2021, Vol. 48扩展功能
文章信息
- 郭梦捷, 赵箫杨, 韩佳卉, 魏尚竹, 徐秀丽
- GUO Mengjie, ZHAO Xiaoyang, HAN Jiahui, WEI Shangzhu, XU Xiuli
- 厦门杏林湾红树林根际真菌分离及活性分析
- Isolation and activity analysis of fungi from the rhizosphere of mangroves in Xinglin Bay, Xiamen
- 微生物学通报, 2021, 48(5): 1496-1503
- Microbiology China, 2021, 48(5): 1496-1503
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200850
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文章历史
- 收稿日期: 2020-08-21
- 接受日期: 2020-10-25
- 网络首发日期: 2020-01-15
海洋是生命的摇篮，蕴藏着全球80%以上的物种[1]，而且由于海洋环境具有高盐、缺氧、避光、低温、寡营养等特点[2]，能够产生很多有别于陆生微生物的结构新颖、活性独特的天然产物，如萜类、大环内酯类、醌类、生物碱等[3]。海洋生物次级代谢产物与陆地生物相比有着很大的化学多样性，并且结构和生理功能均与陆地生物有很大不同，主要表现在分子骨架的重排、迁移和高度氧化，以及分子结构庞大、复杂与手性原子多等，因此海洋天然产物的特异结构和药理作用是其他化合物无可比拟的[4]。海洋天然产物被认为是天然药物资源宝库，其中海洋微生物、海藻与海洋无脊椎动物是海洋天然活性物质的三大来源[5]。随着陆生生物资源日渐匮乏，从海洋微生物的次级代谢产物中寻找开发有别于陆栖微生物产生的生理活性物质，已经成为当前天然产物研究的一个重要方向[6-7]。
福建沿海位于我国东海和南海交汇地带，其物质与能量信息分别来自东海和南海，具有强潮流，受黑潮及其分支、南海暖流和东海环流等多种不同水系的影响，形成了独具特色的海洋沉积环境[8-10]。红树林生长于陆地与海洋交界带的滩涂浅滩，是陆地向海洋过渡的特殊生态系统，被认为是充满活力的生态圈，可能蕴含着丰富的微生物资源和大量潜在的结构新颖的代谢产物[11-12]。本研究以厦门杏林湾红树林根际海泥和海水为研究对象，探索其可培养海洋真菌的多样性及其抗细菌、抗真菌活性，以期为发现新的药物先导化合物提供菌株资源。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品和活性检测指示菌海泥和海水样品采集于厦门杏林湾，共采集红树林根际周围1个海水样品(HS1)和7个海泥样品(HS2-8)。
抗菌指示菌株为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)、白色念珠菌(Candi da albicans ATCC10231)和大肠杆菌(Escherichia coli ATCC11775)，本实验室保存。
1.1.2 主要试剂和仪器甲醇(分析纯)、二氯甲烷(分析纯)，北京化工厂；甲醇(色谱纯)，天津市康科德科技有限公司；氯霉素，上海阿拉丁试剂有限公司；链霉素，北京博迈德基因技术有限公司。超净工作台，苏州宏瑞科技有限公司；恒温干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；高效液相色谱仪，Agilent Technologies Incorporated公司。
1.1.3 培养基真菌分离纯化选用葡萄糖蛋白胨酵母膏培养基(GPY)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马丁培养基(Martin Medium)和麦芽提取物琼脂培养基(MEA)这4种常用培养基[13]。
真菌发酵选用大米培养基：称取20.00 g大米于250 mL锥形瓶中，加入30 mL蒸馏水浸泡。
1.2 方法 1.2.1 分离纯化将配制好的分离培养基倒于锥形瓶，用封口膜覆盖瓶口，1×105 Pa灭菌20 min，室温下冷却至合适温度(60 ℃左右)，分别加入氯霉素和链霉素至终浓度为200 μg/mL，摇匀，以抑制原核微生物生长，倒平板[14]。将海泥样品置于超净工作台吹干12 h，称取1 g于9 mL无菌水中，再从中取1 mL加入9 mL无菌水，分别取200 μL均匀涂布于GPY、PDA、Martin和MEA培养基；海水样品直接取200 μL均匀涂布于上述4种培养基。
