乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类可通过发酵碳水化合物产生乳酸，但不产孢子的革兰氏阳性细菌的统称。由于乳酸菌在食品安全性能上具有独特的优势，被广泛应用于食品、饲料、医药、精细化工等行业中^[1]。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一类可在多种环境下生存的乳酸菌，广泛存在于各类发酵食品中；其还是正常人体肠道的定殖菌群，具有维持肠道微生态平衡、促进营养物质吸收、提高机体免疫力等多种功能^[2]。基于上述特点，在食品发酵、工业生产以及医疗保健等领域，植物乳杆菌都有着广泛的应用。通常植物乳杆菌在食品发酵和保鲜过程中会遇到盐胁迫、酸胁迫、高温低温胁迫等不良环境^[3]，因此，乳杆菌在不良环境中存活、生长、代谢的能力对于工业生产至关重要。

环二腺苷酸(Cyclic Diadenosine Monophosphate，c-di-AMP)是一种细菌第二信使分子，由2分子ATP或者2分子ADP经含有环化酶(Diadenylate Cyclase，DAC)活性结构域的蛋白催化形成的一种环状分子。具有催化活性的DAC结构域首先发现于枯草芽孢杆菌的c-di-AMP合成酶DisA中，同时研究发现该结构域中均存在RHR (Arg-His-Arg)和DGA (Asp-Gly-Ala) 2个氨基酸保守基序^[4]。随后，在许多细菌和古细菌中均发现了含有DAC结构域的蛋白；目前该蛋白主要有DisA、CdaS、CdaM和DacA这4类，其中包含一个DAC结构域和一个跨膜区的DacA (也称CdaA)，广泛分布于多种细菌中，如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓隐秘杆菌和单增李斯特菌等^[5]。现已发现c-di-AMP与枯草芽孢杆菌的耐酸^[6]、金黄色葡萄球菌对低磷酸盐环境的耐受^[7]、化脓链球菌的高盐耐受^[8]等抗胁迫能力密切相关。本研究以从侗族传统酸肉与腌鱼中分离获得的植物乳杆菌-YRA7^[9]作为研究对象，首次对植物乳杆菌中的c-di-AMP及其合成酶基因进行研究，以期为进一步深入探讨c-di-AMP在植物乳杆菌中发挥的生物学功能及其与植物乳杆菌抗胁迫能力的关系奠定基础。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

植物乳杆菌-YRA7分离自侗族传统酸肉^[9]，实验室保存；大肠埃希氏菌DH5α、BL21(DE3)，实验室制备保存；原核表达载体pET-28a，Novagen公司；γ-linked ATP-Sepharose，Innova Biosciences公司；MRS培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；Taq DNA聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司；DNA高保真聚合酶Trans Taq^® High Fidelity (HiFi) PCR SuperMix I、DNA分子量标准，北京全式金生物技术有限公司；质粒小提中量试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；蛋白质低分子量标准、BamH I/EcoR I限制性内切酶、T4连接酶，Thermo Fisher Scientific公司；IPTG、PAGE电泳相关试剂，生工生物工程(上海)股份有限公司；ATP、c-di-AMP标准品，Biolog公司。

PCR仪，Applied Biosystems公司；凝胶成像仪，上海复日科技仪器有限公司；高压细胞破碎仪，ATS Engineering公司；250 mm×4.5 mm RPC-18 Column色谱分析柱，Kromasil公司。

1.2 方法

1.2.1 植物乳杆菌c-di-AMP分子的检测

(1) 植物乳杆菌细胞提取物的制备

提取过程参照文献[10]进行，略有改动，具体如下：挑取植物乳杆菌-YRA7单菌落接种于5 mL MRS液体培养基37 ℃、120 r/min培养过夜，次日1:100接种于500 mL新鲜MRS培养基，37 ℃振荡培养至对数生长期，将菌液4 ℃、9 000×g离心5 min，收集上清。20 mL抽提液重悬菌体，置于液氮中作用15 s。然后100 ℃水浴锅作用10 min，4 ℃冷却30 min。设定细胞破碎机压强为1 500 bar，重悬液4 ℃于细胞破碎机中作用3次，所得溶液于10 000×g离心30 min收集上清。上清经45 ℃旋转真空干燥后，用500 μL去离子水溶解样品，再经0.22 μm滤器过滤后，样品于-80 ℃保存备用。

(2) c-di-AMP分子的鉴定

参照文献[11]对上述样品进行反向高效液相色谱分析，设置检测条件为：进样量为20 μL，以100%至50%流动相A (10 mmol/L质谱纯级乙酸铵溶液，调整pH值为5.5)梯度洗脱20 min (流动相B相溶液为甲醇)。设置流速0.7 mL/min、柱温25 ℃、吸收波长254 nm。根据c-di-AMP标准品的出峰时间，对提取物中是否含有c-di-AMP进行初步判断。

