母乳被认为是婴儿成长所需的最佳食物。它在婴儿的生存和生长方面扮演着重要角色，不仅为婴儿提供所需要的营养物质，而且直接或间接地增强婴儿肠道黏膜的屏障功能和免疫功能，提高婴儿对疾病的抵抗能力^[1-2]。据报道，母乳对婴儿肠道的贡献主要来源于其含有的多种生物活性成分。最新研究表明，母乳中的微生物也可能是其来源因素之一^[3]。

最初学者们认为母乳中的微生物是由于受到外部环境的污染而导致的^[4-5]，但越来越多的研究表明，母乳中的微生物不只是来自于外源污染，而且存在一定的内源路径。Jiménez等^[6]让妊娠期内的孕妇服用一定量含有Lactobacillus salivariu CECT5713和Lactobacillus gasseri CECT5714的益生菌微生态制剂保健品一段时间，结果显示约60%的产妇母乳中均检测到这两种益生菌。Arroyo等^[7]通过对124名患有乳房炎症的产妇给服一定剂量含有Lactobacillus fermentum CECT5716的益生制剂，结果显示超过半数的产妇母乳中检出该益生菌。随着科学技术的进步与发展以及研究手段的不断完善，科学家们通过PCR-DGGE/TGGE、qPCR和高通量测序等现代生物学方法继续对母乳中的微生物进行研究，已发现母乳中的微生物有Staphylococcus、Enterorococcus、Streptococcus、Lactobacillus、Bifidobacterium和Leuconostococcus等^[8-9]。随后，Albesharat等在母乳样品中发现的细菌有Staphylococcus haemolyticus、Streptococcus gallolyticus、Streptococcus vestibularis、Enterococcus durans、Enterococcus hirae、Enterococcus mundtii、Lactobcillus brevis、Lactobcillus oris、Lactobcillus animalis等^[10]；Cabrera-Rubio等在母乳样品中共检到700多种细菌，其中初乳(怀孕后期和婴儿出生后4-5 d以内的乳汁)中最常见的细菌属为Weissella、Leuconostococcus、Staphylococcus和Lactococcus^[11]。这些研究均表明母乳中的确存在微生物，并且是通过特定的内源性路线传输而来的，它们可以源源不断地提供共生细菌促进婴儿肠道健康^[12-13]，保护婴儿不受外源病菌的感染，并且有助于其免疫系统的发展和成熟^[14]。

我国新疆地区地域广袤、少数民族众多(哈萨克、蒙古、维族、柯尔克孜、塔吉克等)，由于生活习性不同、交通不便、不同民族群体居住区气候反差很大、人口相对隔离，为母乳中益生菌资源的开发提供了丰富的宿主来源。本文通过对新疆喀什地区少数民族妇女母乳中的乳酸菌进行分离与鉴定，研究其种群结构，以期为开发针对少数民族群体、调节肠道菌群促进健康的营养食品，为明确少数民族膳食结构对肠道菌群的影响机制及对健康的相关影响奠定理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样品来源: 实验的11份母乳样品来源于新疆喀什地区的健康妇女，其中2份来自巴楚县，4份来自喀什市，5份来自塔什库尔干塔吉克自治县(简称：塔县)。

1.1.2 母乳样品的采集: 产妇先戴好一次性无菌手套，用无菌生理盐水浸泡的纱布轻轻擦拭乳头以及周围，然后手动收集母乳，丢弃第一滴，然后将大约4-5 mL母乳收集于已灭菌的离心管内，做好标记，用封口膜将采样管口封好，置于4保存，12 h之内尽快运回实验室，存储于-20备用。

1.1.3 培养基: 改良MRS培养基：除基础MRS培养基成分^[15]外，另加0.5% L-半胱氨酸。双歧BS培养基和乳杆选择性培养基，购自青岛科技园海博生物技术有限公司。

1.1.4 参考菌株: Lactobacillus lactis subsp. Lactis CGMCC1.1936、Lactococcus lactis subsp. Cremoris CGMCC1.3992、Bifidobacterium bifidum CGMCC1.5091均购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