待培养基晾干，放入培养箱中，28 ℃倒置培养，观察并记录真菌的生长情况。待培养基上长出合适大小的菌落后，挑取单菌落接种于PDA培养基[15]，根据采样点以及菌落形态、大小、色泽等的不同逐步分离菌落，并分别接种于PDA培养基，在28 ℃下培养纯化[7, 16]。
1.2.2 真菌发酵及活性分析将配制好的大米培养基装入250 mL锥形瓶，包好封口膜1×105 Pa灭菌20 min，60%甘油管灭菌(1×105 Pa，20 min) 3次。
接种针灭菌并烘干，用接种针切取约1 cm2菌体于60%甘油保存备用，同时切取约1 cm2菌体接于大米培养基进行小试发酵，28 ℃培养30 d，观察菌株生长情况并记录。
固体发酵产物用乙酸乙酯: 甲醇(8:2，体积比)提取，500 W超声20 min。提取液使用孔径11 μm的定性滤纸过滤后(过滤前若混合液分层，弃下层水层)，使用旋转蒸发仪减压浓缩至干燥，加入1 mL甲醇: 二氯甲烷(1:1，体积比)混合溶剂溶解提取物，摇匀后取100 μL于1.5 mL的离心管，剩余加入96孔深孔板，再向圆底烧瓶加入甲醇，洗出提取物，加入离心管和96孔深孔板。
将离心管中提取物配平，13 000 r/min离心3 min，取上清液于高效液相色谱(HPLC，Agilent 1200)样品瓶，用于HPLC分析(进样量10-30 μL)，采用Agilent Eclipse XDB-C8 Column，5 μL，150 mm× 4.6 mm色谱柱[17]，设置进样条件如表 1所示。
| 时间 Time (min) |
乙腈 Acetonitrile (%) |
纯水 Pure water (%) |
三氟乙酸 Trifluoroacetic acid (%) |
流速 Flow rate (mL/min) |
| 0 | 10 | 90 | 0.01 | 1.0 |
| 15 | 100 | 0 | 0.01 | 1.0 |
| 20 | 100 | 0 | 0.01 | 1.0 |
| 21 | 10 | 90 | 0.01 | 1.0 |
| 25 | 10 | 90 | 0.01 | 1.0 |
采用纸片扩散法[15]进行抑菌实验，指示菌株为金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和大肠杆菌。取供试样品20 mg溶解于1 mL甲醇溶液中，配制浓度为20 mg/mL待测样品备用。在无菌50 mL离心管中倒入10 mL LB液体培养基，挑取菌落大小1 mm左右的病原菌混悬于培养基中，37 ℃、200 r/min培养16-18 h，于50 ℃ LB固体培养基加入1%菌液，摇匀倒平板，平板冷凝后置于4 ℃备用。在每个直径为0.6 cm圆形无菌滤纸片上加入5 μL待测样品，空白对照为甲醇溶液，待滤纸片干燥后均匀铺在平板上[15]。将培养基于4 ℃放置2 h后，置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，观察并测量抑菌圈的直径[18]。
1.2.3 rDNA ITS序列鉴定用接种针切取约1 cm2菌体于离心管中，加入800 μL DNA提取试剂，加入一颗细胞破碎珠，将离心管对称置于SCIENTZ-48高通量组织研磨器中，破碎菌体细胞，获得待测菌株基因组DNA。采用真菌通用引物ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3′)和ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA CAAGG-3′)扩增rDNA ITS序列[19-20]。
PCR反应体系[21] (50 μL)：10×Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 5 μL，MgCl2 (2.5 mmol/L) 5 μL，模板DNA 5 μL，引物ITS4和ITS5 (10 μmol/L)各2 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O 25.5 μL。PCR反应条件[21]：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 4 min，72 ℃ 1.5 min，共37个循环；72 ℃ 10 min，25 ℃保存。
采用DNAMAN软件分析PCR产物测序结果，确定rDNA ITS序列范围，除去两端非rDNA ITS序列部分，在NCBI数据库中进行rDNA ITS序列相似性比对。采用MEGA软件分析个体间遗传距离，并通过自展分析做置信度检测，自展数据集为1 000次，基于rDNA ITS之间的同源性，采用邻接法构建系统发育树[22]。
