2024, Vol. 64
表1(Table 1)
CRISPR-Cas起源：TnpB与IscB核酸酶的研究与应用进展
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20240099
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 史光亮, 李维, 向华, 龚路遥. 2024
- SHI Guangliang, LI Wei, XIANG Hua, GONG Luyao.
- CRISPR-Cas起源：TnpB与IscB核酸酶的研究与应用进展
- Origin of CRISPR-Cas: progress in research and applications of TnpB and IscB
- 微生物学报, 64(9): 3091-3104
- Acta Microbiologica Sinica, 64(9): 3091-3104
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文章历史
- 收稿日期：2024-02-07
- 网络出版日期：2024-06-03
引用本文 |
史光亮, 李维, 向华, 龚路遥. CRISPR-Cas起源：TnpB与IscB核酸酶的研究与应用进展[J]. 微生物学报, 2024, 64(9): 3091-3104.
Shi Guangliang, Li Wei, Xiang Hua, Gong Luyao. Origin of CRISPR-Cas: progress in research and applications of TnpB and IscB[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024, 64(9): 3091-3104.
CRISPR-Cas起源：TnpB与IscB核酸酶的研究与应用进展
1. 四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610101;
2. 中国科学院微生物研究所, 微生物资源前期开发国家重点实验室, 北京 100101
2. 中国科学院微生物研究所, 微生物资源前期开发国家重点实验室, 北京 100101
摘要：CRISPR-Cas系统是广泛存在于细菌和古菌中的防御系统。基于该系统开发的基因组编辑工具已在大量物种中实现靶向编辑。目前应用最多的是CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a基因组编辑工具，但它们的蛋白大小均超过1 000个氨基酸，不利于递送。来自转座子家族的TnpB和IscB蛋白(大小约400个氨基酸)分别被认为是Cas12和Cas9的祖先蛋白，但其功能直到最近才被解析。它们被统称为专性移动元件引导活性(obligate mobile element-guided activity, OMEGA)蛋白，其引导RNA被称为ωRNA。此后，OMEGA系统成为了基因编辑领域的研究热点之一。OMEGA系统在三域生物中都有广泛分布，而且种类多样。对OMEGA系统的深入研究，将有助于开发精简、高效、安全的新型基因组编辑工具。本文围绕OMEGA系统的发现历程、结构特点、作用机制和在基因组编辑中的应用展开介绍，为新型基因组编辑工具的开发和优化提供参考。
关键词：CRISPR IscB TnpB 专性移动元件引导活性(OMEGA) Fanzor 基因组编辑
Origin of CRISPR-Cas: progress in research and applications of TnpB and IscB
1. College of Life Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, Sichuan, China;
2. State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
2. State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
Abstract: CRISPR-Cas is a defense system ubiquitous in bacteria and archaea. It has been successfully applied in genome editing in a variety of organisms. At present, CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cas12a are the most widely used genome editing tools. However, the large protein sizes of Cas9 and Cas12a (more than 1 000 amino acids (aa)) hinder their delivery. TnpB and IscB (about 400 aa) encoded by the transposon family are considered ancestors of Cas12 and Cas9, respectively, whereas their functions are revealed just recently. They are named as obligate mobile element-guided activity (OMEGA), with the associated RNA named ωRNA. Since then, the OMEGA system has become one of the research hotspots in genome editing. OMEGA systems are diverse, with wide distribution in all the three domains of life. The in-depth research on the OMEGA system will aid in the development of new genome editing tools that are streamlined, efficient, and safe. Here, we reviewed the discovery history, structural characteristics, mechanisms of cleavage, and genome editing applications of OMEGA systems, aiming to lay a foundation for the development and optimization of genome editing tools.
