近年来，宏基因组学(Metagenomics)的迅猛发展为人们充分、全面地探究微生物的物种与功能组成及其与环境之间的关系提供了强大的技术手段^[1]。高通量测序和基因芯片(GeoChip)是宏基因组学技术目前最为成熟和先进的主要技术^[2]。在环境微生物的宏基因组学研究中，高通量测序一般为对细菌、古菌的16S rRNA基因序列，真菌的18S rRNA、28S rRNA基因和内转录间隔区ITS (Internal transcribed spacer)序列，或者基于鸟枪法(shotgun)的全基因组进行测序。基因芯片则是使用寡核苷酸探针测定调控微生物碳、氮、磷、硫等物质循环、病原菌毒性(如抗生素抗性、病原菌侵染性)及病毒等功能基因，从而实现对环境中微生物群落功能基因组成的研究。宏基因组学以其强大的优越性，已广泛应用于土壤、水体、空气、极端环境和人体等环境中微生物的研究^{[3, 4, 5, 6, 7, 8]}。其中宏基因组学在城镇污水处理系统中的应用有力推进了微生物在水处理过程中作用机理的研究进展，为科学而系统地调控与监测污水处理过程提供了重要依据^{[9, 10, 11]}。

随着我国城镇化进程的加快，全国污水处理总量以及处理能力日渐提升，城镇污水处理厂剩余污泥产量不断增加，如何安全有效地解决剩余污泥愈来愈受到重视。污泥厌氧消化作为一种较成熟的污泥稳定化处理工艺，在实现污泥减量化、无害化和资源化的同时可回收沼气，已得到较好应用^[12]。厌氧消化常分为中温厌氧消化和高温厌氧消化，两者在运行条件、处理效率、产气量及病原菌去除等方面均存在一定差异^[13]。厌氧消化工艺虽已在国外得到较好的应用，但目前国内厌氧消化发展相对缓慢，相关技术的研究与应用还有待加强^[14]。本研究利用高通量测序和基因芯片技术检测了高温-中温两相厌氧消化工艺中各类微生物的物种组成和涉及病毒代谢和病原菌毒性的功能基因，并对比了中温和高温厌氧消化条件下微生物群落组成的异同，以期为污泥厌氧消化工艺的调控与改善提供理论支持，促进污泥厌氧消化工艺的应用与发展。

1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器

PowerSoil DNA提取试剂盒，美国MO BIO公司；NanoDrop，美国Thermo Fisher Scientific公司；MiSeq，美国Illumina公司；MAUI杂交仪，美国BioMicro公司；NimbleGen MS 200芯片扫描仪，瑞士Roche公司。

1.2 采样与DNA的提取

污泥样品采自浙江省宁海县城北污水处理厂的污泥厌氧消化系统，该污水处理厂采用分级分相厌氧消化工艺处理污泥及粪便的混固体废弃物，第一级为高温反应器，温度控制在50±1 °C，反应时间为3 d，适合水解酸化菌生长；第二级为中温反应器，温度控制为35±1 °C，反应时间为14 d，适宜产甲烷古菌生长。从2012年9月至2013年10月，每月采集高温罐和中温罐内污泥样品各2 L，共得24个样品，污泥样品采集后均低温保存运送到实验室。取少量样品用于测定COD (Chemical oxygen demand)、VS (Volatile solid)和TS (Total solid)等理化指标。将剩余样品14 000×g离心10 min后，取沉淀相保存于-80 °C用于微生物DNA提取。采用PowerSoil DNA提取试剂盒提取污泥样品的DNA，然后用NanoDrop测定其浓度和纯度，保证每个样品的DNA含量大于5 mg，纯度满足A₂₆₀/A₂₈₀值在1.8-2.0之间，A₂₆₀/A₂₃₀值大于1.5。