2 结果与讨论 2.1 菌株分离如图 1所示，共分离出71株真菌。其中，从海水样品HS1中分离得到1株真菌，从7个海泥样品中分离到70株真菌。说明海泥中营养相对丰富，有利于真菌生长，提示海洋真菌的分离应选择营养相对丰富的样品进行研究。
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| 图 1 分离出菌株的菌落形态 Figure 1 Morphology of the isolated strains |
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真菌代谢产物抗菌活性实验结果如表 2所示，菌株HS1-PDA-1、HS2-PDA-5、HS2-MEA-8、HS4-Martin-3等49株真菌的发酵产物对S. aureus具有抗性。其中，菌株HS4-GPY-1、HS6-MEA-10、HS8-MEA-2、HS8-MEA-7、HS8-GPY-8、HS8-GPY-10、HS8-GPY-13对S. aureus抗性较强；菌株HS2-GPY-2、HS3-Martin-1、HS4-GPY-1、HS5-Martin-5、HS7-GPY-1、HS8-PDA-5对C. albicans具有抗性，而且后二者抗性较强；菌株HS5-GPY-7、HS6-GPY-7对E. coli具有抗性且前者比后者略强。
| 菌株 Fungal strains |
金黄色葡萄球菌 S.aureus |
白色念珠菌 C.albicans |
大肠杆菌 E.coli |
| HS1-PDA-1 | 0.7 | - | - |
| HS2-GPY-2 | - | 0.8 | - |
| HS2-PDA-5 | 1.0 | - | - |
| HS2-MEA-8 | 0.9 | - | - |
| HS3-Martin-1 | 1.3 | 0.7 | - |
| HS4-GPY-1 | 1.5 | 1.2 | - |
| HS4-Martin-3 | 0.8 | - | - |
| HS5-GPY-1 | 0.8 | - | - |
| HS5-MEA-2 | 0.8 | - | - |
| HS5-MEA-3 | 0.9 | - | - |
| HS5-MEA-4 | 1.3 | - | - |
| HS5-Martin-5 | 1.2 | 0.7 | - |
| HS5-Martin-6 | 0.9 | - | - |
| HS5-GPY-7 | 0.7 | - | 1.1 |
| HS5-GPY-9 | 0.7 | - | - |
| HS5-Martin-10 | 1.0 | - | - |
| HS5-MEA-11 | 0.7 | - | - |
| HS6-GPY-1 | 0.7 | - | - |
| HS6-GPY-2 | 0.8 | - | - |
| HS6-GPY-3 | 0.8 | - | - |
| HS6-GPY-4 | 1.0 | - | - |
| HS6-GPY-6 | 0.8 | - | - |
| HS6-GPY-7 | 0.8 | - | 0.6 |
| HS6-MEA-10 | 1.6 | - | - |
| HS6-GPY-11 | 0.7 | - | - |
| HS6-PDA-13 | 0.7 | - | - |
| HS6-GPY-15 | 1.0 | - | - |
| HS6-GPY-16 | 0.8 | - | - |
| HS7-GPY-1 | 1.3 | 1.5 | - |
| HS7-GPY-3 | 0.8 | - | - |
| HS7-GPY-4 | 1.0 | - | - |
| HS7-GPY-5 | 0.7 | - | - |
| HS7-MEA-7 | 0.7 | - | - |
| HS7-Martin-8 | 0.7 | - | - |
| HS7-Martin-9 | 0.7 | - | - |
| HS7-Martin-10 | 0.7 | - | - |
| HS7-Martin-13 | 0.7 | - | - |
| HS7-GPY-14 | 0.7 | - | - |
| HS8-MEA-2 | 3.0 | - | - |
| HS8-PDA-3 | 0.8 | - | - |
| HS8-PDA-4 | 1.2 | - | - |
| HS8-PDA-5 | 0.8 | 2.2 | - |
| HS8-MEA-6 | 0.8 | - | - |
| HS8-MEA-7 | 2.0 | - | - |
| HS8-GPY-8 | 3.0 | - | - |
| HS8-GPY-10 | 2.7 | - | - |
| HS8-GPY-11 | 0.7 | - | - |
| HS8-GPY-13 | 2.0 | - | - |
