微生物学通报  2018, Vol. 45 Issue (12): 2684−2694
|
苹果树腐烂病菌属子囊类真菌，可引起苹果树腐烂病(Apple tree Valsa canker)，在东亚地区该病害作为一种极具破坏性的疾病而普遍发生[1-2]。苹果树腐烂病菌引起的苹果树腐烂病致使树干、枝干、枝条发病，甚至蔓延至整棵果树[3]。由于该病具有反复性与破坏性，因此是限制中国[4]、日本[5]、韩国[6]等国家苹果产量的重要因素之一。尽管已经筛选出了一些对苹果树腐烂病有防治作用的杀菌剂[7]，但是由于该病病原菌易定殖且在寄主的韧皮部与木质部扩增，使苹果树腐烂病很难通过化学杀菌剂防治[8]。此外，目前绝大部分苹果品种均易感染苹果树腐烂病菌，因此该病害很难通过合理选育抗病品种而得以防治[9-10]。
河西走廊属大陆性干旱气候，全年干燥少雨，气候严酷，其中敦煌地区中、重度盐碱地面积所占比重最大，分别为34.98%和51.23%[11]。该地区极端盐碱环境条件下的微生物由于长期自然选择的结果而得以生存，此外因生物进化的原因使得微生物具有特殊的基因类型、特殊的结构和生理功能，因而具有特殊的代谢类型和多样化的代谢产物，为微生物学研究提供了宝贵的微生物资源。
使用化学杀菌剂防治苹果树腐烂病所带来的环境污染问题违背了农业可持续的基本原则，因而生物防治被看作是最可取的做法。生物防治主要依据拮抗微生物种群之间的相互关系，其中以芽孢杆菌为代表的微生物资源已经成为防治该病害的重要手段[12]。生防芽孢杆菌可分泌多种抗菌物质并促进植物生长，诱导植株产生抗病性，此外芽孢杆菌因能在不良环境条件下形成抗逆、耐热的芽孢而使得微生物菌剂便于储存和运输[13]。目前芽孢杆菌被广泛应用于植物病害防治工作：王卫雄等[14]从苹果树的根际土壤和枝条中分离得到了2株对苹果树腐烂病菌有较好生防活性的芽孢杆菌，分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，为苹果树腐烂病生物制剂的开发提供了材料。马荣等[15]从新疆阿克苏地区发病枝条的病健交界处分离得到一菌株xj019，经分子生物学鉴定结合形态学与生理生化特性分析，确定菌株xj019为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该株菌对新疆苹果树腐烂病菌具有较好的抑制作用，其拮抗效果达到87%。Zhang等[16]从黄瓜老茎中分离得到一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株GB1，结果显示菌株GB1可有效控制苹果树腐烂病菌的生长，另外还发现菌株GB1可在枝条伤口处形成生物膜，同时产生具抗菌活性的代谢产物。
虽然芽孢杆菌对于植物病害的防治有巨大的潜力，能否作为苹果树腐烂病的生防制剂却知之甚少，加之直接从盐碱土壤中分离芽孢杆菌用于苹果树腐烂病的生防研究目前还未见报道，因此本研究从敦煌地区盐碱土壤中分离筛选得到了一株对苹果树腐烂病菌有较好拮抗效果的芽孢杆菌菌株7-2-1-2，并对其进行形态学、生理生化和16S rRNA基因鉴定，测定了其发酵滤液对病原菌菌丝的生长抑制情况和离体防效测定，评估了其作为生防制剂的潜力，为苹果树腐烂病的生物防治提供了新的菌株资源。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 材料来源分离得到芽孢杆菌的土样采集自敦煌地区盐碱土壤。
苹果树腐烂病菌(V. mali)、马铃薯茄链格孢菌(Alternaria solani)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium xoysporum)、油菜立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，均为研究室保藏。
1.1.2 主要试剂和仪器Omega DNA提取试剂盒，广州飞扬生物工程有限公司；牛肉膏蛋白胨培养基(NB)、马铃薯葡萄糖培养基(PDB)，广东环凯微生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯试剂。电热恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；离心机，驭锘实业(上海)有限公司；大容量恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂；可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。
1.1.3 培养基牛肉膏蛋白胨培养基(NA/NB)、金氏B培养基(KB)、营养肉汤酵母膏培养基(NBY)[17]，马铃薯葡萄糖培养基(PDA/PDB)、LB[18]，肉汁胨培养基(BP)[19]。
1.2 芽孢杆菌的分离筛选与纯化菌株分离采用稀释平板涂布法[20]。取5 g盐碱土壤加入盛有45 mL无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分振荡混匀后80 ℃水浴30 min制成土壤悬液。采用10倍稀释法[21]在无菌条件下配置10−2−10−5系列土壤稀释液，分别取不同梯度土壤稀释液0.2 mL涂布于NA培养基上，每个浓度梯度3个重复，于37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h，根据菌落形态特征挑取单菌落进行平板划线，直至平板上长出单一的菌落。
纯化采用平板划线法，将纯化好的菌株保存于NA斜面培养基备用。
1.3 生防芽孢杆菌的筛选 1.3.1 初筛初筛采用平板对峙培养法[14]，在PDA平板中心位置接种倒置的苹果树腐烂病菌的菌饼，距离中心等距离处(2 cm)接种供试芽孢杆菌，每个菌株3次重复，以只接种病原菌为对照，于28 ℃恒温培养箱倒置培养3−5 d，待对照菌落刚好长满整个平板时，测量抑菌带的长度，计算抑菌率。选取抑菌率大于80% (抑菌带半径 > 3.6 cm)的芽孢杆菌进入复筛，计算公式如下：
