2021, Vol. 48
表1(Table 1)
YPS1/YPS2失活改进酿酒酵母An-α菌株β-葡萄糖苷酶分泌表达
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文章信息
- 郭敬涵, 陆海燕, 洪解放, 贾玉蝶, 邹少兰
- GUO Jinghan, LU Haiyan, HONG Jiefang, JIA Yudie, ZOU Shaolan
- YPS1/YPS2失活改进酿酒酵母An-α菌株β-葡萄糖苷酶分泌表达
- Improved β-glucosidase expressing in Saccharomyces cerevisiae An-α by YPS1/YPS2 gene inactivation
- 微生物学通报, 2021, 48(12): 4485-4495
- Microbiology China, 2021, 48(12): 4485-4495
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.210328
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文章历史
- 收稿日期: 2021-04-02
- 接受日期: 2021-05-17
- 网络首发日期: 2021-06-01
郭敬涵, 陆海燕, 洪解放, 贾玉蝶, 邹少兰. YPS1/YPS2失活改进酿酒酵母An-α菌株β-葡萄糖苷酶分泌表达[J]. 微生物学通报, 2021, 48(12): 4485-4495.
GUO Jinghan, LU Haiyan, HONG Jiefang, JIA Yudie, ZOU Shaolan. Improved β-glucosidase expressing in Saccharomyces cerevisiae An-α by YPS1/YPS2 gene inactivation[J]. Microbiology China, 2021, 48(12): 4485-4495.
YPS1/YPS2失活改进酿酒酵母An-α菌株β-葡萄糖苷酶分泌表达
1. 天津大学化工学院 天津 300085;
2. 天津大学石化中心 天津 300072
2. 天津大学石化中心 天津 300072
摘要: 【背景】 工业酵母菌株的蛋白质表达通常存在表达量低、分泌效率低的问题。【目的】 考察失活Yapsin蛋白酶Yps1p和Yps2p对β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母An-α菌株中表达的影响。【方法】 利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，首先构建得到未折叠蛋白响应(Unfolded Protein Response，UPR)指示菌株An-α(leu2:: UPRE-lacZ)即An-αL，然后分别失活其YPS1和YPS2基因，导入以YEplac195为载体的β-葡萄糖苷酶表达质粒(简称BG)，进行生长和酶活分析评价。【结果】 菌株An-αL的YPS1和YPS2基因失活对其在酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Extract Peptone Dextrose，YPD)培养基中的生长未造成明显的不利影响；导入质粒BG后将在酵母浸出粉胨纤维二糖(Yeast Extract Peptone Cellobiose，YPC)培养基中生长的最大OD600分别提高了21.9%和7.4%；最大总酶活值为0.087 5和0.068 6 U/(mL·OD600)，是对照菌株相应值的2.268倍和1.778倍；分泌比例提高了19.4 %和22.2%；β-葡萄糖苷酶表达水平与β-半乳糖苷酶酶活水平所代表的UPR信号响应值之间呈现良好的相关性。【结论】 YPS1和YPS2基因失活有助于改进酿酒酵母An-α菌株中β-葡萄糖苷酶的分泌表达。
关键词:
YPS1/YPS2基因失活 酿酒酵母An-α β-葡萄糖苷酶 分泌表达
Improved β-glucosidase expressing in Saccharomyces cerevisiae An-α by YPS1/YPS2 gene inactivation
1. College of Chemical Engineering, Tianjin University, Tianjin 300085, China;
2. Tianjin R & D Center for Petrochemical Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China
2. Tianjin R & D Center for Petrochemical Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China
Abstract: [Background] Low level expression and poor secretion efficiency are the common problems in the production of secretory recombinant proteins by industrial yeast. [Objective] To investigate the effect of inactivating yapsin proteases Yps1p and Yps2p on β-glucosidase expression in Saccharomyces cerevisiae An-α, a yeast strain isolated from Angel industrial yeasts. [Methods] By utilizing CRISPR/Cas9-based gene editing technology, we firstly constructed a UPR-indicator strain An-α(leu2:: UPRE-lacZ), designated as An-αL. Next, the YPS1 and YPS2 genes were inactivated, followed by transformation of the β-glucosidase-expressing plasmid BG that was constructed on the YEplac195 vector. The growth and enzymatic activities of the resultant strains were evaluated. [Results] Inactivation of the YPS1 or YPS2 gene of the strain An-αL did not affect the cell growth in YPD medium. The presence of the plasmid BG increased maximum OD600 values in the YPC medium by 21.9% and 7.4%, respectively. The maximum enzymatic activities were 0.087 5 and 0.068 6 U/(mL·OD600), which were 2.268 and 1.778 times of the control value, respectively. The ratio of the secreted protein was also increased by 19.4% and 22.2%, respectively. There was a good correlation between the β-glucosidase activity level and the UPR signal response value as represented by the β-galactosidase activity level. [Conclusion] Inactivation of YPS1 and YPS2 could improve the secretory β-glucosidase yield of the strain An-α.
