根瘤菌栖息在豆科植物根瘤内，其生物固氮作用在生态系统的氮循环中发挥特殊的作用^[1]。豆科植物以较低的额外碳成本^[2]向共生根瘤菌换取氮素，以供植物生长发育与繁殖。接种根瘤菌不仅可以促进植物生长，还有许多环境治理价值，如提高土壤肥力^[3]、降解除草剂^[4]与重金属^[5]、改善土壤酸化与板结^[6]等。目前的研究发现，除根瘤菌外，在根瘤内还存在大量非根瘤菌(non-rhizobia endophytes, NRE)^[7]，它们生活史的部分或全部阶段生活于根瘤内，并且不会对宿主植物产生明显的损害作用，所以它们是生活在根瘤中的内生细菌^[8]。目前关于根瘤内生细菌的研究主要集中在根瘤菌的多样性及其功能，对根瘤内的非根瘤菌的研究较少，主要集中在非根瘤菌多样性等方面^[9]，对其所发挥的生态作用，尤其是它们与根瘤菌之间互作关系及其机制还需要深入研究^[8-10]。

目前，已从多种豆科植物根瘤内筛选出不同种类的非根瘤菌，如拉恩氏菌属(Rahnella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、草小螺菌属(Herbaspirillum)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、根瘤内生杆菌属(Endobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、固氮螺菌属(Azospirillum)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)、贪噬菌属(Variovorax)、节杆菌属(Arthrobacter)、小单孢菌属(Micromonospora)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)等^[8]。国内学者也在根瘤内非根瘤菌方面开展了一些研究^[11-17]，根瘤内部的非根瘤菌的研究刚刚起步，我国学者发表了很好的综述^[9-10]。此外，根瘤内的这些非根瘤菌将根瘤作为其栖息和繁殖场所，同时，对宿主植物发挥着广泛的有益效应，包括通过产生长激素和溶磷等方式对宿主植物的促生作用、固氮作用、铁载体介导的互作、提高宿主植物的抗逆能力、对多种植物病原菌有生物防治作用以及提高豆科植物的重金属耐受性等^{[8, 18]}。因此，本着资源经济的原则，豆科植物招募的非根瘤菌的种类与数量是不同的，这受到植物种类及与根瘤菌亲缘关系^[16]的影响。然而，这些非根瘤菌在根瘤内定殖，也会对宿主植物和根瘤菌产生不同的影响。

白刺花[Sophora davidii (Franch.) Skeels]别名马蹄针，为豆科槐属植物，具有良好的抗旱适应性^[19]，是陕北地区绿化和退耕还林的应用树种之一。白刺花在阳坡、半阳坡植物群落演替中处于中间灌丛阶段，为荒山的建群植物种之一，是生境演替先锋种^[20]。其庞大的根系可以改善黄土区土壤结构从而提高土壤抗剪强度^[21]，是固土的理想材料。因此，白刺花在干旱区植物群落演替、维持物种多样性、改良土壤和控制土壤侵蚀等方面具有重要的生态价值。然而，除了对白刺花根瘤菌多样性的研究外，对该植物固氮营养群落的研究较少^[22]。

为探明非根瘤菌物种多样性及其与根瘤菌的协同进化关系，本研究以陕北乡土野生豆科固氮灌木白刺花及其根瘤为材料，采用培养法，分析根瘤内生细菌的物种多样性和系统发育地位，获得群落组成分布和物种丰度等信息，并对筛选到的菌株进行植物回接试验，验证内生细菌的促结瘤能力。最后对分离出的菌株测定其溶磷、固氮、产铁载体、产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)的能力，并以接种小麦幼苗的方式，研究菌株的促生效应。本研究的开展在根瘤微生态学研究上具有重要意义，可为揭示非根瘤菌的起源、进化及与根瘤菌之间的协同进化关系提供理论依据，同时也为它们在陕北地区生态恢复中的应用及巩固退耕还林工程成果提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 培养基和试剂