Keywords:
CRISPR IscB TnpB obligate mobile element-guided activity (OMEGA) Fanzor genome editing
CRISPR-Cas系统由成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)组成。其中CRISPR结构由高度保守的重复序列(repeat)和来自病毒等可移动元件的间隔序列(spacer)组成。CRISPR-Cas系统的发现始于1987年[1]。2007年，该系统被证明具有抗病毒防御功能，获得了更多关注[2]。紧接着，在随后不到5年时间里，CRISPR-Cas系统的基本防御机制被解析[3-5]。2012年，基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术诞生[6]。2013年，CRISPR-Cas9技术被成功应用于人体细胞的基因组编辑[7]。该技术由引导RNA (guide RNA, gRNA)引导Cas核酸酶对基因组上的靶位点进行切割，激活胞内的修复途径从而实现基因组编辑，具有易编程(gRNA序列易改变，利用gRNA与DNA的碱基匹配实现特异性靶向)、组分简单、高效、特异等优点。随后多样化的CRISPR-Cas基因组编辑技术被应用于多种生物体的基因组编辑[8]，如古菌[9-10]、病原细菌[11]、农作物[12]、灵长目动物[13]，加速了生命科学领域的发展，并在农业育种、基因治疗等方面展现了巨大的应用前景。2020年，诺贝尔化学奖授予了CRISPR-Cas9技术的两位发明者，表彰她们在基因组编辑领域的重大发现[14]。当前，CRISPR-Cas编辑技术及其衍生的单碱基编辑技术和先导编辑技术已成为基因组编辑领域的主流技术[8]。
目前广泛应用的CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a编辑技术所使用的核酸酶大小超过1 000个氨基酸，并且在使用载体递送时还需整合启动子、终止信号等调控序列，不利于递送。此外，基于CRISPR-Cas系统开发单碱基编辑或者先导编辑工具，需要再融合脱氨酶、逆转录酶或糖基化酶等不同的功能元件，使编辑工具进一步增大[15-18]。常用的腺相关病毒(adenovirus-associated virus, AAV)递送工具载量约4.7 kb，无法采用单AAV递送大型的编辑工具，而采用双AAV递送策略时，通常编辑效率低于单AAV递送[19-20]。对于基因编辑工具，除了小型化的需求，还存在降低脱靶效率、提高精确性、减小原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)限制等需求[8, 21]。例如疾病治疗要求最小化的脱靶效率和高度的精确性，而CRISPR-Cas9等系统会在非靶标位点发生切割并引起染色体异位等问题[22]。此外，PAM基序是CRISPR-Cas系统靶向识别的重要元件，CRISPR-Cas系统会先识别PAM (通常2−5 nt，紧邻spacer匹配区域)进行靶标和非靶标的区分，之后若gRNA与靶标形成完全的碱基匹配，则Cas蛋白可对靶标进行切割[23]。然而，通过工程化改造拓展PAM识别谱的编辑工具通常编辑效率也会降低[24]。
近几年，来自转座子家族、高度丰富的OMEGA系统(TnpB、IscB等)[25]获得了广泛的关注。它们被认为是Cas9和Cas12的祖先蛋白，具有紧凑的蛋白大小(约400个氨基酸)和多样化的类型，并被证明具有RNA引导的核酸酶活性[25-26]。值得注意的是，在真核生物中广泛存在的Fanzor蛋白(TnpB同源蛋白)也被证明具有RNA引导的核酸酶活性，表明RNA引导的核酸酶系统广泛存在于三域生物中[27]。OMEGA系统的作用机制和空间结构与已报道的CRISPR-Cas系统存在许多相同点，同时存在许多差异。OMEGA系统不但蛋白体积小，还具有开发成编辑工具的其他优势，如部分系统具有识别单碱基PAM、无旁系切割活性或脱靶效率低等特点[25, 27-28]。本文对OMEGA系统的发现历程、作用机制和应用进展进行介绍，希望对基因组编辑工具的开发和优化提供参考。