|
(1) |
(1) 发酵滤液制备：将已活化好的芽孢杆菌接入LB液体培养基中，28 ℃、180 r/min恒温振荡培养18 h，收集发酵液，5 000 r/min离心10 min，取上清，经0.22 μm微孔滤膜过滤2次去除菌体即得发酵滤液。
(2) 芽孢杆菌拮抗性的测定：采用菌丝生长速率法[22]，取已制备好的发酵原液与冷却至50℃左右的PDA培养基于三角瓶中混匀，倒入灭菌培养皿中，待培养基凝固后在平板中央接种靶标病原菌(d=8 mm)，以加入无菌水的PDA培养基作为对照，每处理3个重复，于28 ℃恒温培养箱倒置培养3−5 d，待对照菌落刚好长满整个平板时，采用十字交叉法测量菌落直径，按照公式(1)计算拮抗菌株抑制率。筛选出对靶标病原菌抑制作用最强的菌株。
选取对靶标病原菌抑制作用最强的菌株进行广谱性测定，检测其对马铃薯茄链格孢菌(Alternaria solani)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium xoysporum)以及油菜立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的抑制作用。采用平板对峙培养法对供试病原菌进行抑菌率的测定，方法同1.3.1，计算抑菌率。
1.4 拮抗芽孢杆菌发酵培养基的优化选取6种不同的液体培养基(NB、PD、LB、KB、BP、NBY)进行拮抗菌株的发酵培养，方法同1.3.2，按照公式(1)计算拮抗菌株对靶标病原菌的抑制率，选用最优培养基进行后续试验。
1.5 优势生防菌株鉴定培养与形态特征观察：将经筛选得到的优势芽孢杆菌点接于NA和PDA培养基中，于37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h，观察芽孢杆菌在不同培养基上的菌落生长情况，同时对拮抗菌株进行芽孢染色和革兰氏染色，利用光学显微镜观察菌株的形态特征。
生理生化特性分析：结合分子鉴定结果和形态鉴定的初步结果，确定拮抗菌株所在属，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》对拮抗菌株进行生理生化特性鉴定。
分子生物学鉴定：将菌株7-2-1-2接种于LB培养液中，28 ℃、180 r/min振荡培养过夜，吸取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，室温10 000 r/min离心10 min收集菌体。采用细菌DNA提取试剂盒进行DNA提取。菌株16S rRNA基因片段采用细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系(30 μL)：模板DNA 4.0 μL，10 μmol/L引物各1μL，2.5μmol/L 2×Taq Master-mix 15 μL，ddH2O 9 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，25个循环；72 ℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，检测合格的PCR产物送至金唯智生物科技有限公司测序。
1.6 拮抗菌株发酵液对苹果树腐烂病病原菌的抑制作用测定 1.6.1 无菌发酵滤液对苹果树腐烂病病原菌菌丝生长的抑制作用测定采用1.3.2的方法制备发酵滤液，将发酵滤液与冷却至50 ℃左右的PDA培养基按照体积比为20%、10%、5%、2%、1%、0.5%混匀，分别倒入无菌培养皿内。待培养基凝固后在平板中央接种靶标病原菌(d=8 mm)，以加入无菌水的PDA培养基作为对照，每重复3皿，于28 ℃恒温培养箱倒置培养3−5 d，待对照菌落刚好长满整个平板时，采用十字交叉法测量菌落直径，按照公式(1)计算拮抗菌株抑制率。挑取各处理及对照菌丝在光学显微镜下观察其形态是否发生变化。
1.6.2 拮抗菌株发酵液对离体苹果树腐烂病枝条的防效测定采用离体枝条接种法[23]对1.3筛选出的优势芽孢杆菌进行活体抑菌试验。选取品种为“红富士”的健康果树枝条，用无菌水洗净晾干，75%酒精消毒10 min、无菌水冲洗3次、晾干，剪成15 cm长小段，两端石蜡封口，用直径为5 mm的打孔器在枝条中间打孔并涂抹500μL稀释倍数为0、20、50、100、200倍的拮抗菌株的发酵滤液，晾干，以涂抹无菌水为对照，在打孔处接种苹果树腐烂病菌(d=5 mm)，每个健康枝条一个接种点，3个重复，覆灭菌湿脱脂棉于菌饼后置于经酒精消毒且铺有灭菌湿纱布的白瓷盘中，保鲜膜封口，置于光/暗(12/12 h)交替环境下，28 ℃保湿培养，观察并记录枝条的发病情况，7 d后测量病斑长度，计算防治效果，参照公式(2)。
|
(2) |
采用平板对峙培养法，方法同1.3.1，以马铃薯茄链格孢菌、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、油菜立枯丝核菌为靶标菌，测定拮抗菌株的抗菌谱及抗菌能力。
1.8 数据分析试验数据利用SPSS 17.0软件进行方差分析和Duncan多重比较(P < 0.05)，计算所有均值的标准误；测序结果与NCBI数据库进行核酸序列比对，采用邻接法(Neighbor-Joining)利用MEGA 6.0构建系统发育树。
2 结果与分析 2.1 生防芽孢杆菌的筛选 2.1.1 生防芽孢杆菌的初筛结果本研究从供试的9个盐碱土样中共分离得到289株芽孢杆菌。对各土壤类型中芽孢杆菌的数量研究表明(图 1)，戈壁共分离得到67株芽孢杆菌，占所分离总菌数的23.2%；过渡带分离得到71株芽孢杆菌，占所分离总菌数的24.6%；绿洲共分离得到151株芽孢杆菌，占所分离总菌数的52.2%。综合以上数据分析，不同盐碱土壤类型中，芽孢杆菌数量的关系是：绿洲 > 过渡带 > 戈壁。
|