| HS8-Martin-16 | 0.9 | - | - |
| HS8-PDA-22 | 0.9 | - | - |
| 注：抑菌圈单位为cm；-：没有产生抑菌圈 Note: The unit of inhibition zone diameter is cm; -: No inhibition zone | |||
对上述真菌的发酵产物进行HPLC分析，检测波长为254 nm，菌株HS5-MEA-4、HS5-GPY-7、HS6-MEA-10和HS6-GPY-15等的活性较好，而且菌株HS5-MEA-4、HS6-MEA-10和HS6-GPY-15的HPLC分析色谱峰非常丰富，HS5-GPY-7色谱峰简单明确，有潜力进行进一步的化合物分离，其HPLC分析结果如图 2所示。
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| 图 2 株真菌HPLC分析结果图 |
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对分离获得的4株真菌HS5-MEA-4、HS5-GPY-7、HS6-MEA-10、HS6-GPY-15的rDNA ITS序列进行PCR扩增并测序。与NCBI数据库中已知菌的rDNA ITS序列进行相似性比对，序列相似性结果如图 3所示。
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| 图 3 4株真菌基于rDNA ITS序列建立的系统发育树 Figure 3 Phylogenetic tree of 4 fungi based on rDNA ITS sequences 注：括号中的序号代表菌株的GenBank登录号；分支点上的数字代表计算1 000次聚类到一起的概率；刻度0.010表示序列偏差值 Note: GenBank accession numbers of aligned sequences are shown in the brackets; The number at the node means the percentage of occurrence in 1 000 bootstrap trees; Bar 0.010 means the nucleotide substitution rate of 0.010 |
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结合菌落形态和rDNA ITS序列分析，将菌株HS5-MEA-4和HS6-MEA-10初步鉴定为土曲霉(Aspergillus terreus)，菌株HS5-GPY-7初步鉴定为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，菌株HS6-GPY-15初步鉴定为Aspergillus templicola。
3 结论在本次实验中首先对厦门杏林湾1个海水样品和7个海泥样品中的可培养真菌进行研究，分离过程中考虑到不同培养基的适用性，采用葡萄糖蛋白胨酵母膏培养基(GPY)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马丁培养基(Martin Medium)、麦芽提取物琼脂培养基(MEA)这4种培养基，共分离出了71株真菌。其中，1株来源于海水，70株来源于海泥，8号样品中分离到12株真菌，真菌多样性最为丰富。真菌代谢产物对病原菌的抗性实验显示，HS1-PDA-1、HS2-PDA-5、HS2-MEA-8、HS4-Martin-3等49株真菌的发酵产物对S. aureus具有抗性；菌株HS2-GPY-2、HS3-Martin-1、HS4-GPY-1、HS5-Martin-5、HS7-GPY-1、HS8-PDA-5对C. albicans具有抗性；菌株HS5-GPY-7、HS6-GPY-7对E. coli具有抗性。利用高效液相色谱对活性较好的发酵产物的化学多样性进行分析，其中HS5-MEA-4、HS6-MEA-10和HS6-GPY-15具有很好的化学多样性。此外，对活性较好且色谱峰较为明确的4株真菌HS5-MEA-4、HS5-GPY-7、HS6-MEA-10、HS6-GPY-15进行分类学鉴定，结合其菌落形态和rDNA ITS序列分析，菌株HS5-MEA-4和HS6-MEA-10初步鉴定为土曲霉(A. terreus)，菌株HS5-GPY-7初步鉴定为棘孢曲霉(A. aculeatus)，菌株HS6-GPY-15鉴定为A. templicola，研究结果为后续研究活性次级代谢产物和发现药物先导化合物提供了菌株资源。
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