大肠杆菌是最为常见的一类模式微生物和生物工程领域应用最广泛的宿主菌。在相关基础研究及应用过程中，往往需要对大肠杆菌的遗传性状进行改造^[1]。其中基因组编辑通过在染色体水平上进行靶基因的敲除、插入或替换，可以稳定地实现大肠杆菌的多靶点遗传性状的改变，目前已经成为大肠杆菌代谢工程研究最重要的方法之一^[2]。由于大肠杆菌自身的重组效率低，因此大肠杆菌的基因组编辑需要通过外源λ-Red或RecET介导的同源重组技术实现^[3-5]。该方法需要两端带有同源臂的线性DNA片段，在λ-Red或RecET重组酶的作用下通过DNA分子双交换将靶DNA序列替换为带有筛选标记的外源片段，从而实现基因序列的敲除、插入或替换^[6]。

但是传统的大肠杆菌同源重组技术需要辅助质粒、筛选标记消除等过程，多靶点连续编辑时效率低、流程过于繁琐^[7]。近年来，CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术的引入极大地促进了大肠杆菌同源重组技术的效率。CRISPR来源于细菌和古菌的微生物免疫防御系统^[8]。在天然条件下，CRISPR系统利用具有核酸酶活性的Cas9蛋白，在一段RNA指导下特异性识别目标DNA序列，然后将该序列进行切除。目前应用最为广泛的CRISPR是Ⅱ型CRISPR/Cas9系统，该系统只需要设计一段包含有基因组特定位点附近的PAM区(Protospacer adjacent motif)序列作为导向RNA (SgRNA)，用于引导Cas9识别靶向序列。CRISPR/Cas9系统已成功应用于原核生物^[9]、真核生物^[10]、人类^[11]、小鼠^[12]、斑马鱼^[13]等生物体中目标基因组编辑工作。

2015年，Jiang等^[14]通过将CRISPR/Cas9与λ-Red同源系统结合，成功实现了利用CRISPR系统对大肠杆菌多靶点基因组的连续编辑。在该系统中，他们将Cas9蛋白与λ-Red同源重组系统中介导同源重组的3个蛋白Exo、Bet、Gam的表达单元共同构建在同一个温敏型质粒pCas9上，同时利用另外一个质粒pTarget表达能够特异性识别靶位点的sgRNA序列(双质粒策略)。当存在同源打靶片段的情况下，Cas9首先在sgRNA的介导下在靶位点特异性切断基因组DNA，然后通过λ-Red重组蛋白的作用实现同源片段的整合。该系统不需要筛选标记，整合效率可以达到100%，并能实现2个靶位点的敲除/整合，但完成敲除/整合后仍然需要单独的步骤利用Cas9的作用消除pTarget质粒。每一轮操作需要4 d的时间。

2016年，Zhao等^[15]对上述CRISPR/Cas9辅助λ-Red同源重组系统进行了改造，采用了单质粒系统代替了双质粒系统：在每一轮操作过程中，通过Golden Gate介导的多片段连接一步构建了含有sgRNA、Cas9蛋白、λ-Red重组蛋白表达单元、打靶片段的单一质粒，然后通过诱导λ-Red重组蛋白实现sgRNA介导的基因敲除过程。该策略可以将一轮基因敲除的周期缩短到3 d，但在实验过程中需要过表达RecA并延长同源臂长度以提高敲除效率，操作仍然很繁琐。特别是在基因敲除过程中，大质粒的多片段连接存在连接效率低、假阳性等问题，实验缺乏灵活性。