1 OMEGA的发现CRISPR-Cas系统分为2个类群，并进一步分为6种类型和超过30种亚型。类群1中结合gRNA并参与靶标识别和干扰的效应物(effector)是由多种蛋白形成的复合体，类群2的效应物是由多个结构域组成的单一蛋白；类群2包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型系统，其中Ⅱ型和Ⅴ型系统通常由gRNA引导效应蛋白靶向切割DNA，Ⅵ型系统由gRNA引导效应蛋白靶向切割RNA；CRISPR结构转录后经过Cas等蛋白的加工，可以得到成熟的短CRISPR RNA (crRNA)[29]。此外，Ⅱ型系统和部分Ⅴ型系统会编码一个与repeat部分互补配对的反式激活RNA (trans-activating CRISPR-associated RNA, tracrRNA)，参与crRNA的成熟过程，并与crRNA形成杂交链共同指导Cas蛋白识别靶标[23]。Jinek等将CRISPR-Cas9系统中的tracrRNA与crRNA人工嵌合成一条单链引导RNA (single guide RNA, sgRNA)，因此，只需要sgRNA和Cas9蛋白2个组分即可进行靶向切割[6]。
目前开发的基因组编辑工具主要基于Ⅱ型和Ⅴ型系统，它们的效应蛋白分别为Cas9和Cas12。来自转座子家族的TnpB和IscB蛋白可能分别是Cas12和Cas9的祖先蛋白[29-32]。值得注意的是，过去认为CRISPR样系统只存在于原核生物中，但是最近在真核生物中也挖掘出TnpB和IscB的同源蛋白，并证明它们具有RNA引导的核酸酶活性[25, 27]。对OMEGA的发现过程进行梳理，将有助于挖掘更多的同源蛋白用于开发新型基因组编辑工具。
1.1 原核生物中的OMEGA 1.1.1 Cas12的祖先TnpB转座子在生物体的进化过程中起着重要的作用，参与了许多生命过程。其中IS200/IS605和IS607家族均属于最简单、最古老的转座子家族之一，在原核生物中广泛存在[33]。这些转座子由TnpA转座酶催化转座，转座子末端通常存在左端(left end, LE)和右端(right end, RE)回文结构，可以被转座酶识别并切割[34-36]。此外，这些转座子通常还编码TnpB蛋白[33]。早期的研究发现TnpB在TnpA介导的转座过程中不是必需的，认为其可能参与转座调控[37]。
TnpB与Cas12蛋白具有同源性，同源区域包括RuvC样核酸酶结构域和富含精氨酸的桥式螺旋(bridge helix, BH)结构；由于不同Cas12亚型的效应蛋白与不同的TnpB家族蛋白接近，不同的Cas12亚型效应蛋白可能是由不同的TnpB家族蛋白独立进化而来[31-32]。另一方面，TnpB的结构解析结果显示TnpB具有Cas12家族蛋白的最小结构和功能核心，进一步证明了TnpB是Cas12的祖先[38-39]。目前已鉴定出十余种Cas12亚型，使Ⅴ型系统成为了亚型种类最多的CRISPR-Cas类型。Cas12家族蛋白中Cas12f的大小与TnpB最接近，约400−700个氨基酸，前期的研究通过系统发育和功能分析提出Cas12f与TnpB关系最接近[25-26, 29, 32]。最近，Chen等对Cas12n (过去称为V-U4，由于缺少功能研究未被定义为Cas12亚型[32])进行研究(大小约400−700个氨基酸)，证明其具有RNA引导的核酸酶活性；他们结合系统发育和功能分析证明，Cas12n是目前发现最接近TnpB的Cas12亚型[40]。鉴于TnpB的多样性和分布广泛性，可能还有许多新的Cas12亚型等待挖掘。
1.1.2 Cas9的祖先IscBCas9也存在大量同源蛋白，同源区域包括BH结构、HNH核酸酶结构域和被它们插入的RuvC样核酸酶结构域；这些同源蛋白也属于IS200/IS605家族，其所属转座子被命名为Cas9样插入序列(insertion sequences Cas9-like, ISC)；这些同源蛋白被命名为IscB，被认为是Cas9的祖先[30]。由于TnpB在原核生物中的分布远超过IscB，并且具有最简单的结构域，IscB可能也起源于TnpB[30-32]。Altae-Tran等进一步挖掘Cas9同源蛋白，发现了许多蛋白家族[25]。其中一类蛋白包含被BH结构插入的RuvC样结构域，但缺少HNH结构域，蛋白大小约350个氨基酸；其N端和IscB相似，具有PLMP结构域(根据其PLMP保守基序命名)，但其仅具有单链切口酶活性[25]。这类蛋白同样属于IS200/IS605家族，之前被命名为IscB1[30]。为突出其结构域组成，Altae-Tran等将其重新命名为RuvC样插入序列B (insertion sequence RuvC-like OrfB, IsrB)；他们还发现了一个更小的蛋白家族，大小仅约180个氨基酸，只包含PLMP结构域和HNH结构域，缺少RuvC样结构域，被命名为HNH样插入序列B (insertion sequence HNH-like OrfB, IshB)；另一方面，他们发现了Cas9的2个新分支：一个分支被定义为新的Ⅱ-D亚型，具有较小的Cas9尺寸(约700个氨基酸)，另一个分支属于Ⅱ-C亚型，具有较大的Cas9尺寸(> 1 700个氨基酸)[25]。