1.3 16S rRNA基因和ITS测序

测序实验通过Illumina MiSeq测序平台完成，16S rRNA基因测序所用引物为针对细菌和古菌16S rRNA V4高变区的通用引物515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和806R (5′-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，ITS测序选用引物为gITS7 (5′-GTGARTCATCGARTCTTTG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)^[15]。而后在网站http://zhoulab5.rccc.ou.edu: 8080/root上完成原始数据的整合，物种信息分类，生成OTU (Operational taxonomic unit)表格，详细实验步骤和数据预处理过程可参考文献[16, 17]，另ITS物种信息分类在https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp完成^[18]。将只在1个样品中出现的OTU删除后，再根据最小序列条数进行Resample，得到每个样品27 575条序列；而ITS最后得到1 074个OTU。

1.4 基因芯片实验

研究中所用基因芯片为最新版本的GeoChip 5.0，包含16万多个参与各类生物地球化学循环过程的功能基因的探针，覆盖37万条基因序列。其中，涉及病毒和病原菌毒性的基因共有约1万个探针，调控产甲烷的mcrA基因共有87个探针。基因芯片的实验详细过程参考文献[19, 20]，主要步骤为先将DNA样品用Cy-5荧光染料，纯化后置于45 °C干燥45 min，而后将标记的DNA样品与GeoChip 5.0于42 °C在MAUI杂交仪上杂交16 h，再用NimbleGen MS 200芯片扫描仪检测信号强度。将得到的原始数据在网站(http://ieg.ou.edu/microarray/)上进行预处理，首先去掉被标记“1”和“3”的点，以及信噪比(SNR)小于2.0的点，然后去掉12个重复中出现少于3次的点，再将信号值进行lnMR转化，即先求每个探针对应信号值的自然对数(ln)，然后除以该探针所在样品的所有探针信号强度的平均值(MR)^{[21, 22]}。

1.5 数据处理

研究使用了除趋势对应分析(Detrended correspondence analysis，DCA)和3种非参数检验方法Adonis (Permutational multivariate analysis of variance)、ANOSIM (Analysis of similarities)和MRPP (Multi-response permutation procedure)来检验中温和高温条件下微生物整体群落组成的差异。使用响应比(Response ratio)分析及双尾t检验研究了微生物物种和基因相对丰度在90%置信区间下的变化程度。使用Mantel检验研究了微生物群落与运行参数之间的关系。以上分析均通过R语言vegan程序包和Excel完成。

2 结果与分析 2.1 运行温度对厌氧消化微生物整体群落组成的影响

研究对比了中温和高温两种厌氧消化过程中微生物整体群落组成的异同。DCA结果表明，16S rRNA基因测序所得细菌及古菌物种组成在中温和高温2种条件下聚类为2部分(图 1a)，说明细菌及古菌群落组成在中温和高温厌氧消化下有明显差异。进一步的3种非参数检验(Adonis，ANOSIM，MRPP)的结果证明了其差异显著(表 1)。而ITS测序数据的DCA结果表明真菌整体群落物种组成在两种条件下相似(图 1b)。在功能基因层面上，病毒和病原菌毒性基因的芯片数据的DCA结果显示中温和高温样品明显分开(图 1c)，这一结果也被3种非参数检验(Adonis，ANOSIM，MRPP)证实(表 1)。因此，可见运行温度的不同显著改变了细菌及古菌群落物种组成和病毒及病原菌毒性基因的功能组成，而对真菌的群落组成没有显著影响。

2.2 中温和高温厌氧消化微生物物种的异同 2.2.1 细菌及古菌物种组成的异同：16S rRNA基因测序在厌氧消化系统中共检测到了31个门类的细菌及古菌，其中相对丰度大于1%的门类主要有7个，分别为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、热袍菌门(Thermotogae)、放线菌门(Actinobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)。这7个门类占整体测序微生物总量的80%-85%，为厌氧消化过程中常见门类。值得注意的是未确定分类的微生物(Unclassified)占据了11%-16%的比例，说明还有相当一部分分类和功能未知的微生物有待研究。此外，由于测序引物为通用引物，主要针对细菌，对古菌只有部分代表性，所以检测到的古菌微生物较少，主要为广古菌门。在物种重合度上，中温和高温条件下均存在的细菌物种占总物种的45.78%，而中温和高温独有的细菌分别占总物种数的26.06%和28.16% (表 2)，而古菌的物种重合度比细菌稍高，中温和高温均存在的古菌物种比例为59.95% (表 2)。说明2种温度下细菌物种的重合度不高，物种的组成存在较大差异。