Keywords:
YPS1/YPS2 gene inactivation Saccharomyces cerevisiae An-a ?glucosidase secretory expression
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是典型真核模式生物和最重要的真核微生物细胞工厂，被广泛用于生物学研究与工业生产[1-5]。其中最重要的生产应用，一是作为全细胞催化剂的内源或异源代谢物合成与生产，如乙醇、丁醇、乳酸、琥珀酸等[2-3]；二是医药蛋白和工业应用蛋白的异源分泌表达生产[4-5]。二者目标不同，决定了对酵母的性能要求、关键制约因素和实现的策略都彼此不同。前者通过代谢工程(Metabolic Engineering)和途径工程(Pathway Engineering)予以全局调控与优化，实现代谢物的高效经济生产[2-3]；后者则基于酵母细胞自身蛋白质质量控制(Protein Quality Control)系统调控规律，通过蛋白质分泌途径(Secretory Pathway)的全局调控与优化来实现[1, 6-8]。
β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)即β-D-葡萄糖苷水解酶(β-D-Glucoside hydrolase，EC 3.2.1.21)，是非常重要的工业用酶，具有多方面的应用价值：在医药领域，通过催化具有强有力生物学活性的糖苷配基单元的释放和生产，可用于抗肿瘤试剂的生产；在食品领域，能催化大豆中的抗癌成分——大豆异黄酮的转化；在化工领域，能催化醇和糖合成烷基糖苷；在能源领域，是纤维素转化为葡萄糖的关键酶之一[9]。鉴于β-葡萄糖苷酶的重要性，β-葡萄糖苷酶编码基因从多种微生物中被分离、鉴定出来，并被克隆和表达于不同的宿主，应用于不同的领域；其中，β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母中的表达和应用已经有大量报道[9-11]。
工业酵母菌株通常具有较实验室菌株更为突出的抗逆和生产性能，二者在抑制物和异源蛋白表达“蛋白质解折叠反应”响应和调控能力上也显示出巨大差异[12]。工业酵母菌株往往存在倍性和遗传背景不明、选择标记少等问题，其遗传改造可能面临意想不到的困难，需要付出更多的努力[13-14]。尽管β-葡萄糖苷酶在酵母中的异源表达已经有大量报道，但在工业酵母菌株中的生产和应用方面仍然会面临一些问题，如遗传操作技术手段限制、表达水平有限、分泌效率低等[9, 11, 15]。
Yapsin蛋白酶是一类天冬氨酸蛋白酶，由糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl Phosphatidylinositol，GPI)锚定，能特异性地切割底物中的单或双碱性氨基酸残基位点[16-17]。酿酒酵母中被发现存在5个Yapsin蛋白酶成员：Yps1p、Yps2p、Yps3p、Yps6p和Yps7p[18]，其中Yps1p最早于1990年被报道发现，当时命名为Yap3[19]。Yapsin蛋白酶被研究发现与工程菌表达某些外源蛋白时发生的降解现象有紧密关系，失活Yapsin蛋白酶可能会极大地降低外源蛋白的降解，从而显著提高外源蛋白表达量[20]。
我们课题组在对分离得到的酿酒酵母An-α单倍体菌株进行遗传改造的过程中发现，其表达纤维素酶的酶活水平和分泌比例都偏低，不能满足底物利用和蛋白生产需求[21]。为了解决此问题，本研究从Yapsin蛋白酶基因入手，首先失活其中起主要作用的YPS1和YPS2基因，考察对β-葡萄糖苷酶基因表达的影响。失活Yapsin蛋白酶改进蛋白质生产报道更多见于毕赤酵母宿主，用于酿酒酵母An-α菌株改造还未见报道，因此本工作将有助于推动对酿酒酵母的遗传改造和充分利用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、质粒和引物研究用到的菌株、质粒和引物分别见表 1、表 2。大肠杆菌DH5α用于质粒载体的构建和扩增；酿酒酵母菌株An-α基因型为MATα ura3，本实验室保存，本研究中用作亲本菌株。使用和构建得到的质粒见表 1，用到的引物见表 2。
表 1 实验所用菌株和质粒
Table 1 All strains and plasmids used in this study
| 菌株和质粒 Strains or plasmids |
特征 Characteristics |
来源 Sources |
| Strains | ||
| Escherichia coli DH5α | F-recA1 endA1 hsdR17 [rK-mK-] supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1 | Our lab |
| Saccharomyces cerevisiae | ||