为此，本研究采用多个不同温度敏感程度的质粒对原有系统进行改造，从而在大肠杆菌中建立一种更为高效、灵活的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑策略。通常采用的温度敏感型质粒均是基于pSC101复制启始位点的突变(pSC101^ts型质粒)。当pSC101复制启始位点中的Rep蛋白特定氨基酸位点发生突变(H289Y)时，Rep蛋白在高温条件下失活导致质粒无法复制，造成质粒丢失^[16]。与pSC101复制启始位点相类似，RK2复制启始位点包含介导质粒复制的TrfA蛋白^[17]，TrfA蛋白存在多个突变位点能够导致RK2复制启始位点发生温度敏感型突变。例如在TrfA蛋白编码DNA序列末端的1 122-1 124三个碱基发生缺失时，会导致质粒在37 ℃也无法正常复制(RK2^ts型质粒)^[18]。因此相较于pSC101^ts型质粒，在相同温度下RK2^ts型质粒更容易丢失。利用pSC101^ts型质粒与RK2^ts型质粒之间的温度敏感性差异，可以通过对温度及筛选标记的控制实现质粒的选择性缺失。我们通过对传统CRISPR方法中pTarget质粒进行改造，将其替换为RK2^ts型温度敏感型质粒；同时选择2种抗性标记进行交替使用，一步实现pTarget质粒的消除和下一轮基因敲除过程中的质粒与打靶片段的转入。这一方法既避免了单质粒策略中多片段组装的繁琐操作，又改进了双质粒策略中pTarget质粒消除过程，实现了实验操作周期的缩短。该方法提供了一种快速、易操作的新型大肠杆菌CRISPR系统。我们采用这种优化的CRISPR/Cas9策略成功实现在短时间内对大肠杆菌基因组aspA基因强启动子CPA1的替换，以及BspanD外源基因的整合，并成功实现了对大肠杆菌合成β-丙氨酸相关靶点的测试与优化。

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BP01、BW25113、T1由本实验室保存，相关质粒见表 1。

LB培养基、自诱导培养基、M9盐按照分子克隆或精编分子生物学指南配制。卡那霉素(Kan)和链霉素(Str)的工作浓度为50 μg/mL，氨苄青霉素(Amp)的工作浓度为100 μg/mL。

Gibson Assembly Kit、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自New England BioLabs公司；Fast fly Pfu聚合酶购自全式金公司；DNA纯化及凝胶回收试剂盒购自Promega公司；引物由睿博兴科生物工程有限公司合成；L-阿拉伯糖购自上海宏邦医药科技有限公司；乙腈(色谱级)购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

高相液相色谱仪、高效液相色谱柱，Agilent公司；电转仪，Bio-Rad公司。

pTW-A、pTW-S质粒采用Gibson组装方法构建。pCas1通过PCR扩增pCas质粒后，再用Bgl Ⅱ酶切自连获得。pTW-Ai和pTW-Sa利用PCR扩增自连获得。全部分子生物学操作按照分子克隆实验指南进行。基因测序由睿博兴科生物技术有限公司进行。所涉及引物见表 2。

(1) 打靶片段的制备。以实验室构建的带有枯草芽孢杆菌脱羧酶基因的质粒pS9Bs为模板，利用引物iclRBspanD-F与iclRBspanD-R扩增带有大肠杆菌基因iclR位点上、下游同源臂及BspanD基因部分，制备得到BspanD打靶片段。以质粒pCPA1为模板，利用引物aspACPA1-F与aspACPA1-R扩增带有基因组aspA位点上、下游同源臂及CPA1启动子的部分，制备得到CPA1打靶片段。PCR产物分别通过PCR产物纯化试剂盒或凝胶回收试剂盒进行纯化(必要时纯化后以Dpn Ⅰ限制性内切酶37 ℃处理6 h以去除模板质粒，并再次通过PCR产物纯化试剂盒回收打靶片段)。

(2) Red基因的诱导表达及电转感受态细胞的制备。质粒pCas9利用CaCl₂法转化进入宿主菌BW25113，于含有氨苄青霉素的LB培养基中30 ℃、200 r/min培养过夜，次日按1:100接种至100 mL LB培养基，30 ℃、200 r/min培养至OD₆₀₀为0.2，加入L-阿拉伯糖至终浓度30 mmol/L，诱导1 h (OD₆₀₀不超过0.6)，使Redα、Redβ和Redγ 3种蛋白质表达。诱导后的菌体于冰上预冷30 min，然后4 ℃、4 000 r/min离心10 min，用预冷的无菌水洗涤1次，然后用预冷的10%甘油洗涤3次，浓缩成500 μL感受态细胞，取50 μL感受态用于电转化。

(3) 电转化。将处理过的打靶DNA片段与感受态细胞混匀，转入预冷的0.1 cm电击杯，然后进行电击，电击条件为电压1.8 kV，电击时间5 ms，电击完成后立即加入预热的LB培养基，30 ℃复苏2 h，涂布卡那霉素+氨苄青霉素抗性平板，30 ℃培养过夜。