中温和高温下厌氧消化整体群落组成和OTU重合度上虽有明显差异，但在门分类水平上没有较大变化，仅有个别门类有所改变。与高温相比，在中温消化过程中未确定分类微生物相对丰度由11%上升到16% (p<0.1)，而拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度由7%下降到4% (p<0.1)，其他门类在中温与高温消化过程中并无显著差异。

在更低分类水平上，中温和高温厌氧消化细菌及真菌群落有着较显著的变化。图 2所示为细菌及真菌在中温消化与高温消化条件下微生物在纲水平上(图 2a)和属(图 2b)水平上相对丰度变化的响应比，图 2仅列出了具有显著变化的纲和显著变化且丰度较高的属。在纲分类水平上，相比高温厌氧消化，中温厌氧消化过程中未被确定的微生物(Unclassified)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)和酸杆菌纲(Acidobacteria_Gp3)等微生物相对丰度提高，而大部分显著变化的纲类在中温条件下下降。测序共检测到500多个菌属，有89个菌属在高温与中温条件下呈现显著变化(p<0.1)，其中60个属相对丰度在中温条件下显著下降。其变化结果与纲水平类似，如相对丰度较大的未被确定的微生物(Unclassified)在中温下丰度上升，而Lutispora、Clostridium和Tepidimicrobium等耐热或产酸菌属在中温消化过程中丰度下降。在OTU水平上，测序所检测到的27 575个OTU中，在中温条件下相对丰度显著(p<0.1)上升的OTU有1 466个，其中有41.47%的属于Clostridia，有26.06%的属于Unclassified纲。在中温条件下显著(p<0.1)下降的OTU有1 215个，其中有46.50%的属于Clostridia，其次为Unclassified，占10.45%。而显著下降的OTU中属于Lutispora、Clostridium和Tepidimicrobium的OTU分别占比为7.41%、3.62%和2.55%，是除Unclassified (55.31%)外拥有显著下降OTU数最多的3个属，这也与属水平分析结果一致。此外，分析中关注了高丰度OTU的变化，相对丰度占比大于0.1%的OTU共有110个，其中74个为Unclassified，其他属所含OTU均少于4个，说明微生物分类还有待进一步研究。在中温条件下相对丰度显著提高的OTU有21个，属于Methanobacterium、Bellilinea和Hyphomicrobium等；相对丰度显著下降的OTU有14个，属于Lutispora、Tepidimicrobium和Sporanaerobacter等。

2.2.2 真菌物种组成的异同：ITS测序共检测到5个门，22个纲，181个属的真菌类群，主要门类为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和壶菌门(Chytridiomycota)。其中有一半左右的微生物分类未被确定。与真菌的整体群落组成相似，在门分类水平上，中温条件下与高温条件下真菌的微生物组成并没有显著变化，进一步在更细分类水平上(纲、属)也仅有少量丰度较低的物种受运行温度的影响，表明厌氧消化过程中真菌对运行温度并不敏感，也说明中高温厌氧消化反应器的差异与真菌不相关。但是，虽然中温和高温下真菌的整体组成相似，但物种重合度并不高，仅为43.32% (表 2)，这可能是由于重合的物种丰度较高，对整体组成的影响更大。

2.2.3 特定功能基因的变化：利用基因芯片检测了病毒基因在高温和低温厌氧消化过程中的差异，在中高温污泥厌氧消化系统中可检测出106个侵染原核生物的病毒基因和586个侵染真核生物的病毒基因。其中，70个侵染原核生物的病毒基因对应的宿主在16S rRNA基因测序中均有检出，两者存在较为明显的对应关系。而586个侵染真核生物的病毒对应的宿主主要为人类和动植物等，在中高温污泥厌氧消化系统中不存在，因此在ITS测序中只有20个侵染真核生物的病毒基因可检测出其对应宿主，说明大部分侵染真核生物的病毒可能是由固体废弃物进料带入。进一步研究发现，侵染真核生物的病毒基因丰度在不同月份中较为稳定，也反映了固体废弃物进料基本稳定的情况。