| 图 1 不同土壤类型所分离芽孢杆菌 Figure 1 Schematis diagram of Bacillus isolated from differrent saline-alkali soil type 注：图中不同小写字母表示经Duncan’s新复极差法检验在P < 0.05水平差异显著. Note: Different lowercase letters in the figure show the significantly different at P < 0.05 lever by Duncan's new multiple range test, respectively. |
|
|
初筛结果表明，通过平板对峙培养法从供试的289株芽孢杆菌中筛选出了121株对苹果树腐烂病菌有不同程度抑菌效果的芽孢杆菌，占总分离菌数的41.87%，其中抑菌率大于85%的芽孢杆菌共21株，占所分离芽孢杆菌的7.27%，结果如表 1所示。
| 菌株编号 Strain code |
抑菌带 Inhibition belt (cm) |
抑菌率 Inhibition ratio (%) |
| 11-4-4 | 3.73±0.067cdef | 91.05±1.627cdef |
| 17-2-2 | 3.83±0.067efgh | 93.49±1.627efgh |
| 17-2-3 | 3.67±0.067bcde | 89.43±1.627bcde |
| B6-2-1-2 | 3.67±0.033bcde | 89.43±0.813bcde |
| 7-2-1-1 | 3.67±0.033bcde | 89.43±0.813bcde |
| 7-2-1-2 | 3.53±0.033a | 86.18±0.810a |
| 7-2-1-3 | 3.77±0.033efgh | 91.87±0.813defg |
| 7-2-1-4 | 3.93±0.033gh | 95.93±0.813gh |
| 7-2-1-6 | 3.87±0.033fgh | 94.31±0.813fgh |
| 7-2-1-7 | 3.57±0.033bc | 86.99±0.810bc |
| 7-2-2-5 | 3.97±0.033h | 96.75±0.813h |
| 7-2-3-2 | 3.93±0.033gh | 95.93±0.813gh |
| 7-2-3-4 | 3.83±0.033efgh | 93.49±0.813efgh |
| 7-3-2-3 | 3.67±0.033bcde | 89.43±0.813bcde |
| 10-3-1-1 | 3.60±0.058bcd | 87.80±1.406bcd |
| 10-4-2-2 | 3.67±0.033bcde | 89.43±0.813bcde |
| 11-2-3-4 | 3.73±0.033cdef | 91.05±0.813cdef |
| 17-2-1-7 | 3.67±0.167bcde | 89.43±4.063bcde |
| 17-2-2-1 | 3.67±0.033bcde | 89.43±0.813bcde |
| 17-2-2-9 | 3.93±0.033gh | 95.93±0.813gh |
| 11-2-2-14 | 3.53±0.033ab | 86.18±0.810ab |
| 注：抑菌带=对照菌落半径–试验菌落半径；同列数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P < 0.05水平差异显著. Note: Inhibition belt=Control colony radius–Test colony radius; Different lowercase letters in the same column show the significantly different at P < 0.05 lever by Duncan’s new multiple range test, respectively. |
||
采用菌丝生长速率法对初筛中抑菌率大于85%的21株生防芽孢杆菌进行复筛，结果表明其中3株芽孢杆菌的发酵滤液对靶标菌的生长有较好的抑制作用，而菌株7-2-1-2对苹果树腐烂病菌的抑菌活性明显优于其他菌株，其抑菌率达到73.2% (图 2)。结合初筛和复筛的结果，将菌株7-2-1-2作为生防芽孢杆菌用于后续研究。
|
| 图 2 拮抗菌株的复筛结果图 Figure 2 The picture of antagonistic Bacillus against V. mali by second screening 注：A：菌株7-2-1-2；B：对照. Note: A: Strain 7-2-1-2; B: Control. |
|
|
在不同的发酵培养基中，菌株经28 ℃恒温振荡培养18 h后，制备发酵滤液，观察其对靶标菌的抑菌作用，菌株7-2-1-2在不同的发酵培养基中发酵培养后，其无菌发酵滤液对靶标菌的抑制率有所不同，结果表明培养基对菌株的抑菌作用有一定的影响，从而导致其对靶标菌的抑制率有一定的差异，其中在KBA培养基中发酵培养后菌株的抑制作用相对较弱，其抑菌率为31.30%，而在NBY培养基中菌株的抑制作用较强，其抑菌率达到90.65%，依据抑菌率的大小，菌株7-2-1-2在不同培养基中发酵培养后其抑菌作用的强弱为NBY > LB > PD > NB > BP > KB (图 3)。综上所述，将NBY培养基作为菌株7-2-1-2发酵培养的最优培养基。
|
| 图 3 不同培养基对菌株7-2-1-2抑菌率的影响 Figure 3 Effect of different medium on inhibition ratio of 7-2-1-2 |
|
|
菌株7-2-1-2革兰氏染色为阳性。在NA培养基上菌落呈圆形，无色透明液滴状，表面光滑且有光泽，边缘规则不扩散(12−18 h)；培养后期颜色较为暗淡，边缘不整齐(24 h)；培养时间延长至36 h时，菌落边缘不规则，呈放射状，菌落颜色不透明，有粘附性(图 4A、B、C)。在PDA培养基上菌落近似圆形，表面光滑，隆起，边缘整齐(12−18 h)；培养36 h后，菌落变大，表面有皱纹且隆起，边缘呈圆锯齿形，同时菌落有粘附性(图 4D、E)。在斜面上划线培养呈丝状生长，在液体培养基中生长时，液体浑浊且有菌膜，即呈浮膜状。
