究解磷菌对疮痂病的防控效果十分必要。本研究设置2组同种、抑菌圈直径相近、解磷能力明显不同的细菌，分别为深褐芽孢杆菌BN4-4和BN4-5 (抑菌圈直径可达31.00 mm和31.95 mm)、枯草芽孢杆菌BN5-2和YN17-2 (抑菌圈直径分别为35.82 mm和35.19 mm)，其中具有较强解磷能力的BN4-4和BN5-2在盆栽和田间试验中防效均较对应的非解磷菌更佳，表明解磷功能对于菌株防控疮痂病效果具有明显的增益，这一结果与Cao等[23]的研究一致，可能是由于解磷菌有效降低土壤中Ca3(PO4)2的含量，不利于病原菌生长[23]，从而提高了防控效果，其机理尚需深入研究。
研究显示[6]，地衣芽孢杆菌(B. licheniformis) A-5在培养皿上的抑菌圈仅为20 mm，显著小于萎缩芽孢杆菌(B. atrophaeus) XJ-3 (49 mm)和耐盐芽孢杆菌(B. halotolerans) KW3-10 (56 mm)，而其对马铃薯疮痂病的盆栽实际防效(68.68%)高于其他2株菌(62.72%和60.24%)。本研究中菌株BN4-4和BN4-5在培养基上的抑菌圈较菌株BN5-2和YN17-2略小，但实际防效高于后者，可见，抑菌圈大小与实际防效之间并非正相关。
综上所述，深褐芽孢杆菌BN4-4具有明显的解磷功能，对马铃薯疮痂病防控效果良好，使用后块茎表面光洁度增强，软腐病和黑胫病的发生率也明显减少，并且菌株的定殖力、广谱抗病性、热稳定性、耐极端盐碱及促生能力均较为突出，具有较好的开发和应用潜力。
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