系统发育分析结果表明，所有的Cas9蛋白均起源于同一个IscB进化支，crRNA和tracrRNA可能均由ωRNA进化产生；结合这些蛋白上下游序列中TnpA、CRISPR序列、Cas适应元件(参与spacer获取的蛋白，包括Cas1、Cas2、Cas4)等出现的情况，Altae-Tran等提出IsrB可能是由紧凑的RuvC核酸酶进化而来，之后IsrB获得了HNH结构域(可能是插入了IshB样的蛋白)，形成IscB家族[25]。结构解析的结果进一步支持以上结论[41-42]。对于TnpB与IscB的进化关系及TnpB如何从RuvC核酸酶进化而来，还有待深入研究。
1.2 真核生物中的OMEGATnpB和IscB的同源蛋白也出现在真核细胞中[25, 43]，并且同样具有RNA引导的核酸酶活性[25, 27, 44-45]。2013年，真核细胞中TnpB的同源蛋白首次被报道，被称为Fanzor，广泛存在于不同的真核物种及其病毒中[43]。Fanzor蛋白分为两类，其中Fanzor1通常存在于不同的真核转座子中，Fanzor2只来自IS607样的转座子[43-45]。Yoon等对TnpB和Fanzor进行系统发育分析发现，Fanzor均起源于IS607家族的TnpB；他们提出Fanzor的祖先蛋白可能通过水平转移从原核生物进入真核生物，产生Fanzor2，随后Fanzor2在真核生物中通过病毒传递等方式扩散，并被真核转座子整合；在这个过程中，蛋白体积逐渐变大，最后产生Fanzor1[45]。此外，编码Fanzor的基因具有内含子和核定位信号，也表明其在真核细胞中经过了长期的适应过程[44]。另一方面，Altae-Tran等在一种陆生绿藻的叶绿体基因组中发现了多个IscB，并证明其中1个完整的IscB具有核酸酶活性[25]。目前，尚未在高等动物中发现Fanzor系统。真核生物中IscB的分布情况也有待进一步研究。
1.3 OMEGA的生理功能在OMEGA的核酸酶活性被证明后，这些广泛存在的OMEGA的生理功能被进一步解析。Karvelis等在研究来自耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans) ISDra2的TnpB (ISDra2 TnpB)时，发现其识别的PAM序列(5′-TTGAT-3′)正好与该转座子中TnpA转座酶切割和插入的识别序列一致[26]。该序列也由此被称为转座子相关基序(transposon-associated motif, TAM)[25-26]。TnpA转座酶和TnpB核酸酶识别序列的一致性，暗示了转座和靶向切割之间的紧密联系；Karvelis等基于该现象提出TnpB的功能可能是在TnpA切除转座子序列后，对转座子两侧序列的连接处进行特异切割产生双链断裂，引起胞内的重组修复，从而使子代细胞中都保留原位的转座子[26]。Xiang等对大量TnpB系统进行测试，进一步证明TnpB识别的TAM与TnpA识别序列相同，即与LE上游4−5 nt序列一致[46]。Meers等对来自嗜热嗜脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的多个TnpB和IscB进行研究，同样发现这些蛋白可以特异切割转座子两侧序列的连接产物；此外，与单独表达TnpA相比，共表达TnpA和TnpB显著提高了转座子原位保留的数量；以上结果证明TnpB和IscB的功能是避免转座子丢失，促进转座子保留和扩散[47]。真核生物中OMEGA的生理功能是否与原核生物中相同还有待实验验证。
2 OMEGA系统的特征TnpB与IscB系统都是由核酸酶和ωRNA组成的(图 1)，ωRNA包括形成复杂三维结构的支架区和与靶标DNA互补配对的引导区；虽然OMEGA系统中核酸酶尺寸很小，但与crRNA相比，ωRNA通常更长并且是高度结构化的[27, 38-39, 41-42] (图 2)。这些系统具有独特的结构和靶向识别与切割机制，为基因组编辑工具的开发提供多样化的选择。