| An-α | MATα ura 3, derived from Angel high-temperature-resisting alcoholic active dry yeast(TH AADY) | Our lab |
| AZ | An-a(leu2: : UPRE-lac Z) | Our lab[12] |
| An-α(YCplac33-Cas9) | Obtained by transforming plasmid YCplac33-Cas9 into strain An-α | This study |
| An-αL(YCplac33-Cas9) | An-α(leu2: : UPRE-lacZ)(YCplac33-Cas9) | This study |
| An-αL | An-α(leu2: : UPRE-lacZ) | This study |
| An-αL(yps1)(YCplac33-Cas9) | An-αL(Δyps1)(YCplac33-Cas9) | This study |
| An-αL(yps1) | This study | |
| An-αL(yps2)(YCplac33-Cas9) | An-αL(Δyps2)(YCplac33-Cas9) | This study |
| An-αL(yps2) | This study | |
| An-αL (YE) | Obtained by transforming plasmid YEplac195 into strain An-α | This study |
| An-αL (BG) | Obtained by transforming plasmid BG into strain An-α | This study |
| An-αL(yps1)(BG) | Obtained by transforming plasmid BG into strain An-αL(yps1) | This study |
| An-αL(yps2)(BG) | Obtained by transforming plasmid BG into strain An-αL(yps2) | This study |
| Plasmids | ||
| YCplac33-Cas9 | Ampr, URA 3, Cas 9, 5603 bp | Our lab[22] |
| pRS42H-gRNA | Ampr, hphNT1, crRNA | Our lab[22] |
| pRS42H-gLEU2 | Ampr, hph NT1, crRNA, 20 bp guide for LEU 2 gene | Our lab[12] |
| BG | YEplac195- Ptpi-xyn2s-Aa BGL1-TadhI, β- glucosidase expressing vector | Our lab[23] |
| pRS42H-gYPS1 | Replacing Not I site in pRS42H-gRNA by 20 bp gRNA sequence targeting YPS1 loci | This study |
| pRS42H-gYPS2 | Replacing Not I site in pRS42H-gRNA by 20 bp gRNA sequence targeting YPS2 loci | This study |
表 2 实验所用引物
Table 2 All the primers used in this study
| 引物名称 Primers name |
序列 Sequences (5ʹ→3ʹ) |
目的 Purpose |
产物长度 Size of product (bp) |
| P1 | CACAATTTGCTAAAGGTACT | To amplify donor DNA | 3 721 |
| P2 | CTTGTGATTCTTTGCACTTC | ||
| P3 | TGACCAAGTTCGTAAATCTA | To identify integrated strain An-α(leu2:: UPRE-lacZ) | 795 (control strain) |
| P4 | CCATCTCCACAATAGGCATA | 4 327 (indicator strain) | |
| P5 | CTATTCGGTGGACTTGGAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC | To amplify 20 bp guide RNA (underlined) for plasmid pRS42H-gYPS1 construction | |
| P6 | CTTCCAAGTCCACCGAATAGGATCATTTATCTTTCACTGC | ||