病原菌毒性基因共9 415个探针，主要为抗生素抗性基因(antibiotic resistance，7 735个探针)等。如图 3所示，与高温相比，中温时抗生素抗性基因和侵染原核生物的病毒基因丰度较低，而侵染真核生物的病毒基因没有显著变化，其他丰度相对较低的病原菌毒性基因在中温条件下上升。在基因的重合度上，中温和高温中均存在的基因占总基因数的97%以上(表 2)，显示了高度的重合性。此外研究中还检验了产甲烷基因mcrA的变化，其相对丰度在高温条件较低，但统计结果不显著(p=0.2)，在高低温下探针的重合度基本相同(表 2)。

2.3 微生物群落与运行负荷的关系

如图 4所示，研究检测了该污水处理厂每月中温和高温消化罐中COD、TS和VS的浓度变化。中温和高温条件下三者均没有显著差异(p>0.1)，但整体上中温消化COD含量较低；整个年度中，大部分时间反应器运行平稳，2013年4-8月COD、TS和VS均有较大波动。

为检验COD、TS和VS的变化是否影响微生物群落组成的变化，研究中用Mantel test计算了微生物群落组成与运行参数之间的关系。如表 3所示，COD、TS和VS均与微生物物种群落存在显著相关性，即三者都能显著影响厌氧消化中细菌、古菌及真菌组成。而病毒和病原菌毒性基因对运行参数的响应不敏感。

3 结论与讨论

本研究主要利用高通量测序测定了中温和高温厌氧消化系统中微生物的物种信息，同时利用基因芯片检测了病毒和病原菌毒性基因的变化。从检测到的丰度来看，细菌与古菌在整个厌氧消化过程中作用更为重要，而真菌的丰度较低。细菌丰度较高的门类为厌氧消化中常见门类^[23]，其中厚壁菌门(Firmicutes)为最优势菌群，而厚壁菌门主要分支为起水解作用的梭菌纲(Clostridia)，占总物种丰度的38%，这与之前研究结果相似^[24]。实验中检测到的古菌为广古菌门菌群，该门类主要包含甲烷微菌纲(Methanomicrobia)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)和热原体纲(Thermoplasmata)等厌氧消化过程中常见类群^[25]。实验检测到的真菌主要为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，占总真菌丰度的一半左右，是具有降解纤维素能力的菌群^[26]，而另一半菌群主要为未被确定分类真菌，相关分类方法和数据库还有待完善^[27]。

中温厌氧消化与高温厌氧消化在运行效果上的差异使我们重点关注了两者在群落组成与部分功能组成上的异同。DCA和非参数检验结果及较低的物种重合比例(表 1、2，图 1A)均显示了中温和高温条件下细菌和古菌的群落组成是不同的。在门分类水平上，除未被确定菌群(Unclassified)外仅拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度在中温条件下低于高温条件。Bacteroidetes是一类可以水解纤维素、半纤维素和几丁质等多糖物质的菌群，在人畜粪便中也较为常见^[28]，本研究在污泥中加入的粪便固废也应是其相对丰度较高的原因。Bacteroidetes中丰度最高的2个纲为在纲分类水平下显著下降的Sphingobacteria和Bacteroidia (图 2)。在纲分类水平上丰度最高的梭菌纲(Clostridia)虽然没有显著变化，但在更低分类水平上有显著下降。图 2B中显著下降的Lutispora、Clostridium、Tepidimicrobium、Sedimentibacter和Proteiniborus等均为梭菌纲菌群，梭菌菌群为中温和高温厌氧消化过程中普遍存在的水解酸化菌群，已有文献表明该菌群能在高温条件下成为优势菌种^[29]，且包含嗜热产酸菌，如Lutispora和Tepidimicrobium^{[30, 31]}。研究中以上水解产酸菌在中温条件下丰度较高温下降，表明高温条件下水解酸化菌群更具有优势，且嗜热产酸菌群丰度较高。在中温条件下，古菌中甲烷杆菌纲(Methanobacteria)丰度较高，说明中温条件下产甲烷作用可能得到加强，这也与该厂调控中温条件下主要产甲烷的设计相符合。产甲烷基因mcrA的基因丰度在高温条件下丰度较低，而统计结果不显著则可能是由于产甲烷菌世代时间较长和污泥停留时间相对较短导致。