营养琼脂(nutrient agar, NA)培养基(g/L)：蛋白胨5.00，NaCl 5.00，牛肉膏3.00，pH 7.2，用于细菌传代与培养。酵母甘露醇肉汤(yeast extract mannitol broth, YMA)培养基(g/L)：甘露醇10.00，酵母粉3.00，NaCl 0.10，MgSO₄·7H₂O 0.20，K₂HPO₄ 0.25，KH₂PO₄ 0.25，pH 7.2，用于培养根瘤菌。蛋白胨-酵母-葡萄糖肉汤(peptone yeast glucose broth, PYG)培养基(g/L)：蛋白胨5.00，葡萄糖5.00，酵母粉0.20，NaCl 0.50，牛肉膏3.00，MgSO₄·7H₂O 1.50，pH 7.2，用于培养非根瘤菌。R₂A培养基(g/L)：酵母粉0.50，蛋白胨0.50，酪蛋白水解物0.50，葡萄糖0.50，可溶性淀粉0.50，K₂HPO₄ 0.30，MgSO₄ 0.024，丙酮酸钠0.30，pH 7.5，用于培养生长缓慢的细菌。马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基(g/L)：马铃薯200.00，葡萄糖20.00，pH自然，用于分离培养放线菌与真菌。TY培养基(g/L)：胰蛋白胨5.00，酵母粉3.00，CaCl₂·5H₂O 0.70，pH 7.2，用于制作接种剂。阿须贝氏无氮(Ashby’s broth)培养基(g/L)：甘露醇10.00，MgSO₄·7H₂O 0.20，CaSO₄·2H₂O 0.20，KH₂PO₄ 0.20，NaCl 0.20，CaCO₃ 5.00，pH自然，用于检测菌株固氮活性。Pikovaskaias无机磷(Pikovaskaias inorganic phosphorus broth, PKO)培养基(g/L)：葡萄糖10.00，(NH₄)₂SO₄ 0.50，NaCl 0.30，KCl 0.30，MgSO₄·7H₂O 0.30，FeSO₄·7H₂O 0.03，MnSO₄·4H₂O 0.03，Ca₃(PO₄)₂ 5.00，pH 7.2，用于检测菌株溶磷能力。金氏B肉汤(King’s B broth, King B)培养基(g/L)：蛋白胨20.00，K₂HPO₄ 1.50，MgSO₄·7H₂O 1.50，丙三醇10.00 mL/L，pH 7.2，用于检测菌株产IAA。嗜铁素检测培养基(chrome azurol S assay, CAS)培养基(g/L)：蔗糖2.00，酸水解酪素3.00，CaCl₂ 0.001 1，MgSO₄ 0.002 4，pH 7.5。每100.00 mL未凝固的CAS培养基中，加入CAS染液和磷酸盐缓冲液各5.00 mL，用于检测菌株产铁载体。以上培养基均于121 ℃灭菌20 min，配制固体培养基时需另加入15.00−20.00 g/L琼脂粉。

Salkowski’s试剂：1.00 mL 0.50 mol/L FeCl₃加入49.00 mL 35% HClO₄溶液中，用于检测菌株产IAA。CAS染液：a液：0.12 g CAS溶解于100.00 mL无菌水中，并加入20.00 mL 1.00 mmol/L FeCl₃溶液进行混合；b液：0.15 g十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)溶解于80.00 mL无菌水中；将a液缓慢加入b液中，搅拌混匀即为CAS染液，用于检测菌株产铁载体。

1.2 样品采集和处理

2021年5月，在陕西省延安市6个县区采集了开花期的白刺花根瘤，包括黄陵县(HL)、富县(FX)、宝塔区(BT)、延长县(YC)、志丹县(ZD)和子长市(ZC)。每个县选取3个相隔距离大于10 km的采样点，每个采样点选取3个相隔距离大于1 km的子点。在每个子点中随机选取15棵间距大于30 m的白刺花植株，挖出根部。从每株植物侧根上选取3−4颗大小相近且无损伤的根瘤，去除表面杂质，放入有硅胶的1.5 mL无菌离心管中。具体采样地点信息及方法见参考文献[17]。部分根瘤用于内生细菌分离，其余根瘤存储于−80 ℃，送至北京诺禾致源生物科技有限公司进行高通量测序。