| P7 | CTTAGGAGGCGGTTCAGGTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC | To amplify 20 bp guide RNA (underlined) for plasmid pRS42H-gYPS2 construction | |
| P8 | TACCTGAACCGCCTCCTAAGGATCATTTATCTTTCACTGC | ||
| P9 | GGCTGACGGTTATGAAGAAA | To amplify the left homologous arm in donor DNA for YPS1 inactivation and the product PCR1 | 75 |
| P10 | TCTGTGGTGGCTTCCAAGTCCACCGAAT | ||
| P11 | GACTTGGAAGCCACCACAGAACGTAACG | To amplify the right homologous arm in donor DNA for YPS1 inactivation and the product PCR2 | 77 |
| P12 | TATCCGAGCCCATAATCCAT | ||
| P13 | TCGGTGGAATTAGATATTGG | To amplify the left homologous arm in donor DNA for YPS2 inactivation and the product PCR3 | 82 |
| P14 | GTCTGAACCCTAGATCAGAAGAACCAGT | ||
| P15 | TTCTGATCTAGGGTTCAGACAACCCATA | To amplify the right homologous arm in donor DNA for YPS2 inactivation and the product PCR4 | 70 |
| P16 | TTAAAGGATGAGCCAGTGGT | ||
| P17 | GGTTCTCGGTAAGATAATAC | To identify recombinant yps1 strain | 352 |
| P18 | CGCTTGACGAATCATCAC | ||
| P19 | TCAGAAGAAATACGGCAGTT | To identify recombinant yps2 strain | 421 |
| P20 | GAATGTAGACGACTTAGAGG |
鲑鱼精DNA、LiAC和PEG4000，Sigma公司；内切酶、DNA Marker等，生工生物工程(上海)股份有限公司和大连TaKaRa公司；琼脂糖凝胶片段回收试剂盒以及质粒抽提试剂盒，Omega公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase和无缝重组试剂盒，诺唯赞公司；引物合成及序列测定由上海金唯智公司完成。PCR仪，Biometra公司；Waters Alliance 2695高效液相色谱仪，Waters公司；电泳仪，Bio-Rad公司。
1.2 培养基及培养条件LB培养基(g/L)：酵母抽提物5.0，胰化蛋白胨10.0，NaCl 10.0。固体培养基另添加琼脂粉15 g/L，pH 7.0。大肠杆菌的培养用LB培养基，固体培养时用37 ℃培养箱，液体培养条件是37 ℃、220 r/min，转化子筛选时添加氨苄青霉素至终浓度100 mg/L (简称为LB+Amp 100平板)。
YPD培养基、CMG完全基本培养基、筛选用培养基CMG-URA、CMG-URA+潮霉素B (HyB)和反选用5ʹ-乳清酸(简称5ʹ-FOA)平板的配制参见文献[12, 22]；YPC培养基的碳源为纤维二糖，其余同YPD。这些培养基用于酵母的培养，固体培养时用30 ℃培养箱，液体培养条件是30 ℃、220 r/min。
1.3 质粒构建使用表 2中的引物对P5/P6和P7/P8，以pRS42H-gRNA (表 1)为出发材料分别构建得到pRS42H-gYPS1和pRS42H-gYPS2 (表 1)的流程参见文献[20]方法。预期PCR片段大小均为6 528 bp。
1.4 Donor DNA合成用于菌株An-α(leu2:: UPRE-lacZ)构建的Donor DNA片段合成方法为：以表 1中菌株AZ的染色体为模板，以表 2中的引物P1、P2进行PCR扩增。
用于基因YPS1和YPS2敲除失活的Donor DNA片段合成方法为：采用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR反应。所有PCR反应体系里的引物终浓度均为0.2 μmol/L，其余组分参见说明书。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，(52-56) ℃ 30 s，72 ℃ 1-5 min，30次循环；72 ℃ 10 min。