1.1.5 主要试剂和仪器: 磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、氯化钠、天津市福晨夫化学试剂厂；硫酸镁、硫酸锰、吐温-80、胰蛋白胨、碘、氢氧化钠，天津市巴斯夫化学试剂厂；无水乙醇、冰醋酸，天津市致远化学试剂厂；L-半胱氨酸，上海蓝季科技发展有限公司；乳杆选择性培养基、双歧BS培养基，青岛科技园海博生物技术有限公司；2×EsTaq Master Mix (Dye)，北京康为世纪生物科技有限公司；Marker 5000，天根生化科技(北京)有限公司；全自动高压灭菌锅(LAC-5040S)，韩国LabTech有限公司；智能生化培养箱(SPX)，宁波市江南仪器厂；高速冷冻离心机(5810R)，德国eppendorf仪器公司；凝胶成像系统(GelDoc XR)，美国Bio-Rad公司；PCR扩增仪(TC-512 PCR)，英国Techne公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化: 取100 μL母乳样品于1 mL已灭菌的MRS液体培养基试管中，将其置于37无氧条件下培养24 h；将培养基凝固完全的培养皿置于无氧条件下2-3 h，使培养基内含有的氧化还原剂(即刃天青)变成无色，达到无氧的程度为止；吸取富集好的母乳100 μL至900 μL无菌水稀释液中，得到10^-1，依次做5个梯度，取10^-3、10^-4、10^-5的梯度菌悬液100 μL，分别接种到预还原的固体培养皿中，涂布均匀。对每个培养皿进行相对应的稀释度标记，每个稀释度做3个平行，并留空白培养皿作对照，然后将其置于37厌氧条件下倒置培养约48 h，直到培养基表面出现菌落；之后，用灼烧灭菌的接种环在每种培养基表面各挑取菌落特征不同的10株左右的菌种，然后置于无菌水中稀释摇匀后，用接种环蘸取少量稀释液，在固体培养基上“之”字形划线，反复划线培养3次得到单菌落。

1.2.2 镜检: 仔细观察已纯化的菌落形态，挑取单菌落于载玻片，置于相差显微镜下进行初步镜检，观察其细胞形状、大小、排列、运动情况等，然后革兰氏染色后进一步镜检，同时进行接触酶试验。将革兰氏染色阳性、接触酶试验阴性的菌株暂定为乳酸菌。

1.2.3 菌株DNA的提取: 参照文献[16]提取单菌落DNA，保存至-20，即可进行PCR扩增。

1.2.4 乳酸菌种、属鉴定: 通过镜检，细胞形态为杆状的细菌用Lactobacilli sp.和Bifidobacterium sp.引物进行PCR扩增，球状的细菌用Enterococcus sp.和Lactococcus sp.引物扩增，各属特异性引物的信息见表 1。扩增反应结束后，取约3 μL的PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。根据产物是否有目的条带，将乳酸菌大致鉴定至属。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析: 采用通用引物27F/ 1492R进行PCR扩增。PCR反应体系为(25 μL)：2×EsTaq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L 27F 0.5 μL，10 μmol/L 1492R 0.5 μL，100 ng/μL DNA模板1 μL，ddH₂O 10.5 μL。PCR反应程序：94；94，55，72，35次循环；72。取3 μL PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 Rep-PCR指纹图谱: 以GTG₅ (5′-GTGGTG GTGGTGGTG-3′)为引物进行Rep-PCR扩增，其体系为(25 μL)：2×EsTaq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L GTG₅ 1.5 μL，100 ng/μL DNA模板3 μL，ddH₂O 8 μL。PCR扩增程序为：95；95，55，65，35个循环；65。PCR扩增产物在180 V (4.5 V/cm)电压下检测约120 min，结束后，在紫外凝胶成像仪中观测DNA图谱并拍照，DNA带型完全一致的菌株通常认为同一物种。然后挑取不同图谱类型的16S rRNA基因PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。

1.2.7 构建系统发育树: 将所测得的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库中，用BLAST进行相关序列的搜索，与GenBank数据库中现有的近缘菌株的序列比较，并从数据库获得相关属、相关种的16S rRNA基因序列，建立系统发育树。序列用ClustalX软件对齐，进化距离的计算应用邻接法neighbor-Joining，采用p-distances法和Kimura-2 parameter双参数法进行，进化树分支模式的稳定性用MEGA v5.0软件分析，采用bootstrap法，重复次数为1 000，构建进化树。

2 结果与分析 2.1 菌株的分离与镜检

从11份母乳样品中，共分离到193株革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的纯培养物，初步将其确定为乳酸菌，通过革兰氏染色，显微镜观察，其中22株为杆状，171株为球状，它们的排列方式有单个、成对或成链。菌落形态大都为白色或乳白，圆形，直径为0.5 mm-2.0 mm (图 1)。

2.2 乳酸菌属间鉴定

利用属间引物进行PCR扩增，结果显示，193株乳酸菌中，有22株属于Lactobacilli，其扩增片段位于250-280 bp之间(图 2)，其所占比例为11%；89株属于Enterococcus，占46%，所占比例最大；42株属于Streptococcus，有40株归属于Lactococcus，未检测到Bifidobacterium，各属所占比例如图 3所示。