1.3 白刺花内生细菌分离和纯化

选取3−5个新鲜、健康、无损伤的根瘤，用超声波清洗机将根瘤表面清洗干净，于95%的乙醇中浸泡1 min，无菌水冲洗5次，再用3% NaClO浸泡5 min，之后用无菌水冲洗10次。用无菌枪头将根瘤粉碎，将根瘤汁液分别涂抹于NA、YMA、R₂A以及PYG培养基上^[23]，于28 ℃培养箱中培养3−5 d。取最后一次冲洗的无菌水涂布于PDA培养基上作为对照，置于28 ℃培养箱中培养，检验根瘤表面消毒是否彻底。对培养基中长出的菌落，采用稀释平板和划线法进行分离纯化。待长出单菌落，记录菌落形态特征并编号后，将平板保存于4 ℃冰箱备用。

1.4 鉴定从根瘤分离的细菌

使用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提取菌株基因组DNA。利用PCR扩增单菌落的16S rRNA基因序列，引物为细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′)和1492R (5′-CGGGATCCTA CGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′)。PCR反应体系(25 μL)：2×Es Taq MasterMix 12.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板1 µL，ddH₂O 9.5 µL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测16S RNA基因扩增产物，检测条件为120 V、30 min。检测合格后的目的基因扩增产物送至北京擎科生物科技股份有限公司进行测序，引物同每种基因PCR扩增保持一致。将获得的序列提交至NCBI的GenBank数据库，得到菌株登录号。通过BLAST序列比对与已知序列进行同源性分析，选用邻接(neighbor-joining, NJ)法在MEGA X软件中构建系统发育树。

1.5 内生细菌促生特性测定

由于从宝塔区分离得到的192株根瘤内生细菌，占陕北6县区共分离得到的总根瘤内生细菌的60%，因此选择从宝塔区白刺花根瘤中分离得到的内生细菌进行促生特性研究。

1.5.1 固氮能力测定

将以上192株根瘤内生细菌接种于Ashby液体培养基中，以接种无菌水为对照，以上处理均于28 ℃静置培养，7 d后观察培养基是否浑浊，若培养基出现明显浑浊，则该菌株具有潜在的固氮活性。

1.5.2 溶磷能力测定

利用溶磷圈法检测菌株溶磷能力。在PKO固体培养基等距离三点接种以上菌株，于28 ℃培养5−7 d，观察菌落周围是否产生溶磷圈，若有则表明该菌株具有溶磷能力，记录溶磷圈直径D与菌落直径d，并计算其直径比D/d。

定量测定菌株溶磷含量，选择解磷能力的菌株，接种至PKO液体培养基，于28 ℃、160 r/min培养7 d，4 ℃、10 000 r/min离心20 min，用钼锑抗比色法测定上清液中溶磷含量^[24]，根据磷含量标准曲线计算菌株溶磷含量。

1.5.3 产IAA能力测定

使用Salkowski’s比色法^[25]测定菌株产IAA能力。将以上菌株接种于含有色氨酸(1 g/L)的King B液体培养基中，于28 ℃、180 r/min培养3 d，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取2 mL上清液和4 mL Salkowski’s试剂并混匀，室温避光显色30 min，观察混合液颜色是否变为粉色，若混合液变为粉色，则表明该菌株产生IAA。

定量测定该菌株产IAA的量，取4 mL显色完成且呈粉红色的混合液，以未接种菌株的培养基为对照，测量OD₅₃₅吸光值，根据标准曲线计算菌株产IAA量。

1.5.4 产铁载体能力测定

使用CAS培养基定性检测菌株能否产生铁载体^[26]。在CAS平板的3个不同位置接种菌株，于28 ℃培养3 d，观察菌落周围是否出现黄绿色光晕，若出现黄绿色光晕，则表明该菌株可以产生铁载体。