第1次PCR全部以表 1中菌株AZ的染色体为模板，对基因YPS1，使用表 2中引物P9、P10扩增左同源臂(PCR1)，使用引物P11、P12扩增右同源臂(PCR2)；对基因YPS2，使用引物P13、P14扩增左同源臂(PCR3)，使用引物P15、P16扩增右同源臂(PCR4)。第2次PCR分别以上述PCR产物为模板进行交叉重叠延伸PCR：对基因YPS1，使用模板PCR1+PCR2和引物P9、P12扩增Donor DNA片段；对基因YPS2，使用模板PCR3+PCR4和引物P13、P16扩增Donor DNA片段。引物序列及产物长度见表 2。
1.5 酵母感受态细胞制备和质粒转化用文献[24]中的醋酸锂方法制备感受态细胞并进行转化；利用CRISPR-Cas9方法构建外源基因整合菌株或内源基因失活菌株时，参照文献[12, 22]进行转化、筛选和鉴定。转化子菌株的PCR鉴定使用的引物对及预期产物大小见表 2。
1.6 菌株生长和酶活评价挑取YPD平板上新鲜生长的酵母菌落，接入装有YPD培养液的试管中，30℃、220 r/min培养过夜，转接进行二次液体培养，所得菌液为种子液，接种到装有50 mL YPD培养液的250 mL摇瓶中，控制起始OD600约为0.2，30 ℃、220 r/min培养，每8 h定期取样测定OD600值，绘制生长曲线。
当碳源为纤维二糖时，试管种子液改为CMG–URA培养基培养，而摇瓶培养基改为YPC培养，分别于0、8、16、24、38、48、62、72 h取样测定OD600值和酶活，其余同上。
β-葡萄糖苷酶酶活测定参见文献[23]，β-半乳糖苷酶酶活测定参见文献[12]。
测定均至少设2次重复，数据处理时计算平均值和SD值。
1.7 SDS-PAGE分析取3 mL培养液到离心管中，12 000 r/min离心2 min收集上清液，加入4倍体积的无水酒精充分振荡混匀，12 000 r/min离心5 min去上清液，室温晾干沉淀，用50 µL无菌水溶解即得蛋白质样品。使用考马斯亮蓝G-250方法进行蛋白质定量，制备SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质电泳[25]。
2 结果与分析未折叠蛋白响应(Unfolded Protein Response，UPR)是酵母最重要的蛋白质质量控制机制之一，为了方便同时检测菌株对外源基因表达及对酸、醇等不利影响因素的UPR响应情况，参考文献[12]的方法：首先构建UPR响应指示菌株An-α(leu2: : UPRE-lacZ)，在此基础上敲除基因YPS1和YPS2，导入β-葡萄糖苷酶基因表达载体，进行生长及表达评价。
2.1 菌株An-α(leu2: : UPRE-lacZ)构建按本实验室建立的操作流程[23]，利用CRISPR-Cas9系统进行的菌株构建涉及三要素：(1) Cas9蛋白表达菌株An-α(YCplac33-Cas9)及其构建：制备An-α感受态细胞，用质粒YCplac33-Cas9进行转化得到；(2) gRNA表达载体pRS42H-gLEU2：实验室已有材料(表 1)[12]；(3) Donor DNA及其合成：参照文献[12]，以表 1中菌株AZ的染色体为模板，使用表 2中的引物P1、P2扩增Donor DNA片段，制备得到足量3 721 bp的PCR产物。
制备菌株An-α(YCplac33-Cas9)感受态细胞，将上述质粒pRS42H-gLEU2和Donor DNA片段共转化，涂布CMG–URA+潮霉素筛选平板；对筛选平板上生长的菌落顺次进行CMG-URA+HyB平板复筛、菌落PCR鉴定及测序。PCR鉴定所用引物为表 2中的P3、P4，阳性转化子菌株和阴性对照菌株预期PCR片段分别为4 327 bp和795 bp。提交4.3 kb左右大小PCR产物进行测序，测序结果证明未突变。按文献[23]方法彻底丢失所得阳性转化子菌株中的质粒，筛选和鉴定得到指示菌株An-α(leu2:: UPRE- lacZ)，为叙述方便，以下将此菌株简称为An-αL。
2.2 菌株An-αL(yps1)和An-αL(yps2)构建和生长初步评价基因YPS1和YPS2失活菌株的构建分3个步骤，然后进行YPD培养基上的生长评价。
2.2.1 pRS42H-gYPS1和pRS42H-gYPS2质粒构建主要按文献[26] Guide RNA设计原则，设计了靶向YPS1基因位点的供Guide RNA合成的DNA序列：5ʹ-CTATTCGGTGGACTTGGAAG-3ʹ (参见表 2中的引物对P5/P6)，其对应于YPS1基因ORF的第246-265位碱基序列；设计了靶向YPS2基因位点的供Guide RNA合成的DNA序列如下：5ʹ-ACACTGGTTCTTCTGATCTA-3ʹ (参见表 2中的引物对P7/P8)，其对应于YPS2基因ORF的第296-315位碱基序列。
以限制性内切酶Not I酶切线性化的pRS42H-gRNA片段为模板，分别利用引物对P5/P6和P7/P8进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果见图 1。由图 1可知，PCR产物符合6 528 bp的预期大小。构建所得质粒的测序结果进一步证明发生了预期的变化，确认获得了目的质粒pRS42H-gYPS1和pRS42H-gYPS2。