实验所需菌株为甘油冻存管保存，使用前取甘油菌在相应抗性平板上划线，温度敏感型菌株平板置于30 ℃恒温培养箱中，BP相关菌株置于37 ℃恒温培养箱中。第2天挑取单克隆于液体LB (含相应抗生素)中，在所需温度条件下200 r/min振荡培养。

生物转化：将测试菌株自甘油冻存管中划线接种到平板，挑取单克隆于液体LB培养基中活化过夜，以1:100转接至含诱导物L-阿拉伯糖的ZYM自诱导培养基中，30 ℃、200 r/min蛋白诱导表达14 h，第2天4 ℃、5 000 r/min离心10 min收集菌体，加入M9-Glc转化液重悬菌体，37 ℃、200 r/min底物转化4 h后留取样品测定氨基酸含量。M9-Glc转化液成分：葡萄糖10 g/L，M9缓冲盐溶液(稀释至1×M9)，NH₄Cl 10 g/L。

β-丙氨酸的衍生及HPLC测定：取样品300 μL，10 000 r/min离心10 min，分别取上清液、0.5 mol/L NaHCO₃、衍生试剂DNFB (1:100配于乙腈溶液中)各100 μL，摇匀，置于60 ℃水浴中避光反应1 h，加入700 μL 0.01 mol/L KH₂PO₄ (pH 7.0)，13 000 r/min离心10 min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC测定。

HPLC测定方法：色谱柱Zorbax SB C18 (5 μm，4 mm×250 mm)；流动相A：0.02 mol/L NaAc (pH 6.2)；流动相B：乙腈。线性梯度洗脱程序：时间0-20 min，B：5%-33%线性梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，紫外检测器，检测波长360 nm，参比波长600 nm，进样量10 μL。

为了验证pSC101^ts与RK2^ts复制启始位点对温度敏感性的差异，将分别含有2种复制启始位点的pSA1质粒(含有pSC101^ts复制启始位点)及pWA4质粒(含有RK2^ts复制启始位点)转化进入BW25113中，获得菌株SA1及WA4。经30 ℃含有羧苄青霉素抗性的液体LB培养基培养活化后转入无抗生素的液体LB培养基，继续在40 ℃培养6 h。然后稀释1 000倍后涂布于无抗性固体LB平板或羧苄青霉素平板上，40 ℃培养过夜。结果发现(图 1)，WA4在羧苄青霉素平板上无菌落，证明pWA4质粒在这一条件下能够很好地被消除，质粒传代丢失率100%。而SA1在羧苄青霉素平板上有明显的菌落克隆生成，PCR验证该克隆仍然含有pSA1质粒。以上结果表明含有RK2^ts复制启始位点质粒具有更强的温度敏感性。

图 1　温度敏感型质粒的丢失情况 Figure 1　Plasmids curing of different temperature sensitive plamids 注：A：SA1菌株中质粒pSA1高温情况下丢失不彻底；B：WA4菌株中质粒pWA4高温情况下可丢失彻底. Note: A: Plasmids pSA1 in strain SA1 still exist after cultivating under high-temperature; B: High temperature can eliminate plasmids pWA4 in strain WA4 absolutely.

图选项

为了验证当含有2种温度敏感型复制起始位点的质粒共存时能够选择性地丢失RK2^ts复制起始位点质粒，将含有卡那霉素抗性的pSC101^ts复制启始位点质粒pSK1与pWA4共转化入BW25113菌株中，在含有卡那霉素及羧苄青霉素抗性的液体LB培养基活化后，转入含有卡那霉素抗性的液体LB培养基中40 ℃培养6 h。然后稀释1 000倍后涂布于卡那霉素平板或卡那霉素与羧苄青霉素双抗平板上，40 ℃培养过夜。结果表明，菌体在双抗平板上不能生长，而仅在卡那霉素平板上生长，证明菌体可以选择性消除pWA4质粒(图 2)。挑取卡那霉素平板上的克隆转接后，在无抗液体LB培养基40 ℃、200 r/min培养过夜，涂布于无抗性培养基平板上37 ℃培养过夜，挑选克隆转接卡那霉素培养基中，发现全部克隆无法生长，该结果证明pSK1仍然具有正常的温度敏感特性，但与pWA4共存时能够实现选择性丢失。