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| 图 1 OMEGA和CRISPR-Cas系统示意图 Figure 1 Schematic representation of OMEGA and CRISPR-Cas systems. This figure was drawn by the authors based on literature information to compare TnpB/Fanzor, Cas12n, IscB, and Cas9 systems. Left: Gene architecture of different systems; Right: Schematic of effector-gRNA-target DNA ternary complexes. Scissors indicate cleavage sites. |
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| 图 2 不同类型的gRNA结构 Figure 2 Structures of different kinds of gRNA. This figure was drawn by the authors based on literature information to compare scaffold of ωRNA from ISDra2 TnpB (PDB ID: 8H1J)[38], sgRNA from an uncultured archaeon Cas12f (PDB ID: 7C7L)[48], and crRNA from Lachnospiraceae bacterium Cas12a (PDB ID: 5XUS)[49] ternary complexes. Green molecules indicate spacer region (guide); Grey molecules indicate tracrRNA-derived region. |
2.1 TnpB的特征
TnpB核酸酶来自IS200/IS605或IS607转座子家族，是原核生物中分布最广泛的蛋白之一，远超过IscB、Cas9或Cas12的分布[25, 30]。其ωRNA与TnpB编码区的3′端有重叠，并包含了该转座子的RE序列，因此也被称为右末端元件RNA (right end element RNA, reRNA)[26] (图 1)。
2023年4月，2个实验室分别通过冷冻电镜解析了ISDra2 TnpB-ωRNA-靶标DNA三元复合物的结构[38-39]。ISDra2 TnpB蛋白大小为408个氨基酸，也是首个被成功用于真核细胞基因组编辑的TnpB蛋白[26]。冷冻电镜结果显示，ISDra2 TnpB具有Cas12家族蛋白的最小结构和功能核心，也能形成二裂片结构，包括N末端的核酸识别裂片(recognition, REC)和C末端的核酸酶裂片(nuclease, NUC)；其ωRNA长度约150 nt，由116 nt的支架区和16 nt的引导区组成，包括4个茎和1个假结(茎环结构中的环上序列与其他部位的序列碱基配对，形成类似“打结”形状)，假结也在所有Cas12系统中保守存在[38-39]。然而TnpB与Cas12系统也存在显著差别。结构比较结果显示，部分ωRNA区域发挥了Cas12蛋白某些结构域的功能[38-39]。此外，单个ISDra2 TnpB蛋白会被单一的ωRNA引导，而某些Cas12蛋白会形成不对称的二聚体(如Cas12f)，并且需要双RNA引导(tracrRNA和crRNA)[48, 50] (表 1)。结构分析结果表明，进化过程中Cas12可能通过形成不对称的二聚体或者插入多样化的REC2结构域来识别PAM远端的引导序列，从而获得参与CRISPR-Cas适应过程的结构基础；而双RNA引导序列可能是由ωRNA进化而来[38]。
表 1. OMEGA和CRISPR-Cas系统特征分析
Table 1. Characteristics of OMEGA and CRISPR-Cas systems
| Effector | Protein length (aa) | TracrRNA | Cleavage pattern | Collateral activity | Reference |