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| 图 1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 Figure 1 Examination of PCR products by agarose gel electrophoresis |
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对Donor DNA合成所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图 2。条带大小与预期相符，证明为目的Donor DNA。
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| 图 2 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 Figure 2 Examination of PCR products by agarose gel electrophoresis 注：A：基因YPS1；B：基因YPS2。1：左同源臂片段；2：右同源臂片段；3：Donor DNA。M：50 bp DNA Ladder Marker Note: A: The YPS1 gene; B: The YPS2 gene. 1: Left homologous arm in donor DNA for YPS2 inactivation; 2: Right homologous arm in donor DNA for YPS2 inactivation; 3: Donor DNA for YPS2 inactivation. M: 50 bp DNA Ladder Marker |
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制备菌株An-αL(YCplac33-Cas9)感受态细胞，分别将质粒pRS42H-gYPS1、pRS42H-gYPS2和各自的Donor DNA片段共转化此感受态细胞，涂布CMG-URA+HyB 300筛选平板，30 ℃培养3 d。对筛选平板上生长的菌落进行菌体PCR鉴定及PCR产物测序，鉴定引物对分别为YPS1-鉴-U/YPS1- 鉴-D和YPS2-鉴-U/YPS2-鉴-D，对应PCR产物大小分别为352 bp和421 bp。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图 3，条带大小与预期相符，证明为目的产物。
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| 图 3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 Figure 3 Examination of PCR products by agarose gel electrophoresis Note: A: The YPS1 gene: 1-4: PCR products for YPS1 transformants, 352 bp; B: The YPS2 gene: 1-4: PCR products for YPS2 transformants, 421 bp. M: DNA Marker |
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分别挑选3个转化子鉴定PCR产物送测序公司测序，测序结果表明转化子染色体都发生了预期变化，即分别实现了YPS1、YPS2基因ORF的第266-273位和第296-315位各8 bp碱基序列的缺失，造成移码突变使YPS1基因和YPS2基因失活。
将测序证明正确的转化子经过2次YPD液体培养和5ʹ-FOA平板反选，确认质粒彻底丢失后即获得YPS1失活菌株An-αL(yps1)和YPS2失活菌株An-αL(yps2)。
2.2.4 YPS1和YPS2失活菌株的生长初步评价对亲本菌株An-αL和失活菌株An-αL(yps1)、An-αL(yps2)进行了丰富培养基YPD中的生长对比评价，结果见图 4。结果显示二者生长无明显差异，初步说明基因失活及全程操作对在YPD培养基中的生长未造成明显的不利影响。
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| 图 4 重组菌株在YPD培养基(2%葡萄糖)中的生长曲线 Figure 4 Growth curves of the recombinant strains in the YPD medium containing 2% glucose |