根据出峰时间对样品中的疑似检测波峰进行收集，收集样品经真空干燥后溶于100 μL去离子水，然后进行质谱分析。质谱仪参数设定为：电离模式：电喷雾离子源，负离子模式；毛细管电压2.8 kV；离子源温度100 ℃；雾化气温度350 ℃；雾化气流量600.0 L/h；碰撞电压4.0 eV；扫描时间：0.500 s；扫描范围：100-1 000 m/z；在线校正：200 ng/mL亮氨酸脑啡肽(556.277 1 m/z)。

1.2.2 植物乳杆菌c-di-AMP合成基因的生物信息学分析

(1) 植物乳杆菌c-di-AMP合成酶基因的克隆

以植物乳杆菌标准株ATCC 14917基因组数据(GenBank登录号AZEJ01000008.1)为参考，通过“Diadenylate Cyclase/c-di-AMP Synthetase”关键词检索出潜在的c-di-AMP合成酶蛋白编码基因(Protein_id：FC76_GL002863)，并以其核酸序列为参照，设计包含完整阅读框的引物对DacA-F (5′-A TGATTTTCATGAGGAGGAGA-3′)和DacA-R (5′-T CATTTTCGGGGACCTCCTC-3′)。采用Trans Taq^® High Fidelity (HiFi) PCR SuperMix I进行PCR扩增，PCR反应体系(50 µL)：上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 µL，基因组DNA 2.0 µL，2×PCR SuperMix 25 µL，ddH₂O补齐至50 µL。PCR反应设置退火温度为58 ℃，其余条件参照产品使用说明书共进行35个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。

(2) 植物乳杆菌c-di-AMP合成基因的序列分析

根据测序结果，采用在线软件Clustal Omega对植物乳杆菌c-di-AMP合成酶基因进行同源比对分析，结果用ESPript 3.0在线工具进行处理。利用NCBI保守性结构域检索工具(NCBI Conserved Domain Search)对c-di-AMP合成酶的功能结构域进行分析。

1.2.3 植物乳杆菌c-di-AMP合成酶基因胞内功能域的表达与纯化

(1) c-di-AMP合成酶基因胞内功能域序列的扩增

c-di-AMP合成酶lpDacA胞内功能域部分(95-280 aa)的扩增以1.2.2纯化产物为模板，设计引物对lpDacA in-F (5′-CGGGATCCGGGCGTGGCT CCATGTTTGCG-3′，划线部分为BamH I酶切位点)和lpDacA in-R (5′-CGGAATTCTCATTTTCGGGGA CCTCCTCC-3′，划线部分为EcoR I酶切位点)。

PCR反应体系(50 µL)：上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 µL，5×FastPfu Buffer 10 µL，dNTPs (2.5 mmol/L) 5 µL，基因组DNA 2.0 µL，RNase-Free ddH₂O 30 µL，FastPfu DNA Polymerase (2.5 U/µL) 1 µL。PCR反应设置退火温度为58 ℃，其余条件参照产品使用说明共进行35个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段。

(2) 表达载体的构建

原核表达载体pET-28a及PCR扩增产物用BamH I/EcoR I进行双酶切，纯化后进行连接反应，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，37 ℃倒置培养12-16 h直至出现菌落。

挑取单克隆分别接种于5 mL含30 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜并参照质粒提取试剂盒说明提取质粒。对经双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。

(3) 重组蛋白的诱导表达

将构建成功的重组质粒以转化大肠杆菌DH5α的相同条件转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，同时转化空质粒作为阴性对照。分别挑取单菌落于5 mL含30 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃孵育过夜。次日按体积比1:100转接于200 mL含30 µg/mL的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L。37 ℃继续诱导培养6 h后12 000×g离心10 min，弃上清，沉淀用PBS重悬后进行SDS-PAGE电泳分析。

(4) 重组蛋白的纯化

将保存的阳性克隆接种于含30 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、160 r/min振荡过夜，取10 mL菌液接种于1 L含30 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L。继续以优化后的条件，即27 ℃、180 r/min振荡培养5 h后，培养液于4 ℃、6 000×g离心10 min，弃上清。菌体沉淀用PBS (pH 7.4)清洗3遍后，再加入30 mL含20 mmol/L咪唑的Binding Buffer重悬菌体。重悬液冰浴并于细胞超声破碎仪中200 W超声(工作5 s，间隔5 s) 20 min，然后4 ℃、12 000×g离心20 min，取上清并用0.22 µm滤器过滤后备用。