|
| 图 4 菌株7-2-1-2不同时期的菌落形态图 Figure 4 The pictures of colony morphology of 7-2-1-2 for various periods 注：A、B、C：NA培养基；D、E：PDA培养基. Note: A, B, C: NA; D, E: PDA. |
|
|
鉴于分子鉴定的结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》，生理生化和碳氮源利用结果如表 2所示。
| 生理生化特性 Physiological and biochemical |
菌株7-2-1-2 Strain 7-2-1-2 |
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis |
| 革兰氏染色Gram staining | + | + |
| 接触酶Contact enzyme | + | + |
| 柠檬酸利用Citrate utilization | + | + |
| V-P测定V-P test | + | + |
| M-R测定M-R test | + | + |
| 硝酸盐还原Nitrate reduction | + | + |
| 乳糖发酵实验Lactose fermentation experiment | – | – |
| 碳源利用Carbon utilization | + | + |
| Growth in 1% NaCl | + | + |
| Growth in 2% NaCl | + | + |
| Growth in 5% NaCl | + | + |
| Growth in 7% NaCl | + | + |
| Growth in 10% NaCl | + | + |
| 注：+：阳性；–：阴性. Note: +: Positive; –: Negative. |
||
对菌株7-2-1-2的16S rRNA基因片段进行PCR扩增，并将PCR产物测序，测序结果表明该区段的长度为1 437 bp，综合比对结果显示：菌株7-2-1-2与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp. spizizenii，KM273782)的同源性最近且相似性为99% (图 5)。
|
| 图 5 菌株7-2-1-2的系统发育树 Figure 5 Evolutional tree of strain 7-2-1-2 注：Bootstrap次数设置为1 000，邻接法构建系统发育树；括号中为相关细菌的GenBank的登录号；尺标表示每个核苷酸位点上的0.1替换值. Note: The number at branch nodes are the percentage bootstrap support based on Neighbor-Joining analysis of 1 000 resample data sets; The numbers in parentheses represent the sequence accession numbers in GenBank; The scale bar corresponds to 0.1 substitutions pernucleotide position. |
|
|
结合菌落形态特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析，将菌株7-2-1-2初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp. spizizenii)。
2.4 菌株7-2-1-2对苹果树腐烂病菌的防效测定 2.4.1 发酵滤液对苹果树腐烂病菌的抑制作用试验结果表明，不同稀释倍数下，菌株7-2-1-2的发酵滤液对苹果树腐烂病菌的抑制作用如图 6所示，随着发酵滤液稀释倍数的增加，对苹果树腐烂病菌菌丝的抑制率也随之减小。稀释5倍的发酵液几乎能够完全抑制病原菌菌丝的生长，抑制率达94.31%；稀释20倍时，抑制率为73.98%；而当发酵液稀释倍数为50时，其抑制率不到60%，降为56.91%；发酵滤液稀释100倍时，其对菌丝的生长抑制作用较弱，当发酵液的稀释倍数增加到200时，完全失去了对病原菌菌丝的生长抑制作用。
|
| 图 6 菌株7-2-1-2的发酵滤液对苹果树腐烂病菌的抑制作用 Figure 6 Inhibiting effect of fermentation liquid of strain 7-2-1-2 against mycelia growth of V. mali for apple tree |
|
|
如图 7所示，不同稀释倍数的菌株7-2-1-2发酵滤液对苹果树腐烂病菌有明显不同程度的抑制作用，病斑面积和防治效果均显著低于对照组。由表 3可看出，随着发酵滤液稀释倍数的不断增加，病斑面积不断扩大，加入原液的离体枝条的病斑面积与加入稀释5倍发酵液的病斑面积相差较小，病斑面积为93.53%，发酵液的稀释倍数为50时，病斑面积为15.75 cm2，防治效果大于60%为62.67%，而当稀释倍数增加至100倍时，防效降为18.68%，稀释至200倍时，发酵滤液失去了对病原菌的生长抑制作用。
|
| 图 7 菌株7-2-1-2对苹果树腐烂病离体枝条防效效果 Figure 7 Control efficiency of Bacillus strain 7-2-1-2 on detached twigs inoculated with V. mali for apple tree |
|
|
| 稀释倍数(倍) Dilution time |