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BG是质粒YEplac195-Ptpi-xyn2s-Aa BGL1-TadhI[23]的简称。用BG分别转化菌株An-αL(yps1)和菌株An-αL(yps2)的感受态细胞，用CMG–URA平板筛选，所得转化子菌株分别命名为An-αL(yps1)(BG)和An-αL(yps2)(BG)。
2.3.2 菌株An-αL(yps1)(BG)和An-αL(yps2)(BG)的生长与酶活分析评价纤维二糖是β-葡萄糖苷酶的作用底物，以纤维二糖为唯一碳源生长时，生长的快慢和强弱受β-葡萄糖苷酶表达的制约，因此，首先选择含2%纤维二糖培养基YPC在好氧条件下的生长及酶活情况，对比考察基因YPS1和YPS2失活的影响。结果见图 5-8和表 3。这些结果非常清楚地说明了基因YPS1和YPS2失活对β-葡萄糖苷酶表达有非常显著的影响，而且基因YPS1的效果远较基因YPS2突出，表现为：(1)生长：与对照菌株An-αL(BG)相比，YPS1和YPS2失活菌株生长加快，进入稳定期的时间提前(图 5)；最大OD600值分别提高了21.9%和7.4% (图 5和表 3)；(2) 总酶活：菌株An-αL(yps1) (BG)和An-αL(yps2)(BG)培养物总酶活随培养时间呈现出规律性的变化，38 h时分别达到最大值0.087 5 U/(mL·OD600)和0.068 6 U/(mL·OD600)，是对照菌株相应值[0.038 6 U/(mL·OD600)]的2.268倍和1.778倍(图 6和表 3)；(3) 分泌比例：菌株An-αL(yps1)(BG)和An-αL(yps2)(BG)培养物分泌比例较对照菌株培养物提高，其中38 h时的数值较对照分别提高了19.4%和22.2% (图 7和表 3)；(4) 对照菌株An-αL(YE)在YPC培养基中呈现了微弱的生长，因为利用纤维二糖以外组分所致(图 5)，未检测到β-葡萄糖苷酶酶活。
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| 图 5 重组菌株在YPC培养基(2%纤维二糖)中的生长曲线 Figure 5 Growth curves of the recombinant strains in the YPC medium containing 2% cellobiose |
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| 图 6 不同培养时间β-葡萄糖苷酶的酶活 Figure 6 The β-glucosidase activities at indicated culture time points |
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| 图 7 上清液β-葡萄糖苷酶的酶活比例 Figure 7 Ratio of the β-glucosidase activity in the supernatant |
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| 图 8 β-半乳糖苷酶的酶活(48 h) Figure 8 The β-galactosidase activity (at 48 h) |
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表 3 重组菌株在YPC培养基(2%纤维二糖)中的生长与酶活比较
Table 3 The growth of recombinant strains in YPC medium (2% cellobiose)
| 菌株 Strains |
最大OD600 OD600 maximum |
38 h酶活比值 38 h β-glucosidase activity ratio |
38 h分泌比例比值 38 h secretory ratio |
| An-αL(YE) | 1.89 | - | - |
| An-αL(BG) | 13.50 | 1.000 | 1.000 |
| An-αL (yps1)(BG) | 16.45 | 2.268 | 1.194 |
| An-αL (yps2)(BG) | 14.50 | 1.778 | 1.222 |
| Note: -: Activity not detected | |||
以上数据的综合分析表明：β-葡萄糖苷酶表达水平决定了菌株对底物纤维二糖的利用能力，结果显示了二者良好的相关性；而图 8结果则显示了β-葡萄糖苷酶表达水平与β-半乳糖苷酶酶活水平所代表的UPR信号响应值之间良好的相关性。
