2016, Vol. 43
表1(Table 1)
ILV2基因缺失对啤酒酵母生长与双乙酰代谢的影响
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文章信息
- 石婷婷, 李凭, 肖冬光
- SHI Ting-Ting, LI Ping, XIAO Dong-Guang
- ILV2基因缺失对啤酒酵母生长与双乙酰代谢的影响
- Effect of disrupting ILV2 gene on growth and diacetyl metabolism of brewer's yeast
- 微生物学通报, 2016, 43(8): 1732-1738
- Microbiology China, 2016, 43(8): 1732-1738
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150676
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文章历史
- 收稿日期: 2015-09-10
- 接受日期: 2015-12-28
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-01-04
石婷婷, 李凭, 肖冬光. ILV2基因缺失对啤酒酵母生长与双乙酰代谢的影响[J]. 微生物学通报, 2016, 43(8): 1732-1738.
SHI Ting-Ting, LI Ping, XIAO Dong-Guang. Effect of disrupting ILV2 gene on growth and diacetyl metabolism of brewer's yeast[J]. Microbiology China, 2016, 43(8): 1732-1738.
ILV2基因缺失对啤酒酵母生长与双乙酰代谢的影响
工业发酵微生物教育部重点实验室 天津市工业微生物重点实验室 天津科技大学生物工程学院 天津 300457
摘要：
【目的】
旨在应用分子生物学方法降低啤酒发酵液中双乙酰含量，改善啤酒感官质量。
【方法】
以酿酒酵母S2 (Saccharomyces cerevisiae)为出发菌株，通过同源重组敲除四倍体啤酒酵母α-乙酰乳酸合成酶部分基因(ILV2)，构建缺失一个和两个ILV2等位基因的突变株QI2-1和QI2-2，并进行啤酒发酵实验。
【结果】
ILV2基因的缺失，会导致菌株初始生长速率的降低。其中QI2-2较为明显，12 h时，突变株与出发菌株的生长速率达到一致。啤酒发酵结果表明，与出发菌株相比，突变株QI2-1双乙酰峰值与双乙酰最终含量分别降低17.50%和17.83%，而QI2-2分别降低51.67%和45.65%。其他啤酒指标如酒精度、发酵度、残糖和风味物质等略有变化，但都在优质啤酒指标范围内，符合啤酒发酵的质量要求。
【结论】
通过同源重组敲除部分ILV2基因和选育低产双乙酰菌株是降低啤酒双乙酰含量、提高啤酒质量的有效方法，具有一定的实际应用价值。
关键词：
啤酒酵母
ILV2基因
双乙酰
啤酒发酵
Effect of disrupting ILV2 gene on growth and diacetyl metabolism of brewer's yeast
Key Laboratory of Industrial Fermenting Microbiology, Ministry of Education, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China
Received: September 10, 2015; Accepted: December 28, 2015; Published online(www.cnki.net): January 04, 2016
Foundation item: National High-Tech R & D Program of China (863 Program) (No. 2012AA022108); The Ministry of Education "Cheung Kong Scholars and Innovation Team Development Plan"(No. IRT1166)
*Corresponding author:
XIAO Dong-Guang: Tel: 86-22-60601667; Fax: 86-22-60602298; E-mail: xdg@tust.edu.cn.
Abstract:
[Objective]
The purpose is to reduce diacetyl content in beer fermentation liquor by molecular biology methods and improve sensory quality of beer.
[Methods]
Based on S2 (Saccharomyces cerevisiae, tetraploid), mutant strains, including single ILV2 allele disruption (QI2-1) and two ILV2 alleles disruption (QI2-2) were constructed by homologous recombination to destroy acetyl lactic acid synthase gene (ILV2), and beer fermentation experiment was carried on.
[Results]
It could reduce the initial growth rate of strains because of the disruption of ILV2 gene, especially QI2-2, while the growth rate of mutant strains was same as the host strain after 12 h. Beer fermentation experiment showed that ILV2 gene could reduce the production of diacetyl, and the diacetyl peak and diacetyl concentration decreased by 17.50% and 17.83% in QI2-1, 51.67% and 45.65% in QI2-2, respectively, compared with that in the host strain S2. Other indicators such as alcohol, beer fermentation degree, residual sugar and flavor changed slightly, but they were in the range of high quality beer suggested, and conformed to the requirements of the index of beer fermentation.