| TnpB (monomer) | ~400 | No | 5′ overhang | Yes/No | [25-26, 38-39, 44] |
| Fanzor (monomer) | 400−800 | No | 5′ overhang, 3′ overhang, blunt end | No | [27, 44-45] |
| Cas12n (likely monomer) | 400−700 | Yes | 5′ overhang | Yes | [32, 40] |
| Cas12f (asymmetric dimer) | 400−700 | Yes | 5′ overhang (three cuts) | Yes | [29, 32, 48, 50-51] |
| Cas12a (monomer) | 1 200−1 500 | No | 5′ overhang | Yes | [52-54] |
| IscB (monomer) | ~400 | No | 5′ overhang (three cuts) | Not tested | [25, 41-42] |
| Cas9 (monomer) | > 700 | Yes | Blunt end | No | [6, 25, 54-56] |
Xiang等对TnpB系统进行深入分析，结合其生理功能，发现其ωRNA支架区和TAM序列均可通过生物信息分析预测[46]。TnpB系统的TAM序列通常为4−5 nt，大多有T碱基偏好[46, 57]。体外生化实验结果表明，TnpB可以加工其自身mRNA产生ωRNA[57]。TnpB具有依赖TAM的双链DNA切割活性，产生黏性末端，形成5′端突出；此外，TnpB还具有不依赖TAM的单链DNA切割活性[25-26]。在识别单链或双链DNA靶标底物后，其旁系切割活性会被激活，可以对单链DNA进行非特异的切割[25, 39]。许多Cas12蛋白也具有旁系切割活性，这种特性已被用于开发核酸检测工具[40, 54, 58]。此外，Xu等对来自极端嗜热古菌的TnpB进行了生化特征研究，该蛋白适用温度范围广，在37−85 ℃条件下都有切割活性[59]。
2.2 Fanzor的特征Fanzor系统广泛存在于真核生物及其病毒中，如真菌、藻类和软体动物[27, 43-45]。Fanzor起源于TnpB系统，其ωRNA也位于TnpB编码区的下游，有时会与编码区存在部分重合[27] (图 1)。Saito等通过冷冻电镜方法对来自土壤真菌(Spizellomyces punctatus)的Fanzor1 (SpuFz1)进行研究，解析了SpuFz1-ωRNA-靶标DNA三元复合物的结构；SpuFz1具有与TnpB相似的核心区，由REC和NUC裂片形成二裂片结构；其ωRNA包括75 nt的支架区和15 nt的引导区，形成2个茎和1个连接区；值得注意的是，与TnpB系统的ωRNA相比，SpuFz1系统的ωRNA缺少假结[27]。对Fanzor系统的ωRNA进行二级结构预测，结果显示Fanzor2的ωRNA能形成假结，但是Fanzor1的ωRNA不能形成假结[45]。目前，还未见关于Fanzor2结构的报道，对其结构的解析将有助于深入比较不同Fanzor的差异及Fanzor与TnpB的差异。
Fanzor蛋白识别的TAM碱基数通常为5 nt以内，但不局限于4−5 nt，不同的Fanzor蛋白偏好的碱基类型多样；Fanzor具有多样化的切割模式，能产生5′端突出、3′端突出或钝末端；Fanzor仅切割具有TAM的靶标双链DNA，对单链DNA或RNA均不切割[27]。Fanzor与TnpB蛋白的序列比对结果显示，Fanzor和部分TnpB的RuvC活性位点发生了重排[44-45]。值得注意的是，这些RuvC活性位点发生了重排的系统均无显著的旁系切割活性[27, 44] (表 1)。这一特征为开发更安全的小型化基因组编辑工具提供可能。