病斑面积 Scab area (cm2) |
防效结果 Control efficiency (%) |
| 0 | 0 | 100 |
| 5 | 2.73±0.249b | 93.53±0.591d |
| 20 | 3.75±0.2b | 91.12±0.473d |
| 50 | 15.75±0.76c | 62.67±1.801c |
| 100 | 34.32±0.641d | 18.68±1.518b |
| Control | 41.96±0.798e | 0 |
| 注：同列数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P < 0.05水平差异显著. Note: Different lower case letters in the same column show the significantly different at P < 0.05 level by Duncan’s new multiple range test, respectively. |
||
平板对峙培养法结果表明，菌株7-2-1-2对供试的4种病原菌均具有较好的抑菌作用，由表 4可看出，其对病原菌的抑制率均大于60%，其中对茄腐镰刀菌(Fusarium solani)与尖孢镰刀菌(Fusarium xoysporum)的抑制效果明显大于其他2株供试的病原菌。
| Pathogens | 病斑面积 Scab area (cm2) |
防效结果 Control efficiency (%) |
| 马铃薯茄链格孢菌Alternaria solani | 0.77±0.33b | 64.10±2.56a |
| 茄腐镰刀菌Fusarium solani | 0.53±0.33a | 86.28±1.96c |
| 尖孢镰刀菌Fusarium xoysporum | 0.53±0.33a | 88.23±1.67c |
| 油菜立枯丝核菌Rhizoctonia solani | 0.80±0.023b | 75.00±1.15b |
| 注：同列数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P < 0.05水平差异显著. Note: Different lower case letters in the same column show the significantly different at P < 0.05 level by Duncan’s new multiple range test, respectively. |
||
苹果树腐烂病造成苹果产量的严重下降致使果农过度依赖杀菌剂进行病害防治。然而，化学药剂的过度使用加剧了环境污染的步伐，同时危害食品安全。基于此，通过拮抗微生物进行生物防治已成为研究者们共同青睐并积极探讨的热点课题[12, 24-25]，相比于化学药剂所带来的高毒性、高残留以及致病菌易产生抗药性等特点，生防细菌尤其是芽孢杆菌具有诸多优点[22]，如产生抗紫外、耐热耐干燥的芽孢，抵抗不良环境而便于生物制品的制备及运输[26-27]。相较于自然条件下普通微生物而言，在盐碱土壤这种极端环境条件下微生物具有特殊的生理结构、代谢方式及遗传特性等，具备普通微生物所不具备的或缺少的功能[28]，因此，本研究室重点从盐碱土壤中分离芽孢杆菌，挖掘这类特殊的微生物资源对V. mali潜在的生防潜力，发现了一株对V. mali有较好生防效果的芽孢杆菌。
关于苹果树腐烂病的生物防治方面，王彩霞等[29]从苹果园根际土壤中分离出一株对苹果树腐烂病有显著拮抗作用的菌株BJ1，菌株BJ1初步鉴定为微嗜酸寡氧单胞菌Stenotrophomonas acidaminiphila，其发酵滤液对苹果树腐烂病菌的菌丝及分生孢子均有很好的抑制作用；Zhang等[16]从黄瓜老茎中分离出一株对苹果树腐烂病有较强抗病性的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株GB1，连续2年的田间试验及小面积应用，取得了稳定的防治效果，其控制苹果腐烂病的效果高达90%。初步的抑菌机理研究结果表明，GB1主要是通过产生蛋白酶和潜在的抗生素类物质来杀死病原真菌，其可定殖于苹果韧皮部和木质部并能加速苹果伤口的愈合；王卫雄等[14]从苹果树的根际土壤和枝条中分离得到了2株对苹果树腐烂病菌有较好生防活性的芽孢杆菌，分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，离体枝条防效测定结果表明生防菌株的发酵滤液对苹果树腐烂病的抑制作用随着稀释倍数的增加而降低，原液的生防效果最好，与本研究结果一致。
本研究以苹果树腐烂病菌(V. mali)为防治对象，从敦煌地区盐碱土壤中筛选分离得到了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株7-2-1-2，并对其生防效果及发酵最优培养基进行了初步的研究，通过平板对峙培养法及菌丝生长速率法发现菌株7-2-1-2对V. mali有较好的抑菌效果，说明菌株7-2-1-2能够产生对病原菌菌丝生长有抑制作用的活性物质，进而表明该菌对苹果树腐烂病有潜在的生防潜力；V. mali在含有菌株7-2-1-2发酵滤液的培养基上菌落形态发生变化，此外其发酵滤液对于苹果树离体发病枝条也有明显的抑菌效果。菌株7-2-1-2能够抑制Alternaria solanim、Fusarium solani、Fusarium xoysporum、Rhizoctonia solani等多种病原菌的生长，表明该菌可产生多样化的抑制植物病原菌生长的活性物质[26, 30-31]。
鉴于菌株7-2-1-2对V. mali的良好抑菌效果，接下来我们将对其抗菌的活性产物的提取、抑菌机制以及田间防效进行研究与评估，进一步探讨其作为苹果树腐烂病生防菌剂的可能性。
| [1] |