[Conclusion]
It is an effective method to reduce diacetyl content and improve the quality of beer by constructing low-diacetyl strains using homologous recombination with the disruption of Part of ILV2 gene, and it has certain actual application value.
Key words:
Beer yeast
ILV2 gene
Diacetyl
Beer fermentation
双乙酰，又称2, 3-丁二酮，是啤酒发酵过程中的重要副产物，也是判断啤酒成熟的重要标志之一。啤酒中双乙酰的含量超过阈值就会产生令人不快的馊饭味，严重破坏啤酒的风味，并影响啤酒的感官质量[1-2]。在啤酒生产中，如何降低发酵液中双乙酰的含量，提高啤酒的质量，一直是啤酒生产企业关注的实际问题，也是相关科研人员的重要研究课题。
啤酒中的双乙酰主要是由啤酒酵母细胞通过缬氨酸代谢途径产生的α-乙酰乳酸(α-Acetolactate)分泌至细胞外，再经过非酶促的氧化脱羧反应合成的[3]。α-乙酰乳酸由丙酮酸生成，关键酶是乙酰乳酸合成酶，该酶的编码基因是ILV2，去除或改变ILV2，可减少α-乙酰乳酸的生成，从而减少双乙酰的生成。张吉娜等[4]用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GSH1)替换了啤酒酵母的ILV2基因，发酵结果表明双乙酰产量降低了25%，发酵周期缩短了3 d。嘉士伯实验室的研究人员[5]通过限制性内切酶切除，全部敲除了ILV2基因，从而不能合成α-乙酰乳酸，也不会生成双乙酰，但这同时也阻断了酵母合成缬氨酸和异亮氨酸的途径，影响啤酒酵母的生长和啤酒发酵，所以ILV2基因不能完全敲除。为了进一步研究ILV2的缺失对啤酒双乙酰和酵母生长的影响，本研究应用分子生物学的方法分别敲除四倍体酿酒酵母一个和两个ILV2等位基因，并进行啤酒发酵实验，综合分析发酵液中双乙酰等风味物质的变化和菌株的生长情况，并确定合适的啤酒酵母菌株。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒酿酒酵母菌株S2 (Saccharomyces cerevisiae)、酵母表达载体pUG6 (包含KanMX基因表达盒)、pGAPza质粒均由天津科技大学天津市工业微生物重点实验室保藏。
1.2 试剂和仪器高保真性DNA扩增酶Trans TaqTM HiFi，北京全式金生物技术有限公司；DNA提取试剂盒，大连宝生物公司；硫酸盐遗传霉素(G418)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；博来霉素(Zeocin)，Invitrogen公司；鲑鱼精DNA，北京索莱宝科技有限公司。引物委托鼎国生物技术有限公司合成。
DYY-4C型电泳仪，北京市六一仪器厂；PCT-200型PCR基因扩增仪，美国Bio-Rad公司；全自动生长曲线分析仪，芬兰Bioscreen公司；7890A气相色谱仪，北京安捷伦科技有限公司。
1.3 主要培养基YEPD培养基(g/L)：酵母提取物10，葡萄糖20，蛋白胨20，pH 6.0，1×105 Pa灭菌20 min。
YEPD (G418)培养基：YEPD固体培养基熔化后，降温至60℃左右时加入一定量的G418储存液，使得G418的最终浓度为600 mg/L。
YEPD (Zeocin)培养基：YEPD固体培养基溶化后，降温至60℃左右时加入一定体积的Zeocin储存液，使得Zeocin的最终浓度为500 mg/L。
YPG半乳糖诱导培养基(g/L)：半乳糖20，蛋白胨20，酵母膏10，1×105 Pa灭菌15 min。
麦芽汁培养基：称量一定量粉碎的麦芽，按1׃4的料水比于65℃进行糖化，调整外观糖度至12°Brix，1×105 Pa灭菌20 min。
固体培养基需加20 g/L琼脂。
1.4 实验方法 1.4.1 引物设计: 根据NCBI公布的S. cerevisiae S288c的ILV2基因序列和pUG6质粒序列，设计长引物敲除一个和两个ILV2等位基因，具体引物设计见表 1。
表 1 本实验所用引物
Table 1 Primers used in this paper
| 引物 Primers |
引物序列 Primers sequennce (5′→3′) |
长度 Sizes (bp) |
| QI2-1-UP | TAGAAAGTATTTTACAAAATCTAAACCCTTTGAGCTAAGAGGAGATAAATACAACAGAATCAATTTTCAACAGCTGAAGCTTCGTACGC | 89 |
| QI2-1-DOWN | ACGATTAAATAATAATAAAGTCTGCATTTTTTACTGAAAATGCTTTTGAAATAAATGTTTTTGAAAT GCATAGGCCA CTAGTGGATC TG | 89 |
| QI2-2-UP | GCCTCTAAAAGGCCAGAGCCTGCTCCAAGTTTCAATGTTGATCCATTAGAACAGCCCGCTGAACCTTGCATAGGCCACTAGTGGATCTG | 89 |