参照HisTrap HP纯化柱使用说明对重组蛋白进行纯化，具体步骤如下：首先用5倍柱体积的去离子水清洗纯化柱，然后以1 mL/min的流速，用10倍柱体积的含20 mmol/L咪唑的上样缓冲液平衡纯化柱。样品以0.5 mL/min的流速于4 ℃进行上样后，再用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，并收集洗脱液。根据目的蛋白的分子量，采用10 kD规格超滤离心管对纯化蛋白进行脱盐以及浓缩，浓缩后的蛋白采用Bradford法进行浓度测定。

1.2.4 重组蛋白体外活性检测

重组蛋白体外活性检测采用50 µL反应体系，合成酶反应缓冲液^[12][40 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，10 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L NaCl，100 µmol/L ATP]中加入2 μmol/L重组蛋白，37 ℃反应1 h后，置于沸水5 min终止反应。12 000×g离心5 min，取上清20 µL，以ATP与c-di-AMP的标准品为对照，参照1.2.1中方法进行HPLC检测。

1.2.5 pH值对重组蛋白活性的影响

参照Bai等^[13]的方法，在1.2.4方法基础上，调整反应体系的pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0对重组蛋白进行体外活性检测。设定生成c-di-AMP最高量pH下的活性为100%，其他pH值下c-di-AMP的生成量与最高值进行比较，得到相对的活性值。

1.2.6 金属离子对重组蛋白活性的影响

参照Bai等^[13]的方法，在获得的最适pH条件下，将反应缓冲液中的Mg²⁺分别更换为Mn²⁺、Co²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺和Fe²⁺，然后对重组蛋白进行体外活性检测。参照1.2.5的计算方法，设定生成c-di-AMP最高生成量时重组蛋白的活性为100%，其他金属离子存在条件下的生成量与该值进行比较，得到相对的活性值。

1.2.7 RHR基序对重组蛋白活性的影响

(1) RHR基序的突变

参照Du等^[12]的方法，针对RHR基序设计引物对rhr-MF (5′-TTCCTAAAGAGTTAGGAACTCGGCACCGTGCCGCGGTCGGAATCAGTGA-3′)和rhr-MR (5′-TCACTGATTCCGACCGCGGCACGGTGCCGAGTTCCTAACTCTTTAGGAA-3′)。结合引物对lpDacA in-F/lpDacA in-R，采用重叠延伸PCR技术，将RHR基序突变为AAA (引物下划线部分)，并以相同条件对所得产物进行表达纯化以及体外活性检测。

(2) RHR基序对合成酶与ATP结合的影响

分别取纯化的RHR突变前和突变后的重组蛋白30 µg，加入含50 µL γ-Linked ATP-Sepharose的反应缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl)混合均匀，4 ℃反应2 h，用反应缓冲液清洗5遍后加入20 µL上样缓冲液，沸水中作用5 min，12 000×g离心2 min后取上清，通过SDS-PAGE电泳检测各重组蛋白与ATP的结合情况。

2 结果与分析 2.1 植物乳杆菌c-di-AMP分子的检测

以c-di-AMP为标准品，对植物乳杆菌细胞提取物进行HPLC检测。结果显示植物乳杆菌细胞提取物在与c-di-AMP标准品相同出峰时间处出现了一个色谱峰(图 1A)。根据出峰时间对该波峰处的组分进行收集纯化，经ESI-MS质谱检测发现，检测物与c-di-AMP标准品具有相同的分子片段(图 1B、1C)，表明植物乳杆菌细胞中含有c-di-AMP。

2.2 植物乳杆菌c-di-AMP合成酶基因的克隆以及生物信息学分析

如图 2A所示，设计引物成功扩增得到全长为843 bp的DNA片段。对测序结果进行分析，结果显示所得DNA片段共编码280个氨基酸，经SMART结构分析后显示，该蛋白具有典型的DacA蛋白家族结构，即包含2个跨膜区(蓝色区域)和1个DisA_N (DAC)结构域(图 2B)，将其命名为lpDacA。再选取近年来报道的具有代表性的菌属中的c-di-AMP合成酶氨基酸序列与lpDacA进行多重序列比对分析，结果如图 2C所示，lpDacA含有对c-di-AMP合成至关重要的DGA基序(为金属离子结合区域)和RHR基序(为ATP结合区域)^[4]，表明其很可能是功能性的c-di-AMP合成酶。

2.3 lpDacA的体外表达

2.3.1 融合表达载体的构建和鉴定

用特异性引物lpDacA in-F/lpDacA in-R进行PCR扩增，电泳结果表明成功扩增出561 bp的DNA片段(图 3A)。将扩增产物经BamH I/EcoR I酶切后，与原核表达载体pET-28a进行定向连接，构建重组融合表达质粒pET-28a-lpDacA。重组质粒经双酶切后获得与预期一致的条带(图 3B)，经测序鉴定表明重组质粒pET-28a-lpDacA构建成功。