Abe K, Kotoda N, Kato H, et al. Resistance sources to Valsa canker (Valsa ceratosperma) in a germplasm collection of diverse Malus species[J]. Plant Breeding, 2007, 126(4): 449-453. |
| [2] |
Adams GC, Roux J, Wingfield MJ. Cytospora species (Ascomycota, Diaporthales, Valsaceae): introduced and native pathogens of trees in South Africa[J]. Australasian Plant Pathology, 2006, 35(5): 521-548. DOI:10.1071/AP06058 |
| [3] |
Ke XW. Histocytology and transcriptomics studies on infection of Malus domestica Cv. Fuji by Valsa mali[D]. Xi'an: Doctoral Dissertation of Northwest A & F University, 2013 (in Chinese) 柯希望.黑腐皮壳侵染苹果的组织细胞学及转录组学研究[D].西安: 西北农林科技大学博士学位论文, 2013 |
| [4] |
Wang L, Zang R, Huang LL, et al. The investigation of apple tree Valsa canker in Guanzhong region of Shaanxi Province[J]. Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry (Natural Science Edition), 2005, 33(S1): 98-100. (in Chinese) 王磊, 臧睿, 黄丽丽, 等. 陕西省关中地区苹果树腐烂病调查初报[J]. 西北农林科技大学学报:自然科学版, 2005, 33(S1): 98-100. |
| [5] |
Abe K, Kotoda N, Kato H, et al. Genetic studies on resistance to Valsa canker in apple: genetic variance and breeding values estimated from intra- and inter-specific hybrid progeny populations[J]. Tree Genetics & Genomes, 2011, 7(2): 363-372. |
| [6] |
Lee DH, Lee SW, Choi KH, et al. Survey on the occurrence of apple diseases in Korea from 1992 to 2000[J]. Plant Pathology Journal, 2006, 22(4): 375-380. DOI:10.5423/PPJ.2006.22.4.375 |
| [7] |
Wang L, Gao ZP, Huang LL, et al. Screening fungicide for pathogen inhibition and disease control of apple tree Valsa canker[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2009, 39(5): 549-554. (in Chinese) 王磊, 郜佐鹏, 黄丽丽, 等. 防治苹果树腐烂病杀菌剂的室内筛选[J]. 植物病理学报, 2009, 39(5): 549-554. DOI:10.3321/j.issn:0412-0914.2009.05.016 |
| [8] |
Yin ZY, Ke XW, Huang DX, et al. Validation of reference genes for gene expression analysis in Valsa mali var. mali using real-time quantitative PCR[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 29(9): 1563-1571. DOI:10.1007/s11274-013-1320-6 |
| [9] |
Bessho H, Soejima J, Tsuchiya S. Screening methods of apple trees for resistance to Valsa canker[A]//Progress in Temperate Fruit Breeding[M]. Netherlands: Springer, 1994: 49-52
|
| [10] |
Liu XY, Lyu S, Wang Y, et al. Evaluation of resistance of malus germplasms to apple canker (Valsa ceratosperma)[J]. Journal of Fruit Science, 2011, 28(5): 843-848. (in Chinese) 刘欣颖, 吕松, 王忆, 等. 苹果种质资源对苹果树腐烂病抗性评价[J]. 果树学报, 2011, 28(5): 843-848. |
| [11] |
Guo SQ, Cui ZT, Fu QM. Idea and suggestions on saline-alkali soil status quo and managements in Gansu province[J]. Chinese Journal of Agricultural Resources and Regional Planning, 2013, 34(4): 75-79. (in Chinese) 郭世乾, 崔增团, 傅亲民. 甘肃省盐碱地现状及治理思路与建议[J]. 中国农业资源与区划, 2013, 34(4): 75-79. |