| QI2-2-DOWN | TGGGCCCTTGGTAGAAACGAATTCTTTCAACTTAGCGTCCAATTCCTCTTGCTTCTTGACTCTTAAA CAGCTGAAGCTTCGTACGC | 86 |
| I1K1-UP | CAGAACTTTGCCACTAATACC | 21 |
| I1K1-DOWN | TCAAGACTGTCAAGGAGGG | 19 |
| I2K2-UP | TGTAAACAGAACTTTGCCACTA | 22 |
| I2K2-DOWN | GATACCTTGACGGAGCCAC | 19 |
| K-UP | CAGCTGAAGCTTCGTACGC | 19 |
| K-DOWAN | GCATAGGCCACTAGTGGATCTG | 22 |
一级种子培养：取斜面菌种一环，接种于装有5 mL 12°Brix麦汁培养基的试管中，28℃、180 r/min培养24 h。
二级种子培养：一级种子液按10%的接种量接入盛有50 mL 12°Brix麦汁的150 mL三角瓶内，16℃静置培养72 h。
啤酒发酵：二级种子液4℃、5 000 r/min离心5 min，洗涤2次，获得鲜酵母，鲜酵母按0.5%的接种量接入盛有250 mL 12°Brix麦汁的380 mL矿泉水瓶内，10℃静置发酵15 d。
2 结果与分析 2.1 ILV2敲除突变株的构建 2.1.1 一个ILV2等位基因的敲除: 按照1.4.3和1.4.4的方法，获得缺失一个ILV2等位基因的突变株，命名为QI2-1，PCR验证结果见图 1。以K-UP和K-DOWN为引物，能够扩增得到1 600 bp的片段，与理论上KanMX基因大小一致，说明KanMX基因已经整合到出发菌株染色体上；再以I1K1-UP和I1K1-DOWN为引物，能够扩增得到711 bp的片段，而以阴性对照S2基因组为模板，没有扩增出相应的片段，说明转化子发生了正确的同源重组，KanMX基因已经在酵母ILV2位点发生了正确的整合。
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| 图 1 一个ILV2等位基因缺失突变株PCR验证 Figure 1 PCR analysis of mutant strain with one ILV2 allele disruption 注：1、2：以K-UP和K-DOWN为引物进行验证；3、4：以I1K1-UP和I1K1-DOWN为引物进行验证；1、3：模板为出发菌株S2的基因组；2、4：模板为缺失一个ILV2等位基因的突变株QI2-1的基因组. Note: 1, 2: PCR verification with premiers K-UP and K-DOWN; 3, 4: PCR verification with premiers I1K1-UP and I1K1-DOWN; 1, 3: The PCR template is genome of the host strain S2; 2, 4: The PCR template is the genome of mutant strain with one ILV2 allele disruption. |
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| 图 2 QI2-1的KanMX抗性基因剔除前后生长情况 Figure 2 Growth status of QI2-1 and QI2-1 (KanMX excised) 注：A：QI2-1点接种于YEPD平板；B：KanMX抗性基因剔除后菌株点接种于含有G418的YEPD平板. Note: A: QI2-1 grows on YEPD; B: QI2-1 (KanMX excised) grows on YEPD with G418. |
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| 图 3 QI2-1剔除KanMX基因PCR验证 Figure 3 PCR analysis of the KanMX excision of QI2-1 注：1：模板为QI2-1剔除KanMX抗性基因后的基因组；2：模板为QI2-1的基因组. Note: 1: The PCR template is the genome of QI2-1 (KanMX excised); 2: The PCR templates is the genome of QI2-1. |
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| 图 4 两个ILV2等位基因缺失突变株PCR验证 Figure 4 PCR analysis of the mutant strain with two ILV2 allele disruptions 注：1、2：以K-UP和K-DOWN为引物进行验证；3、4：以I2K2-UP和I2K2-DOWN为引物进行验证；1、3：模板为出发菌株S2的基因组；2、4：模板为缺失两个ILV2等位基因的突变株QI2-2的基因组. Note: 1, 2: PCR verification with premiers K-UP and K-DOWN; 3, 4: PCR verification with premiers I2K2-UP and I2K2-DOWN; 1, 3: The PCR template is genome of the host strain S2; 2, 4: The PCR template is the genome of mutant strain with two ILV2 allele disruption. |