2.3.3 上清液蛋白质的SDS-PAGE分析比较对上述YPC中培养38 h的发酵液进行上清液中蛋白质的SDS-PAGE电泳分析，结果见图 9。图 9显示基因YPS1和YPS2失活后胞外蛋白质带型发生了明显变化：菌株An-αL(BG)的典型条带为条带2、4和5 (对应图 9中条带2、4、5)，而菌株An-αL(yps1)(BG)和An-αL(yps2)(BG)则为条带1和3。本研究使用的β-葡萄糖苷酶编码基因来自棘孢曲霉，棘孢曲霉自身生产的β-葡萄糖苷酶经SDS-PAGE电泳分析其分子量为93 kD[27]；而在酿酒酵母中分泌表达外源基因时则发现存在严重的糖基化现象，会导致胞外蛋白质分子量发生很大变化[28]。这里推测条带1和条带2为被糖基化的β-葡萄糖苷酶，基因YPS1和YPS2失活使得β-葡萄糖苷酶表达量相比对照菌株An-αL(BG)明显上升，与上述生长与酶活结果一致。初步证明β-葡萄糖苷酶表达后确实存在降解，此降解与Yps1p、Yps2p相关。
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| 图 9 上清液SDS-PAGE分析 Figure 9 Analyses of the the supernatant by SDS-PAGE Note: M: Protein Marker |
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Davison等报道酿酒酵母不同菌株的胞外蛋白质生产容量差异显著，菌株选择是确保重组酶最大生产量至关重要的因素[29]，也有其他研究结果观察到了这个差异显著的现象[10, 12, 23]。在我们的前期工作中，表 1中质粒BG在酿酒酵母实验室菌株W303-1A(MATa or MATɑ leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15)中表达所达到的最大总酶活值为5.75 U/mL[23]；当BG引入到菌株An-α中时酶活值很低，对照菌株38 h酶活值0.038 6 U/(mL·OD600)对应比酶活值为0.339 7 U/mL，远远低于宿主W303-1A中的表达水平。菌株表达差异的影响因素极为复杂[1, 5-8, 10-12, 29]，本研究从蛋白酶途径进行改造来提高其在菌株An-α中的表达水平。
酿酒酵母的Yapsin蛋白酶Yps1p、Yps2p被证明与蛋白质质量控制机制相关，都在过量或错误折叠蛋白质的处理过程中起作用；Yps1p被内质网压力诱导激活而表达，Yps12p则为非压力状态下的组成型表达，其表达就足以处理基础水平的过量或错误折叠蛋白质[30]。很多研究发现Yapsin蛋白酶对异源蛋白质表达存在负效应，特别是Yps1p更导致重组蛋白质的降解[16-17, 30]。本研究以高拷贝数质粒为载体表达β-葡萄糖苷酶基因，Yps1p失活对β-葡萄糖苷酶表达水平和分泌比例的影响比Yps2p失活的影响显著得多，正好证明β-葡萄糖苷酶基因过量表达导致了高的UPR压力，而且Yps1p在此压力应激反应中起主导作用。
Yapsin蛋白酶的降解作用与蛋白质底物中的特异性酶切位点有关，因此，重组蛋白被降解的程度和Yapsin蛋白酶被失活后重组蛋白表达改进的程度视重组蛋白序列不同而有相当大的差异[16-17, 20, 30]。本研究中的β-葡萄糖苷酶共842个氨基酸，推测第820位和第821位连续2个碱性氨基酸赖氨酸是Yps1p、Yps2p的作用位点。图 9初步证明了β-葡萄糖苷酶的降解确实存在，但降解位点和被降解的小分子产物还需要进一步鉴定。
除了降解过量或错误折叠蛋白质、参与蛋白质质量控制外，Yapsin蛋白酶在保持细胞完整性方面也起着重要作用，不同的Yapsin缺陷突变株对直接作用于细胞壁的不同药物的敏感性不同。本研究中，Yps1p、Yps2p的失活显著改进了β-葡萄糖苷酶的分泌表达；但另一方面，菌株本身的抗逆性和生产性能是否因为Yps1p、Yps2p参与的其他功能的丧失而受到影响，还需要进一步的考察。
与此同时，虽然失活基因YPS1和YPS2显著提高了β-葡萄糖苷酶的酶活水平，但最大总酶活值为0.087 5 U/(mL·OD600)和0.068 6 U/(mL·OD600)对应值1.115 6、0.840 4 U/mL仍然明显低于W303-1A中的表达水平[23]，提示要进一步改进菌株An-α中的胞外表达，还需要分析和改造蛋白质分泌途径和调控机制中的其他关键制约因素[1, 5-8, 10-12, 29]。
综上所述，YPS1和YPS2基因失活本身对菌株在YPD培养基中的生长未造成明显的不利影响，导入高拷贝β-葡萄糖苷酶表达质粒BG后，YPS1和YPS2基因失活促进了所得菌株在YPC培养基中的生长，最大OD600分别提高21.9%和7.4%；提高了总酶活，最大酶活值为0.087 5、0.068 6 U/(mL·OD600)，分别是对照菌株相应值的2.268倍和1.778倍；分泌比例提高了19.4%和22.2%；同时β-葡萄糖苷酶表达水平与β-半乳糖苷酶酶活水平所代表的UPR信号响应值之间呈现良好的相关性。简而言之，YPS1和YPS2基因失活有助于改进酿酒酵母An-α菌株中β-葡萄糖苷酶的分泌表达。
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