1.5.5 菌株抑制病原真菌能力测定

选择有促生能力的菌株测定其抑制3株病原真菌的能力。选取木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)、甜瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)以及小麦木霉病菌(Fusarium graminearum)作为指示菌，将3株指示菌的菌悬液分别涂布于PDA平板上，然后于平板等距离4点接种各菌株。将平板置于4 ℃过夜后，转移至28 ℃培养2−3 d，随后观察是否出现抑菌效果^[27]。观察菌落周围是否产生抑菌圈，若有则表明该菌株具有抑菌能力，记录抑菌圈直径D与菌落直径d，并计算其直径比D/d。

1.5.6 促生菌株16S rRNA基因测序及分子鉴定

结合促生特性各项指标，选择4株促生特性良好的菌株BT-229、BT-2、BT-108和BT-89进行分子鉴定。

1.6 白刺花根瘤内生细菌的回接试验

用于回接试验的代表菌株从试验筛选获得的55个属320株内生细菌中选取(见附表1，数据已提交国家微生物科学数据中心，编号为NMDCX0000268)。具体的从假单胞菌属(Pseudomonas)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、德沃斯氏菌属(Devosia)和贪铜菌属(Cupriavidus) 7个属中，每个种分类水平下选择一株代表菌株进行回接试验。其余48个属中，每个属对应选一株或几株代表菌株进行白刺花回接试验，供试菌株分组见附表1。将供试菌株菌悬液接种至TY液体培养基中，于28 ℃、160 r/min培养2 d，即为接种剂。

将表面消毒后的白刺花种子放入装有湿润滤纸的无菌培养皿中，于25 ℃催芽，待胚芽长至2 cm左右，播种于装有灭菌珍珠岩和蛭石体积比1:2的花盆中，每盆播种10颗种子。出苗后，每盆定苗6株。每周于处理组植株根部接种对应接种剂30 mL，以不接菌的处理作为对照，以上处理组均做3个重复，放入光照培养箱(光照16 h/黑暗8 h，光照28 ℃/黑暗20 ℃)培养。定期交替灌溉无菌水和无氮培养液。90 d后采集植株，统计结瘤数量与各项指标。

1.7 小麦幼苗促生长盆栽试验

选择4株促生特性良好的菌株BT-229、BT-2、BT-108和BT-89进行小麦盆栽试验，各接种剂处理见表 1。其中菌株BT-229属于根瘤菌属(Rhizobium)，其他3株菌株为非根瘤菌：BT-2属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)，菌株BT-108属于假单胞菌属(Pseudomonas)，菌株BT-89属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

将表面消毒后的小麦种子于接种剂中浸种4 h，之后转入无菌培养皿中，并加入无菌水，于30 ℃催芽，待种子发芽后播种于装有珍珠岩和蛭石体积比1:2的盆钵(20 cm×20 cm)中，每只盆钵播种20颗种子，等小麦苗出齐，每盆定苗10株。每周于各花盆接种对应分组菌悬液50 mL，定期用无菌水浇灌，保持盆体表面湿润。用于回接白刺花的菌体接种体系包括如下几种类型：(1) 白刺花植株用根瘤菌属(Rhizobium)菌株BT-229与1−3种非根瘤菌的不同种类的混合物进行回接试验；(2) 只单独接种根瘤菌属(Rhizobium)菌株BT-229；(3) 只单独接种3种非根瘤菌；(4) 1−3种非根瘤菌组合的混合物进行回接试验，(5) 以无接种处理为空白对照，以上各处理组均为3个重复(表 1)。于30 d后收获植株，测定小麦苗农艺性状，包括株高、根长、干重、鲜重以及叶绿素含量，并对所得数据进行统计分析。

2 结果与分析 2.1 多样性分析 2.1.1 白刺花根瘤内生细菌的分离及纯化结果

本研究从延安市6个县区的白刺花根瘤内共分离得到320株根瘤内生细菌，隶属于4门7纲17目35科55属，其中从宝塔区白刺花根瘤中，分离得到的192株根瘤内生细菌(附表1)。