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按照1.4.6的方法，分别测定菌株QI2-1、QI2-2和S2在麦芽汁培养基中的生长速率，并绘制菌株的生长曲线(图 5)。结果表明，突变株QI2-1和QI2-2对酵母的生长有一定的影响，突变株比出发菌株S2的初始生长速率慢，但是12 h后，突变株的生长速率与出发菌株达到一致。这可能是由于啤酒酵母S2是四倍体，ILV2部分敲除可能只是使ILV2的表达量减少了，并没有完全不表达。此外，麦芽汁本身含有一定量的缬氨酸，缬氨酸的含量占总氨基氮的15%−20%[9]，不会影响后期啤酒发酵。
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| 图 5 不同菌株的生长速率 Figure 5 Growth rates of different strains |
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在啤酒发酵过程中测定菌株QI2-1、QI2-2和S2的双乙酰的峰值，发酵结束时，测定了各菌株的双乙酰含量(图 6)。结果表明QI2-1和QI2-2对啤酒发酵中降低双乙酰水平有显著效果，QI2-1和QI2-2的双乙酰峰值分别为0.95 mg/L和0.58 mg/L，较出发菌株S2分别降低了17.5%和51.67%；发酵结束时，QI2-1和QI2-2的双乙酰最终含量分别为0.45 mg/L和0.30 mg/L，较出发菌株S2分别降低了17.83%和45.65%。
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| 图 6 不同菌株的双乙酰含量 Figure 6 Diacetyl content of different strains |
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发酵结束时，测定了菌株QI2-1、QI2-2和S2的酒精度、真正发酵度和残糖，结果见表 2。
表 2 不同菌株的酒精度、真正发酵度和残糖
Table 2 Alcohol, fermentation degree and residual sugar of different strains
| 菌株 Strains |
酒精度 Alcohol (%vol) |
真正发酵度 Fermentation degree (%) |
残糖 Residual sugar (g/L) |
| S2 | 5.60±0.20 | 77.51±2.60 | 6.40±0.10 |
| QI2-1 | 5.80±0.20 | 77.12±2.20 | 6.70±0.10 |
| QI2-2 | 5.48±0.20 | 76.02±2.80 | 6.70±0.20 |
由表 2看出，在发酵结束后突变株相比于出发菌株，残糖略高，QI2-2的酒精度略低于S2。在发酵结束后突变株与出发菌株在酒精度、残糖和真正发酵度等指标上没有明显差异，并且各项指标均符合国家规定的标准，说明突变株QI2-1和QI2-2并没有明显影响这些啤酒基础指标，符合啤酒发酵的质量要求。
2.5 啤酒发酵结束后挥发性风味物质的测定发酵结束时，测定了菌株QI2-1、QI2-2和S2代谢产生的挥发性风味物质，结果见表 3。
表 3 不同菌株的挥发性风味物质
Table 3 The flavor component profiles of different strains
| 挥发性物质种类 Types of volatile substances |
S2 (mg/L) |
QI2-1 (mg/L) |
QI2-2 (mg/L) |
| 苯乙醇Phenylethyl alcohol | 14.40±0.14 | 11.01±0.24a | 13.38±0.19 |
| 乙酸乙酯Ethyl acetate | 12.04±0.20 | 12.08±0.21 | 14.78±0.42a |
| 正丙醇Are propanol | 14.18±0.20 | 12.70±0.30a | 14.42±0.12 |
| 异丁醇Isobutyl alcohol | 12.81±0.22 | 10.89±0.30a | 11.34±0.12 |
| 乳酸乙酯Ethyl lactate | 19.30±0.15 | 17.53±0.24a | 19.65±0.20 |
| 异戊醇Isoamyl alcohol | 54.04±2.26 | 50.52±3.12a | 54.11±2.16 |
| 注：a：重组菌株与出发菌株代谢产风味物质的含量具有明显的差异(Student’s t test P≤0.05). Note:a: Values of the recombinant yeast strains are significantly (Student’s t test P≤0.05) different from those of the host strain. |