图 2　通过控制温度和抗性实现RK2ts型质粒选择性消除 Figure 2　RK2ts plasmids can be eliminated selectively by control of temperature and resistance

图选项

基于RK2^ts复制起始位点对pTarget质粒进行了改造。将pTarget质粒中的pMB1复制起始位点替换为RK2^ts复制起始位点。同时，为了提高多轮次整合的转化与筛选效率，分别构建了含有氨苄青霉素抗性基因的pTW-A及含有链霉素抗性基因的pTW-S。同时对pCas质粒进行改造，去除Ptrc-pMB1单元，获得pCas1质粒(图 3)。

图 3　pTW及pCas1质粒的构建 Figure 3　Construction of pTW plasmids and pCas1 plasmids

图选项

将特异性识别iclR位点的N20序列构建到pTW-A中获得质粒pTW-Ai。扩增两端含有iclR位点同源臂的枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶BspanD表达框的打靶片段(BspanD片段)。BP01为本实验室通过进化获得初级代谢途径改造的K-12菌株，以BP01菌株为基础，将pTW-Ai及BspanD片段电转化进入经阿拉伯糖诱导的BP01(pCas)菌中，在卡纳霉素+羧苄青霉素平板上30 ℃培养过夜，挑取10个单克隆进行鉴定。使用iclR-F100与BspanD-R500引物验证，阳性菌株大小应为600 bp。结果表明所有克隆均为阳性，BspanD基因片段的整合效率为100% (图 4)。取阳性克隆命名BP02用于下一步敲除。

图 4　菌落PCR验证iclR位点整合BspanD基因核酸电泳图 Figure 4　Agarose gel electrophoresis of colony PCR for inserting gene BspanD at the site of iclR 注：M：DNA marker；1-10：随机挑选的重组子. Note: M: DNA marker; 1-10: Randomly selected recombinants.

图选项

将特异性识别aspA位点的N20序列构建到pTW-S中获得质粒pTW-Sa。扩增带有同源臂的CPA1强启动子打靶片段(CPA1片段)。将上一轮获得的含有pCas和pTW-Ai质粒的BP02在仅含有卡那霉素的液体LB培养基中40 ℃培养6 h，以消除pTW-Ai质粒。然后转接30 ℃培养基中加入阿拉伯糖诱导物后继续培养OD₆₀₀为0.5后制备感受态细胞。电转化pTW-Sa及CPA1片段，在卡纳霉素+链霉素平板上30 ℃培养过夜。由于pTW-Sa和pTW-Ai具有相同的复制启始位点，根据质粒不相容性，理论上转入了pTW-Sa的菌株在链霉素筛选压力下，pTW-Ai不会共存，从而进一步确保了pTW-Ai的缺失。从平板上随机挑取10个单克隆进行鉴定，使用引物CPA1-F与aspA-R进行PCR验证，片段大小为2 000 bp，与预期相符，CPA1启动子片段的整合效率为100% (图 5)。同时PCR验证BspanD位点没有发生回复突变(图 6)。取阳性克隆命名BP03，42 ℃培养过夜后涂布无抗性平板，37 ℃培养过夜并挑取单菌落，抗性验证全部遗传操作用质粒已经丢失。

图 5　菌落PCR验证AspA启动子替换为CPA1核酸电泳图 Figure 5　Agarose gel electrophoresis of colony PCR for replacing the native promoter of gene AspA with CPA1 注：M: DNA marker；1-10：随机挑选的重组子. Note: M: DNA marker; 1-10: Randomly selected recombinants.

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图 6　菌落PCR验证10个重组子BspanD位点未回复突变 Figure 6　Agarose gel electrophoresis of colony PCR to identify BspanD site didn't occur reverse mutation in 10 recombinants 注：M：DNA marker；11-20：挑选的10个重组子. Note: M: DNA marker; 11-20: 10 Recombinants.