2.1.2 分子鉴定结果

选用16S rRNA基因通用引物对320株根瘤内生细菌进行菌落PCR扩增并测序，所得基因通过NCBI数据库进行比对。采用培养法获得的320株细菌分属4门，分别为放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)。分属55属，其中47株属于中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)和根瘤菌属(Rhizobium)，其余273株细菌属于以下53个属：不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、农球菌属(Agrococcus)、农霉菌属(Agromyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、波氏菌属(Bosea)、小短杆菌属(Brachybacterium)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、柄杆菌属(Caulobacter)、凯斯特纳菌属(Kaistella)、金黄微菌属(Chryseomicrobium)、柠檬球菌属(Citricoccus)、迪茨氏菌属(Dietzia)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、薄层杆菌属(Hymenobacter)、栖白蚁菌属(Isoptericola)、溶杆菌属(Lysobacter)、马赛菌属(Massilia)、浮游单胞菌属(Planctomonas)、微杆菌属(Microbacterium)、副芽孢杆菌属(Metabacillus)、微球菌属(Micrococcus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、分枝菌酸小杆菌属(Mycolicibacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、鸟氨酸微菌属(Ornithinimicrobium)、类节杆菌属(Paenarthrobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、类谷氨酸杆菌属(Paeniglutamicibacter)、副球菌属(Paracoccus)、原小单孢菌属(Promicromonospora)、假节杆菌属(Pseudarthrobacter)、假棍状杆菌属(Pseudoclavibacter)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、拉氏杆菌属(Rathayibacter)、红球菌属(Rhodococcus)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、斯塔基氏菌属(Starkeya)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、贪噬菌属(Variovorax)、假单胞菌属(Pseudomonas)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、德沃斯氏菌属(Devosia)和贪铜菌属(Cupriavidus)。研究发现，通过培养法，在门水平上得到最多的是变形菌门，共172株，占比53.75%；在属水平上得到最多的是假单胞菌属，共59株，占比18.44%，其次是芽孢杆菌属(57株，17.81%)和中慢生根瘤菌属(37株，11.56%)。

综上所述，白刺花根瘤内生细菌具有丰富的多样性。为了便于区分，每个属选择1株代表菌株，以邻接法通过MEGA X软件构建系统发育树(附表1，图 1)。

2.2 促植物生长效应 2.2.1 菌株促生特性结果分析

本研究中192株白刺花根瘤内生细菌中，共有115株可以在Ashby无氮培养基中正常生长，并且有浑浊现象，表明60.00%左右的白刺花根瘤内生细菌具有潜在的固氮能力(图 2A、2B)；有20株具有溶磷能力，占全部菌株的10.42%，其中BT-89的溶磷能力最高，为6.417 mg/L (图 2A、2B)；78株具有分泌IAA的能力，占全部菌株的40.63%，其中菌株BT-2产IAA的能力最强，产量达46.745 mg/L (图 2A、2B)；18株能够较好地分泌铁载体，其中菌株BT-108的晕圈最大，定性显示其产铁载体的能力最强(图 2A、2B)；4株能抑制1−3种病原真菌(图 2A−2C)。

将4株促生菌株的序列提交到NCBI的GenBank库中，经序列比对，采用MEGA X构建系统发育树，结果显示，菌株BT-2属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)，与短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)序列最大相似率为99.29%；菌株BT-89属于芽孢杆菌属(Bacillus)，与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)序列最大相似率为99.58%；菌株BT-229属于根瘤菌属(Rhizobium)，与吉氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)序列最大相似率达100.00%；菌株BT-108属于假单胞菌属(Pseudomonas)，与地中海假单胞菌(Pseudomonas mediterranea)序列最大相似率达99.29% (图 2D)。

2.2.2 根瘤内生细菌的回接试验对白刺花结瘤的影响

为了鉴定从白刺花根瘤中分离得到的根瘤内生细菌是否具有共生结瘤能力，本研究将55个属的内生细菌分为41个处理组，分别回接于白刺花植株。3个月后，对41组白刺花结瘤情况进行统计。共有5个处理组的白刺花有结瘤现象，每株白刺花结瘤1−2个，分别为处理组36 (HL-2)、处理组25 (YC-39)、处理组27 (YC-2)、处理组26 (BT-30)和处理组28 (ZC-5)。其中HL-2属于苍白杆菌属(Ochrobactrum)，其余4组均属于中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)。其余含有非根瘤菌的处理组和对照组均无结瘤现象。