2.3 16S rRNA基因扩增及系统发育树的构建

通过Rep-PCR指纹图谱结果(部分如图 4所示)，从相同条带中选取一株作为代表菌，共选取11株代表菌，将其16S rRNA基因PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，然后将测序结果提交到GenBank数据库中，与GenBank数据库中现有的近缘菌株的序列比对，构建系统发育树(图 5)。

由系统发育树可知，11株乳酸菌归属于4个属，分别为Lactobacillus、Lactococcus、Enterococcus和Streptococcus。菌株SHZ1-M-18、SHZ1-B-67、TX33-R-372和TX33-R-397隶属于Lactobacillus，其中SHZ1-M-18和SHZ1-B-67与L. gasseri的序列相似性最高，TX33-R-372和TX33-R-397与Lactobacillus casei的相似性达到99%；菌株YL13-M-413、YL13-B-422、YL21-R-438和YL21-R-462归属于Enterococcus，YL13-M-413和YL13-B-422与E. faecalis的相似性最近，YL21-R-438和YL21-R-462与E. faecium的系统发育关系最近；菌株YL21-B-428属于Lactococcus，它与Lactococcus lactis strain 17 (KT633922.1) 的相似性达到100%；菌株YL64-M-456和YL67-M-410归于Streptococcus，它们与S. salivarius的鉴定值达到99%。

表 2显示，Enterococcus在4个属中所占比例为46%，属于优势菌属，其中E. faecalis在喀什市YL13样品中所占比例最高，为84.6%；E. faecium在喀什市YL21样品中所占比例最大；Lactobacillus主要分离自巴楚县SHZ1和塔县TX33的样品中，在其他样品中，未能分离出Lactobacillus；Lactococcus在其中8份样品中出现；而S. salivarius在11份样品中都有检出，属于优势菌种。

3 结论与讨论

早在30年前就有报道在母乳中发现微生物，但当时认为是受到污染所致^[20]。随着科学技术的进步，大量实验证明母乳中确实存在丰富的微生物。本实验中，我们对11份母乳样品中的乳酸菌检测显示，分离到的乳酸菌菌株归属于Enterorococcus、Streptococcus、Lactobacillus和Lactococcus四个属，其中，Enterorococcus spp.占比最大(46%)，为优势菌属。Collado等在50份母乳样品中检测到了Staphylococcus、Streptococcus、Lactobacillus和Bifidobacterium，其中96%的母乳中发现Clostridium clusters XIVa-XIVb，属于优势菌，其次是Enterorococcus^[21]，这与我们的研究结果有着相似之处。但采用特异性培养基的厌氧分离，我们的实验中并未分离到Bifidobacterium spp.，这可能与我们的母乳样品有关。本次试验样品均为医院产后的妇女母乳，因此大多数母乳属于初乳。最近有人对初乳中的乳酸菌进行了分离培养，只有少部分样品中存在Bifidobacterium spp.；采用分子生物学研究方法研究显示，初乳微生物的种群构成及均匀度明显不同于成熟乳，初乳的微生物群落结构中Bifidobacterium spp.数量很少^[22]。此外，母乳微生物结构的不同与母体的分娩方式(剖腹产，自然分娩)、民族饮食习惯有关系^[23]。新疆南北疆气候差异显著，喀什地处南疆，生态环境复杂、少数民族众多，他们在饮食上的特异性有可能赋予母乳中微生物很高的多样性，本研究将进一步广泛取样少数民族成熟乳样品，以期分离到民族特异的Bifidobacterium spp.益生菌菌株。

本实验中，11份样品中都分离到了S. salivarius，统计显示属于优势种。有研究表明S. salivarius也属于益生菌，它是婴幼儿口腔中最先定殖的细菌，是口腔内正常的菌群组成成员，可参与宿主局部生物屏障的构成，维持宿主口腔菌群的生态平衡^[24]。此外，我们分离到的22株Lactobacillus中，12株属于L. gasseri，10株属于L. casei。Lactobacillus的益生性已被不少文献所证实，例如，2006年Olivares等证明Lactobacillus gasseri CECT5714可以増加感染病原菌实验小鼠的存活率，同时，通过建立感染沙门氏菌的动物模型试验证明了这种益生菌具有抗感染作用^[25]。目前在功能食品开发和临床上使用的益生菌菌株大多数来源于动物肠道以及婴幼儿排泄物，相对来说对母乳中益生菌分离、鉴定，深入研发的相关报道较少。我们的研究显示，母乳中存在大量的Lactobacillus，这将为后续新疆地区少数民族母乳中的益生菌菌株资源的深入研究，开发安全可靠的微生态制剂提供了新的研究思路和基础。