已有文献表明，在利用16S rRNA基因确定微生物物种分类时，往往会由于多拷贝数的16S rRNA基因的多样性导致所分类得到的OTU多样性被高估^[32]。由于在厌氧消化系统中作为主要优势菌群的厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)均具有较多的16S rRNA基因拷贝数，会导致我们所测得的OTU多样性有所提高。为了减少这类误差，我们测序针对16S rRNA基因的V4区序列，相对于其他区域，V4区序列对多样性的高估程度最小。另外，由于随着分类水平的提高，16S rRNA基因的多样性所导致的OTU多样性被高估情况逐渐减弱^[32]，因此研究中对于种群的比较主要在属以上的精细分类水平，以增强结论的可靠性。

污泥中病原微生物及抗生素抗性基因的存在对环境和人类健康构成巨大的风险^{[33, 34]}，中温消化时温度与人体温度相近，对病原微生物的杀灭率较低，而高温时杀灭率较高，对大肠杆菌和寄生虫卵的杀灭率可达99%^[34]。研究利用基因芯片检测了病毒和病原菌毒性基因的变化，虽然在中温和高温条件下基因的重合度较高，但非参数检验和DCA组成均显示其整体组成发生变化，说明虽然基因个数变化较小，但其丰度显著改变。与高温相比，中温条件下抗生素抗性基因和侵染原核生物的病毒基因丰度较低(图 3)，这可能是由于所选污泥处理工艺为高温-中温两相反应，病原微生物先进入高温反应器，经一定消化时间后使得部分病原微生物被杀灭后再进入中温反应器，且高温反应器不断有原料进入，所以才导致中温条件下抗生素抗性基因和侵染原核生物的病毒基因丰度较低。侵染真核生物的病毒基因没有显著变化也与真菌群落组成在中温和高温条件下相似的结果一致。总体来看高温条件更能有效降低病原微生物和抗生素抗性基因。

污水处理厂中运行参数与微生物群落组成和功能组成均有紧密联系^{[9, 11]}，研究中检测的COD、VS和TS负荷参数均与微生物物种组成存在显著相关性，而病毒和病原菌毒性基因与三者均无显著关联，表明通过调控运行参数可以改变微生物的群落组成，而病毒和病原菌毒性基因在污泥减量化过程中作用较小，对运行负荷变化不敏感。

4 结论

中温厌氧消化和高温厌氧消化各有优势，高温消化负荷高，处理效率高，病原菌去除情况也更好，但相对中温厌氧消化运行欠稳定，应用较不广泛。高温-中温两相厌氧消化工艺集合两者优点，先经高温产酸再到中温产气，效果显著而得到许多研究者的关注^{[35, 36]}。研究利用高通量测序和基因芯片两种技术对污泥中温和高温厌氧消化系统中微生物群落进行了检测。结果表明中温和高温下细菌、古菌和病毒及病原菌毒性基因组成有显著差异，而真菌群落组成相似。高温增强了水解酸化及嗜热菌群的丰度，能够更好地去除病毒和抗生素抗性基因，而中温条件下产甲烷菌丰度有所提高。中温和高温条件下微生物群落的差异为2个系统功能差异提供了微观解释。相关性分析显示微生物群落的形成主要与进水参数相关，调节进水参数可以改变微生物群落组成和功能，为优化反应器运行效果提供理论依据。