2.2.3 小麦幼苗促生长盆栽试验

经验证，本研究中选用的4株促生菌株之间均无拮抗反应，可以用来组合作为复合接种剂，研究其对小麦幼苗生长的促进效果。

各处理组与对照组相比，小麦幼苗的株高、根长、叶绿素含量、鲜重和干重均有明显增加。其中对株高影响最大的处理组为HIJ，与对照组相比增加了49.65%；对株高影响最小的处理组为HJK，与对照相比增加了15.19% (图 3A)。对根长影响最大的处理组为HK，与对照组相比增加了45.84%；对根长影响最小的处理组为IJK，与对照组相比增加了8.69% (图 3B)。对叶绿素含量影响最大的处理组为IK，与对照组相比增加了25.48%；对叶绿素含量影响最小的处理组为K，与对照组相比增加了7.30% (图 3C)。对鲜重影响最大的处理组为HIJ，与对照组相比增加了140.00%；对鲜重影响最小的处理组为HJK，与对照组相比增加了60.00% (图 3D)。对干重影响最大的处理组为HK，与对照组相比增加了100.00%；对干重影响最小的处理组为H，与对照组相比增加了50.00% (图 3E)。

综上所述，无论哪种接种处理，都会增加小麦幼苗的株高、根长、干重、鲜重与叶绿素含量，但影响程度存在差异，因此并不能说明单菌接种或多菌接种更具优势。其中处理组HK、HIJ与IK的促生长效果更加显著，可对其进行深入研究，作为开发微生物菌肥的菌株材料。这表明H代表的菌株BT-89，具有显著的溶磷能力，能够明显增加植株根长；I代表的菌株BT-2，具有显著的产IAA的能力，能够明显增加植株叶绿素含量与鲜重；J代表的菌株BT-108可以通过产生铁载体，从而防治植物病害，最终促进植株生长；K代表的菌株BT-229，具有潜在的固氮能力，能够明显增加植株干重。

3 讨论

本研究采用了多种培养基从白刺花根瘤内分离得到320株内生细菌，隶属于4门7纲17目35科55属，这其中包括大量的非根瘤菌，并表现出丰富的物种多样性。通过16S rRNA基因初步明确了分离菌株的系统发育地位，物种多样性与丰度。通过白刺花回接试验，验证了分离菌株的结瘤能力。通过小麦盆栽试验，发掘出一批对植物有明显促生效应的菌株。