| [12] |
Jacobsen BJ, Zidack NZ, Larson BJ. The role of Bacillus-based biological control agents in integrated pest management systems: plant diseases[J]. Phytopathology, 2004, 94(11): 1272-1275. DOI:10.1094/PHYTO.2004.94.11.1272 |
| [13] |
Pérez-García A, Romero D, de Vicente A. Plant protection and growth stimulation by microorganisms: biotechnological applications of Bacilli in agriculture[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22(2): 187-193. DOI:10.1016/j.copbio.2010.12.003 |
| [14] |
Wang WX, Xu BL, Xue YY, et al. Identification and antifugla activity of the antagonistic bacteria of Cytospora spp[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2014, 22(10): 1214-1221. (in Chinese) 王卫雄, 徐秉良, 薛应钰, 等. 苹果树腐烂病拮抗细菌鉴定及其抑菌作用效果测定[J]. 中国生态农业学报, 2014, 22(10): 1214-1221. |
| [15] |
Ma R, Liu XL, Wang XW, et al. Screening and identification of the antagonistic bacteria apple canker in Xinjiang[J]. Journal of Xinjiang Agricultural University, 2015, 38(2): 136-139. (in Chinese) 马荣, 刘晓琳, 王晓炜, 等. 新疆苹果树腐烂病拮抗细菌的筛选与初步鉴定[J]. 新疆农业大学学报, 2015, 38(2): 136-139. DOI:10.3969/j.issn.1007-8614.2015.02.008 |
| [16] |
Zhang JX, Gu YB, Chi FM, et al. Bacillus amyloliquefaciens GB1 can effectively control apple Valsa canker[J]. Biological Control, 2015, 88: 1-7. DOI:10.1016/j.biocontrol.2015.04.022 |
| [17] |
Schaad NW. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria[M]. Guiyang: Guizhou People's Publishing House, 1986. (in Chinese) Schaad NW. 植物病原细菌鉴定实验指南[M]. 贵阳: 贵州人民出版社, 1986. |
| [18] |
Sun Y. Laboratory Manual for Microbiology[M]. Xi'an: Shaanxi Normal University General Publishing House Co. LTD, 2015: 154-157. (in Chinese) 孙燕. 微生物学实验指导[M]. 西安: 陕西师范大学出版总社, 2015: 154-157. |
| [19] |
Wang JF, Qi KB, He YM. Experimental Course of Genetics[M]. Beijing: Higher Education Press, 2008: 131. (in Chinese) 王金发, 戚康标, 何炎明. 遗传学实验教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2008: 131. |
| [20] |
Zhang XZ, Xu JH, Li SP. Isolation, screening and preliminary identification of plant pathogenic fungi biocontrol strains of Bacillus spp[J]. Soils, 2005, 37(1): 85-88. (in Chinese) 张晓舟, 徐剑宏, 李顺鹏. 植病生防芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定[J]. 土壤, 2005, 37(1): 85-88. |
| [21] |
Wang AJ, Chai ZX, Li JH, et al. Screening and identification of antagonistic Bacillus strains against pathogens of fusarium dry rot and black scurf in potato[J]. Chinese Journal of Biological Control, 2013, 29(4): 586-594. (in Chinese) 王爱军, 柴兆祥, 李金花, 等. 马铃薯干腐病菌和黑痣病菌拮抗芽胞杆菌的筛选及鉴定[J]. 中国生物防治学报, 2013, 29(4): 586-594. |