2.3 IscB的特征IscB核酸酶来自IS200/IS650转座子家族，其ωRNA转录自IscB上游序列，结构具有多样性，通常超过200 nt[25] (图 1)。Schuler等对来自肠道宏基因组数据的OgeuIscB蛋白进行研究，通过冷冻电镜解析了OgeuIscB-ωRNA-靶标DNA三元复合物的结构，其中OgeuIscB核酸酶的大小为496个氨基酸；ωRNA为222 nt，包括16 nt的引导区[42]。OgeuIscB也是首个被成功用于真核细胞基因组编辑的IscB蛋白[25]。OgeuIscB与Cas9系统在结构形成、与核酸的结合方式等方面都具有相似性；OgeuIscB与Cas9蛋白最大的结构差异是OgeuIscB缺少REC裂片；不过，OgeuIscB系统中的ωRNA形成了复杂的三级结构(包括5个茎环和1个假结)，发挥了Cas9的REC裂片功能；因此，OgeuIscB系统形成了更扁平的二裂片结构；Cas9的gRNA也保留了部分与ωRNA相似的结构，包括假结；此外，IscB蛋白的N端具有PLMP结构域，可能参与稳定IscB-ωRNA复合物，而Cas9蛋白中不包含该结构域[42]。Kato等也对OgeuIscB三元复合物进行了结构解析，进一步验证了以上结果[41]。比较OMEGA系统与CRISPR-Cas系统的结构特点可以发现，进化过程中RNA的功能逐渐被蛋白取代，这些结果为RNA世界假说提供了支持，即RNA是生命的源头，生命进化的早期没有蛋白质，是RNA发挥催化功能[60-61]。
IscB识别的PAM也被称靶标邻近基序(target-adjacent motif, TAM)，其识别的TAM碱基数通常为5 nt以内，不同的IscB蛋白偏好的碱基类型多样[25]。Altae-Tran等对来自瓦氏别样着色菌(Allochromatium warmingii)的IscB (AwaIscB)进行研究，结果显示其在靶标链上的切割位点位于TAM上游3 nt处，与Cas9一致；然而其在非靶标链上的切割位点位于TAM上游8 nt或12 nt处，最终形成5′端突出，不同于Cas9切割双链主要产生钝末端[25, 56] (表 1)。Altae-Tran等突变AwaIscB的RuvC活性位点后，其无法切割非靶标链；突变HNH活性位点后，其无法切割靶标链；突变以上2个结构域的活性位点后，其无法切割任一条链[25]。值得注意的是，来自真核生物绿藻叶绿体基因组的IscB蛋白具有简单的NNG-TAM偏好[25]。这种具有简单TAM偏好的系统，有望构建TAM限制小的基因组编辑工具。
3 OMEGA系统的应用 3.1 TnpB的应用Xiang等对TnpB进行了大规模挖掘和分析：第一轮筛选出64个TnpB，其中25个在大肠杆菌中有活性，3个在人体细胞中有活性；结合TnpB的生理功能对这些系统的特点进行分析发现，其ωRNA支架区和TAM序列均可通过生物信息分析准确预测；对可能影响TnpB活性的因素进行分析，提出来自多拷贝转座子的TnpB系统可能具有更高的活性；对有活性和无活性的TnpB进行比较，鉴定了10个可能影响活性的保守氨基酸位点[46]。以上分析为大规模筛选高活性TnpB核酸酶奠定了基础。他们基于以上结果重新设定筛选标准，进行了第二轮筛选，获得14个TnpB：其中8个在大肠杆菌中有活性，2个在人体细胞中有活性；相比于第一轮，他们得到的在大肠杆菌中有活性的TnpB比例从39.1% (25/64)提高到57.1% (8/14)，在人体细胞中有活性的TnpB比例从4.7% (3/64)提高到14.3% (2/14)；第二轮筛选出的ISAam1和ISYmu1在人体细胞中展现出最好的编辑效果，蛋白大小分别为369个氨基酸和382个氨基酸[46]。他们将这2个系统和SaCas9[62]及2个优化后的Cas12f突变体(Un1Cas12f1[63]和CasMINI[64])进行比较，分别在人和小鼠的细胞系及小鼠体内进行基因组编辑测试，结果显示这2个TnpB系统与SaCas9编辑效率相当，比Cas12f突变体效率高，特异性也不低；在目前已知的基因组编辑工具中，ISAam1具有最小的CRISPR样效应蛋白[46]。此外，Li等对ISDra2 TnpB系统的ωRNA进行多轮工程化改造，获得了高效的变体；将其用单AAV递送至小鼠肝脏，实现了酪氨酸血症的治疗；全基因组脱靶分析未检测到显著的脱靶现象，表明TnpB编辑工具有较高的安全性[28]。另一方面，Xu等利用来自极端嗜热古菌的TnpB开发了可以用于古菌和细菌的基因组编辑工具，其蛋白的高稳定性具有递送优势[59]。该工作也提示，广泛存在的OMEGA系统为大量生物体开发内源性的基因组编辑工具提供可能。