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结果表明，突变株QI2-1与出发菌株S2相比，其发酵液中含有的某些主要高级醇和酯类物质的含量略有降低，而QI2-2发酵液中的乙酸乙酯略有提高，异丁醇降低。这可能是缬氨酸代谢途径中某些物质代谢流发生变化导致一些醇类物和酯类物质代谢能力的变化，但各物质的浓度都在优质啤酒建议的范围之内。
3 讨论本文通过同源重组构建缺失一个ILV2等位基因和两个ILV2等位基因的突变株QI2-1和QI2-2，不仅降低了啤酒双乙酰含量，而且对啤酒其他指标基本没有影响。嘉士伯实验室[5]完全去除ILV2基因阻断合成缬氨酸和异亮氨酸的途径，对酵母的生长和后期的啤酒发酵造成不利影响，导致发酵性能有所下降，需在发酵液中添加某些氨基酸来满足啤酒发酵的要求，这样就会增加啤酒生产的成本。与之相比，本文ILV2基因的部分敲除并没有阻断酵母本身合成缬氨酸和异亮氨酸的途径，不会对酵母生长和啤酒发酵造成不利影响，并且显著降低了双乙酰的含量，具有一定的实际应用价值。
参考文献
| [1] | Saison D, De Schutter DP, Uyttenhove B, et al. Contribution of staling compounds to the aged flavour of lager beer by studying their flavour thresholds[J]. Food Chemistry , 2009, 114 (4) : 1206–1215. DOI:10.1016/j.foodchem.2008.10.078 |
| [2] | Meilgaard MC. Flavor chemistry of beer: part Ⅱ: flavour and threshold of 239 aroma volatiles[J]. Master Brewers Association of the Americas Technical Quarterly , 1975, 12 (3) : 151–168. |
| [3] | Sun ML. In beer diacetyl ingredient formation and control[J]. Liquor Making , 2007, 34 (4) : 67–69. (in chinese) 孙美玲. 啤酒中双乙酰成分的形成与控制[J]. 酿酒 , 2007, 34 (4) : 67–69. |
| [4] | Zhang JN, He XP, Guo XN, et al. Genetically modified industrial brewing yeast with high-glutathione and low-diacetyl production[J]. Chinese Journal of Biotechnology , 2005, 21 (6) : 942–946. (in chinese) 张吉娜, 何秀萍, 郭雪娜, 等. 低双乙酰抗老化啤酒酵母工程菌的构建[J]. 生物工程学报 , 2005, 21 (6) : 942–946. |
| [5] | Li Y, Tie CJ, Wang ZX, et al. Construction of diacetyl-low brewer's yeast[J]. Liquor Making , 2002, 29 (6) : 77–79. (in chinese) 李艳, 铁翠娟, 王正祥, 等. 低双乙酰啤酒酵母工程菌的构建[J]. 酿酒 , 2002, 29 (6) : 77–79. |
| [6] | Daniel Gietz R, Woods RA. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method[J]. Methods in Enzymology , 2002, 350 : 87–96. DOI:10.1016/S0076-6879(02)50957-5 |
| [7] | General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China (AQSIQ), Standardization Administration of the People's Republic of China. GB/T 4982-2008, Method for analysis of beer[S]. Beijing: China Standard Publishing House, 2008: 5-14 (in Chinese) 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. GB/T 4982-2008, 啤酒分析方法[S].北京:中国标准出版社, 2008: 5-14 |
| [8] | Cai DY. Liquor-Making Industry Analysis Manual[M]. Beijing: Light Industry Press, 1988 . (in chinese) 蔡定域. 酿酒工业分析手册[M]. 北京: 轻工业出版社, 1988 . |
| [9] | Shi HY, Kou CR. Controt of valine and process of ZHI-MAI[J]. Liquor Making , 2001, 28 (4) : 86–87. (in chinese) 石海英, 寇春荣. 缬氨酸与制麦工艺控制[J]. 酿酒 , 2001, 28 (4) : 86–87. |