2.3.2 重组蛋白的表达与纯化

如图 4所示，经IPTG诱导后，与对照组相比，重组质粒pET-28a-lpDacA在约25 kD处出现新条带，并与预期表达产物大小相符。同时表达的上清蛋白经纯化、浓缩后也检测到相同大小的片段，因此确定lpDacA_95–280在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了成功表达。采用Bradford方法测定原液蛋白浓度为5.17 mg/mL。

2.4 重组蛋白体外活性检测

经HPLC检测结果显示，重组蛋白lpDacA_95-280在与ATP标准品反应后，在与c-di-AMP标准品相同出峰时间(图 5A)处出现一个产物峰，表明重组蛋白具备合成c-di-AMP的能力。酸碱环境对重组蛋白的体外活性影响结果如图 5B所示，重组蛋白在pH 8.0时表现出较强活性，提示重组蛋白在偏碱性环境中具有较高活性。同时，如图 5C所示，金属离子是重组蛋白在体外发挥活性的必要条件，重组蛋白能够在Mg²⁺、Mn²⁺和Co²⁺存在的条件下发挥作用，且在含有Mg²⁺的缓冲液中相对活性较强，而在含有Ca²⁺、Fe²⁺和Cu²⁺的缓冲液中无活性。

2.5 RHR基序是lpDacA发挥作用的关键基序

通过SOE PCR方法，将合成酶的RHR基序突变为AAA (lpDacA_RHR)，体外活性检测显示，RHR基序突变后，合成酶失去合成活性(图 6A)，表明RHR基序是lpDacA发挥作用的重要基序。此外，ATP结合试验结果显示，将RHR基序突变为AAA后，重组蛋白无法与ATP结合(图 6B)，上述结果表明RHR是合成酶发挥活性的关键基序，并且参与合成酶与ATP的结合。

3 讨论与结论

c-di-AMP是在研究枯草芽孢杆菌DNA完整性监测蛋白的结晶结构时最先发现的^[4]，由两分子的ATP经具有DAC结构域的合成酶催化合成。该信号分子广泛存在于细菌特别是革兰氏阳性菌中，并参与了多种生理功能的调节^[14-17]。本文运用高效液相色谱以及质谱检测对植物乳杆菌细胞提取物进行了分析，结果证实了植物乳杆菌中存在c-di-AMP信号分子，并通过“Diadenylate Cyclase/ c-di-AMP Synthetase”关键词检索出植物乳杆菌中潜在的c-di-AMP合成酶蛋白编码基因，并对其进行克隆表达及体外活性检测。

存在于已有的蛋白质家族结构域数据库(Pfam)中的1 438种生物中，含有1 956个具有DAC功能结构域的蛋白。这些蛋白主要包含于细菌中，特别是在革兰氏阳性硬壁菌中最为常见^[18]。含有DAC功能结构域的蛋白根据其结构域构造不同又分为DisA、CdaS、CdaM和DacA这4类^[4]，对植物乳杆菌的c-di-AMP合成酶lpDacA进行结构分析，结果显示其是典型的含有DAC功能结构域DisA_N以及2个跨膜结构域的DacA类蛋白。通过表达lpDacA蛋白含胞内具有DAC活性结构域部分并进行体外活性检测，结果显示重组蛋白具有c-di-AMP合成活性，提示lpDacA在植物乳杆菌中参与了c-di-AMP的合成。

研究显示，在枯草芽孢杆菌、肺炎分枝杆菌以及结核分枝杆菌的细菌中，c-di-AMP合成酶作用的发挥^{[4, 13]}严格依赖于二价金属离子。同样，我们研究发现，植物乳杆菌c-di-AMP合成酶发挥其活性同样依赖于金属离子的存在，其中合成酶在Mg²⁺存在的条件下活性最强。研究显示，这些离子也是大部分信号分子的代谢蛋白发挥作用的协同因子^[13]。此外，与其他菌种中c-di-AMP合成酶的研究结果一致^{[6, 13, 16]}，lpDacA在偏碱性环境下表现出较强活性，这些结果均提示c-di-AMP合成酶在细胞内发挥作用的环境基本一致。研究表明RHR是c-di-AMP合成酶的关键基序^{[4, 13]}，经同源序列比对分析显示，lpDacA的DAC结构域DisA_N中同样包含了RHR基序。通过点突变方法进行研究，结果显示将lpDacA的RHR基序突变为AAA后，破坏了重组蛋白的体外活性，同时也使其丧失了与ATP的结合能力，表明RHR基序是lpDacA的ATP结合位点，对合成酶作用的发挥起到了关键作用。

总之，目前研究发现c-di-AMP与细菌的抗胁迫能力密切相关^[6-8]，而本研究对植物乳杆菌c-di-AMP及其合成酶的研究，为进一步探索c-di-AMP及其代谢基因在植物乳杆菌中发挥的生物学功能及其与植物乳杆菌的抗胁迫能力之间的关系奠定了基础。