3.2 Fanzor的应用Saito等选择了4个在体外实验中验证有切割活性的Fanzor系统在人体细胞中进行基因组编辑测试，包括2个Fanzor1系统和2个Fanzor2系统；他们在人体细胞中选择了8个靶点进行测试，其中3个系统能检测到编辑活性，包括SpuFz1，但效率均不高；于是他们进一步对SpuFz1蛋白及其ωRNA进行改造，改造后SpuFz1编辑效率显著提升，可达18.4%[27]。Jiang等测试了4个Fanzor2系统和1个Fanzor1系统，它们在人体细胞中的编辑效率可达15%[44]。目前Fanzor系统在人体细胞中的编辑效率仍较低，需要挖掘更多的Fanzor系统进行测试或进一步改造已有系统。
3.3 IscB的应用Han等对OgeuIscB蛋白及其ωRNA进行工程化改造，获得了可以对哺乳动物进行高效基因组编辑的工具；结合结构数据，他们对ωRNA进行了部分删除和突变，也对蛋白进行了选择性突变和扫描突变，最终获得的系统被命名为工程化改造的IscB (engineered IscB, enIscB)[65]。Han等将T5外切酶与enIscB蛋白融合表达后，其编辑效率可以与SpG[66] (SpCas9突变体，识别简单的NGN-PAM)相当，并且具有更少的染色体易位情况[65]。Han等还将突变后具有切口酶活性的enIscB分别与腺苷脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶融合，开发了小型的碱基编辑器，最高的编辑效率可达92%[65]。
4 展望OMEGA系统(TnpB、Fanzor和IscB)来自自私的转座元件，在三域生命中具有广泛的分布，为开发大量内源性基因编辑工具提供了可能，也极大地丰富了基因组编辑工具资源。其中TnpB是原核生物中分布最广泛的蛋白之一，暗示可能还有许多Cas12新亚型等待挖掘和开发。OMEGA蛋白具有ωRNA引导的核酸酶活性，原核生物中的OMEGA蛋白有助于转座子的保留和传播[26, 46-47]。对TnpB生理功能的研究，加速了高活性TnpB的大规模筛选[46]。真核生物中OMEGA是否具有同样的生理功能仍不清楚。TnpB和IscB都具有RuvC样结构域和BH结构域，它们分别被认为是Cas12和Cas9的祖先；然而Cas12不同亚型可能是由不同的TnpB独立进化而来，而Cas9可能起源于一个特定的IscB进化支[25, 29-32]。IscB相较于TnpB多了1个HNH核酸酶结构域，它们之间的进化关系以及RuvC核酸酶进化为OMEGA蛋白的过程仍需要进一步解析。
目前对OMEGA编辑工具的开发才刚起步，有很多工作需要完成，同时也面临很多挑战。OMEGA系统分布十分广泛，然而，想获得高效的基因组编辑工具，通常需要合成和测试大量的候选系统，其中可能只有少数具有高编辑活性。因此深入研究OMEGA系统的特点，建立核酸酶活性的预测机制是编辑工具开发的重点和难点。如通过建立序列、结构和功能的联系来筛选具有更高编辑潜力的系统，将加速高效编辑工具的开发，并降低系统合成和测试的成本。Xiang等的工作提供了很好的范例：他们对可能影响TnpB活性的因素进行分析，建立了大规模挖掘高活性TnpB核酸酶的流程，并成功获得了在真核细胞中具有高编辑活性的TnpB[46]。基于IscB的编辑工具仍较少，对来自真核细胞的IscB的挖掘和研究也有待进一步展开。TnpB识别较复杂的TAM (4−5 nt)，限制了其靶向范围，需要通过工程化改造拓展其TAM识别谱。然而，要在拓展编辑工具TAM识别谱的同时保持高编辑效率是改造的难点。目前测试的Fanzor在真核细胞中的编辑活性均较低。若要开发高效的编辑工具，还需进行系统性的优化改造或者筛选更高效的Fanzor蛋白。另一方面，最近Liang等通过引入突变获得了具有切口酶活性的Cas12a蛋白，基于此构建的先导编辑工具效率显著高于基于Cas12a核酸酶的先导编辑工具[67]。TnpB和Fanzor也有望通过引入合适的位点突变获得切口酶，从而构建精简的碱基编辑或先导编辑工具。
综上所述，未来对于OMEGA系统的研究可以从以下3个方面展开。第一，进一步对OMEGA系统进行同源搜索。通过深入分析RuvC核酸酶、原核生物中的OMEGA及真核中的OMEGA的进化关系，丰富编辑工具的资源库。第二，对OMEGA系统的作用机制和生理功能进行深入解析。更多的结构和功能解析将为工具的优化打下基础，也有助于鉴定影响OMEGA活性的关键因素，从而加快筛选流程、节约成本。第三，对更多OMEGA系统进行测试和优化。对OMEGA蛋白和ωRNA进行理性设计与定向进化，尝试提高编辑效率、减少脱靶或简化TAM。还可以通过融合其他功能元件开发小型化的碱基编辑或先导编辑工具。
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