| [22] |
Wang B, Niu SQ, Da WY, et al. Screening of Actinomyces on Antagonism to Rhizoctonia solani Isolated from Saline-alkali Soils in Hexi Corridor[J]. Biotechnology Bulletin, 2014(1): 156-160. (in Chinese) 王蓓, 牛世全, 达文燕, 等. 河西走廊盐碱土壤中抗立枯丝核菌的放线菌筛选[J]. 生物技术通报, 2014(1): 156-160. |
| [23] |
Wei JL, Huang LL, Gao ZP, et al. Laboratory evaluation methods of apple Valsa canker disease caused by Valsa ceratosperma sensu Kobayashi[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2010, 40(1): 14-20. (in Chinese) 韦洁玲, 黄丽丽, 郜佐鹏, 等. 苹果树腐烂病室内快速评价方法的研究[J]. 植物病理学报, 2010, 40(1): 14-20. |
| [24] |
Noble R, Coventry E. Suppression of soil-borne plant diseases with composts: A review[J]. Biocontrol Science & Technology, 2005, 15(1): 3-20. |
| [25] |
Sharma RR, Singh D, Singh R. Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists: A review[J]. Biological Control, 2009, 50(3): 205-221. DOI:10.1016/j.biocontrol.2009.05.001 |
| [26] |
Piggot PJ, Hilbert DW. Sporulation of Bacillus subtilis[J]. Current Opinion in Microbiology, 2004, 7(6): 579-586. DOI:10.1016/j.mib.2004.10.001 |
| [27] |
Tiago I, Teixeira I, Silva S, et al. Metabolic and genetic diversity of mesophilic and thermophilic bacteria isolated from composted municipal sludge on poly-ε-caprolactones[J]. Current Microbiology, 2004, 49(6): 407-414. DOI:10.1007/s00284-004-4353-0 |
| [28] |
Niu SQ, Long Y, Li HY, et al. Microbial diversity in saline alkali soil from Hexi Corridor analyzed by Illumina MiSeq high-throughput sequencing system[J]. Microbiology China, 2017, 44(9): 2067-2078. (in Chinese) 牛世全, 龙洋, 李海云, 等. 应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析河西走廊地区盐碱土壤微生物多样性[J]. 微生物学通报, 2017, 44(9): 2067-2078. |
| [29] |
Wang CX, Zhang QM, Li GF, et al. Identification of the antagonistic bacteria BJ1 and its antifungal activity against Valsa ceratosperma[J]. Acta Phytophylacica Sinica, 2012, 39(5): 431-437. (in Chinese) 王彩霞, 张清明, 李桂舫, 等. 苹果树腐烂病拮抗细菌菌株BJ1的鉴定及其抑菌作用[J]. 植物保护学报, 2012, 39(5): 431-437. |
| [30] |
Ongena M, Jourdan E, Adam A, et al. Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants[J]. Environmental Microbiology, 2007, 9(4): 1084-1090. DOI:10.1111/emi.2007.9.issue-4 |
| [31] |
Niu HJ, Li H, Wang NN, et al. Isolation and purification of antifungal protein from Bacillus subtilis E1R-j against Valsa mali[J]. Journal of Northwest A & F University (Natural Science Edition), 2016, 44(9): 135-142. (in Chinese) 牛焕杰, 李辉, 王娜娜, 等. 苹果树腐烂病菌拮抗枯草芽孢杆菌E1R-j抗菌蛋白的分离纯化[J]. 西北农林科技大学学报:自然科学版, 2016, 44(9): 135-142. |
表1(Table 1)