豆科植物能够招募大量的非根瘤菌定殖于根瘤，可对宿主植物产生广泛的有益效应。通过16S rRNA基因扩增子测序鉴定从白刺花根瘤内分离培养得到的内生细菌发现，在门水平上，变形菌门占优势地位；属水平上假单胞菌属和芽孢杆菌属占优势地位，这与其优良的促生特性相关。从宝塔区白刺花根瘤内分离得到的192株内生细菌，其中60%的菌株具有一种至多种促生特性：有115株细菌具有固氮能力，有20株细菌具有较好的溶磷能力，有78株具有分泌IAA的能力，有18株能够较好地分泌铁载体。从中选出4株(3株非根瘤菌与1株根瘤菌)促生效果较好的内生细菌BT-2、BT-108、BT-89和BT-229，通过单菌接种和多菌混合接种的方式，对盆栽种植的小麦农艺性状进行测定，结果显示，处理组HIJ对小麦的株高和鲜重促生效果最好，与对照组相比分别增加了49.65%和140.00%；处理组HK对小麦的根长促生效果最好，与对照组相比增加了45.84%；处理组IK对小麦幼苗的叶绿素含量促生效果最好，与对照组相比增加了25.48%。小麦盆栽试验表明，不同菌剂处理均能促进小麦幼苗生长，这与前人的研究一致，芽孢杆菌(Bacillus)^[28]、短芽孢杆菌(Brevibacillus)^[29]、假单胞菌(Pseudomonas)^[30]、根瘤菌(Rhizobium)^[31]均可促进植物生长，这也符合构建生防菌剂^[32]或合成菌肥^[33]的标准，即菌株需要具备解磷、产IAA、产铁载体与抑制病原菌等能力。通过分析各项农艺指标发现，接种方式不同对小麦幼苗不同农艺性状具有不同程度贡献，例如，IK处理组能够促进更高的叶绿素积累，HK处理组对小麦根长有最大的促生效果，HIJ处理组能够促进植株积累更多的鲜重。对比单菌接种、两菌接种与三菌接种效果，发现三菌接种并不比单菌接种和两菌接种更有利，例如，HJK处理组与所有单菌接种和两菌接种处理组相比，对植物鲜重积累的影响最低，出现这种现象的原因可能是由于多株菌混合后产生了某种物质，从而抑制了菌株产生的促生长因子发生效应。结合以上分析以及各组处理对小麦幼苗的促生效果，结果表明与只单独接种根瘤菌相比较，小麦幼苗在根瘤菌与非根瘤菌混菌接种剂后，对小麦幼苗的各项生长参数均表现出更高的促进效果。关于非根瘤菌如何影响植物生长，以及它们与根瘤菌之间的相互关系、作用机理等问题，已成为了微生物分子生态学研究的一个热点。已有研究发现，一些非根瘤菌可以帮助根瘤菌扩大其宿主范围^[34]，也能提高豆科植物共生根瘤菌的结瘤和固氮能力^[35]，还能够参与豆科植物-根瘤菌的共生结瘤过程，包括结瘤信号的建立、根瘤菌-豆科植物识别以及根瘤菌的定殖等^[36]。此外，微生物物种间的代谢交换在自然群落中广泛存在，其互作关系是通过互养(cross-feeding)方式呈现^[37]。然而，关于非根瘤菌与根瘤菌之间的协同进化及互养关系仍不清楚，还需要下一步进行深入研究。综合比较盆栽小麦农艺性状，结果显示，处理组HK、IK和HIJ的促生效果更为显著，因此可选用这3组复合菌剂作为材料进一步研究，将其开发为微生物菌肥供植物生长，以期为微生物菌肥的开发奠定了良好的基础。然而，这最终还需对其在大田应用中进行菌种活性检测，并对实际的促生效果等做进一步深入研究，进而应用于实际大田农作物上，以发挥最大的促生效应。

综上所述，本研究采用传统培养法，对白刺花根瘤中内生细菌的物种多样性开展了全面系统的研究，明确了其系统发育学地位，通过分析非根瘤菌和根瘤菌对植物生长的影响，初步探究了内生细菌的促生效应。由于大量不可培养菌和难培养菌的存在以及培养基的富营养化，培养条件单一等原因，使用传统培养法会导致培养富集物样本量降低，因此不足以反映群落的绝大部分特征^[38-40]。为了更好地深入了解根瘤中内生细菌群落结构及其物种多样性，需要一种更有效的技术。近年来，作为不依赖传统培养方法的分子技术，高通量16S rRNA基因测序解决了这一问题。关于非根瘤菌与根瘤菌之间的协同进化关系仍不清楚，下一步将利用高通量测序技术对白刺花根瘤中的非根瘤菌的多样性开展研究，以探明根瘤这个特殊生境中非根瘤菌群落组成分布和物种丰度。关于非根瘤菌多样性的维持机制与根瘤菌的互作的机制有待于下一步进行深入研究。

4 结论

本研究表明豆科植物白刺花根瘤的内生细菌具有丰富的物种多样性，除根瘤菌外，还存在着大量的非根瘤菌。值得注意的是，部分非根瘤菌对白刺花和小麦表现出较强的促生特性，能够影响植株株高、根长与叶绿素含量等多项农艺指标。本研究结果为今后扩展根瘤菌的研究视野提供理论依据，还能为科学地利用某些具有良好生态适应性和抗逆特性的非根瘤菌，开发出可以提高根瘤菌持久生物活性的复合接种菌剂提供科学依据。