图选项

上述改造从以下几个方面提高大肠杆菌β-丙氨酸的合成水平：(1)大肠杆菌自身具有L-天冬氨酸脱羧酶PanDEc，但酶活较低，且PanDEc需要在蛋白PanZ的辅助下才能在常温下发生自剪切，得到有活性的π-蛋白。而来源于枯草芽孢杆菌的脱羧酶BspanD不需要任何辅助因子即可完成自剪切，比酶活约为PanDEc的8.6倍，反应速度快；(2)大肠杆菌的iclR为全局调控因子，它具有对乙醛酸循环的抑制作用，敲除后可解除乙醛酸循环抑制，由此增加TCA循环中四碳化合物的回补，通过第一次基因组编辑实现了(1)和(2)的改造；(3)在第2次基因组编辑过程中，进一步对前体L-Asp的合成路径进行强化。将基因aspA的自身启动子替换为组成型强启动子CPA1，可以强化AspA通过延胡索酸合成L-Asp的转氨反应，从而增加β-丙氨酸的前体供应。为了验证上述改造靶点的效果，对所获得菌株BP02及BP03的β-丙氨酸合成水平进行测试。结果表明，菌株BP02的β-丙氨酸成功得到积累，产量达到1.52 g/L；而BP03的β-丙氨酸的产量进一步由1.52 g/L提高至1.91 g/L，产量提高近25.66% (图 7)。

图 7　对BP01菌株进行2次连续基因组编辑改造提高β-丙氨酸产量 Figure 7　Two continuous genomic editing of BP01 strain to improve β-alanine production 注：BP01：实验室进化所得初级代谢改造菌株，无β-丙氨酸积累；BP02：菌株BP01染色体整合BspanD菌株；BP03：使用质粒pTW-S替换AspA启动子菌株. Note: BP01: Strain enhanced glycolytic pathway in our laboratory, has no β-alanine accumulation; BP02: Strain inserted gene BspanD on BP01; BP03: Strain replaced promoter of AspA with CPA1 on BP02.

图选项

通过以上研究，确定了以交替使用2种抗性标记的RK2^ts复制起始位点为基础，简化了质粒消除步骤的新型CRISPR连续基因组编辑策略。在这一策略中，原料以pMBI为复制起始位点的pTarget被pTW质粒取代。pTW质粒具有更强的温度敏感性，可以在保持pCas1的情况下快速消除，实现质粒消除与下一步整合同步(图 8)。每轮基因编辑的时间缩短至2-3 d，并省去单质粒整合策略中多片段连接的步骤。

图 8　利用pTW质粒4 d实现CRISPR两轮连续基因组编辑示意图 Figure 8　Methods for CRISPR continuous two-round genome editing using plasmid pTW within 4 days

图选项

在CRISPR介导的大肠杆菌基因组编辑过程中，需要Cas9蛋白、λ-Red重组酶、sgRNA的协同表达，并在含有同源臂的打靶片段存在的条件下才能实现。而为了实现下一轮次的基因组编辑，pTarget辅助质粒的消除步骤成为限制时间效率的关键环节。我们通过测试多种温度敏感型质粒，发现不同复制起始位点对温度敏感性能具有差异，RK2^ts型质粒温敏效果优于pSC101^ts质粒。利用这种差异我们对已有的CRISPR体系进行改造，将pTarget质粒改造为温敏性能更好的RK2^ts型温度敏感型质粒，同时构建2种抗性标记交替使用，利用与RK2^ts型质粒之间的温度敏感性差异，通过对温度及筛选标记的控制实现质粒的选择性消除。

在这一改造中，我们实现了质粒消除与下一步基因编辑同步进行，4 d内可完成2轮基因组编辑工作，基因编辑阳性率高达100%。虽然该方法的质粒数量仍为2个，但是却避免了构建多模块大质粒的繁琐步骤。此外，pTW-A/S质粒在发挥功能的同时，不需要额外进行质粒消除，而以Jiang等^[14]和Zhao等^[15]为代表的CRISPR方法中都需要确保pTarget完全消除后方可进行下一轮整合工作，极大地影响了连续整合效率。对于单质粒策略，虽然在质粒数量上有所减少，但是由于所有功能模块均集中在同一大质粒上，造成编辑效率的降低，因此在实际操作中为了取得更高的编辑效率，需要延长同源臂长度。因此，与其他改进策略相比，该方法在操作简易程度和实验周期时长等多方面均具有较大优势(表 3)。我们利用这一策略，对实验室菌株BP01进行快速连续整合获得了BP03，使得最终产量得到大幅提升。

综上所述，我们建立了一种新的高效、灵活、快速的CRISPR/Cas9介导的大肠杆菌基因组连续编辑策略，缩短了实验周期，为大肠杆菌基因编辑的研究和代谢工程菌株改造提供了有力的工具^[19-20]。