微生物学通报  2021, Vol. 48 Issue (5): 1788−1799
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自21世纪以来，中国经济社会快速发展，国民消费水平日益提升，国民体质的健康为更多人所关注。伴随着“一杯奶，强壮一个民族”的口号，牛奶已经成为人们，尤其是青少年日常饮食中不可或缺的重要组成，其安全性自然也会受到越来越多的关注。目前对乳及乳制品中病原微生物流行程度的研究越来越多，如单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)[1]、大肠杆菌(Escherichia coli)[2]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[3]、弯曲杆菌属(Campylobacter)[4-5]、沙门氏菌属(Salmonella)[6-9]、芽孢杆菌属(Bacillus)[10]等。病原微生物不仅损害奶牛的健康，具有致病性还会影响牛奶的品质[11-12]。正常的巴氏杀菌和超高温瞬时灭菌(Ultra-High Temperature Instantaneous Sterilization，UHT)可以杀灭大多数的细菌，但微生物在低温储藏时产生的蛋白水解酶和脂肪水解酶等具有较强的耐热力，影响乳及乳制品的品质。2010年意大利发生“蓝色奶酪”案，是由病原微生物假单胞菌(Pseudomons adaceae)引发的食品污染事件，造成了严重的经济损失[13]。Lan等从中国5个省份的乳腺炎奶牛收集的497个样品中鉴定出92株大肠杆菌，在75个具有eae基因的大肠杆菌菌株中观察到5种内膜素类型(μR-1、λ、ξR/β2、vR-ε2、η)，所有内膜素均首次在牛乳腺炎牛奶中检测到[14]；Yong等研究婴幼儿配方奶粉样品时曾报道，蜡样芽孢杆菌ST-26是B. cereus中重要的序列类型，而且在世界范围内广泛分布[15]。由此可见，乳及乳制品中的微生物不仅致病还会造成巨大的经济损失，乳及乳制品的安全问题值得也必须受到更为广泛的关注。对病原微生物进行溯源，有利于针对性地对卫生管理与操作规范进行加强，预防病原微生物的污染。
结合牛奶生产的整个过程来看，从奶牛繁育、饲料储运和供给，到奶牛场建设与环境、饲养管理、奶牛疫病防治，再到生乳的储运和验收及乳制品加工，包括诸如水源[16]、饲料[17]、牛场卫生条件[18]、奶牛机体[19]、机械加工设备[20-21]等任何因素都会对牛奶的品质产生重大影响。
我们团队一直围绕着奶牛健康、乳及乳制品中的微生物进行了相关的研究，发现由于抗生素的不规范使用，造成病原微生物如大肠杆菌[22]、金黄色葡萄球菌[23]、假单胞菌属[24]、葡萄球菌[25]的耐药现象越来越严重，有必要对这些病原微生物的来源进行追踪，以利于控制奶牛乳房炎发生的几率，进而减少抗生素的使用。然而，传统的溯源技术时间周期长，检测结果的敏感性和准确性也不够高，已经难以解决日益增长的牛奶质量和安全问题。因此，越来越多的学者开始致力溯源技术的改进和创新(如PCR等分子方法，发展至今已经相当成熟)，在生产-销售链中追溯奶及奶制品微生物来源的研究，以最大力度减少公共健康风险。本文对近几年乳及乳制品中病原微生物进行溯源追踪常用的几种溯源技术的研究进展进行综述。
1 光谱技术拉曼光谱(Raman Spectra)是指利用印度科学家C.V.拉曼(Raman)所发现的拉曼散射效应，即当光通过透明介质时被分子散射的光频率发生变化，通过对与入射光频率不同的散射光谱进行分析，以获得分子振动以及转动的相关数据信息，常用于分子结构研究。
生活在不同地区或不同宿主的微生物类群，在自然选择压力下会产生特异的环境适应性，并将这些特性整合到基因组中遗传给后代，从而使这一地区的微生物带有其生存环境的特异性指纹图谱，通过分析这些呈现出多样性的表型或基因型特征，便可以达到溯源的目的。乳及乳制品成分复杂，微生物的检测难度大，需要更加有效和简单的检测技术来鉴定区分病原微生物，以达到溯源的目的。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)噬菌体是导致乳制品行业出现问题的主要噬菌体。Tayyarcan等开发了一种结合拉曼光谱法和化学计量学分析的方法来检测生乳中噬菌体的存在，通过拉曼光谱法可以检测到低浓度的嗜热链球菌噬菌体(102 PFU/mL)，而且分析时间短(60 min)，测定系数(R2)值高，可同时进行校正(0.985)和验证(0.906)校准的均方根误差为70.54，预测的均方根误差为165.47；但是保加利亚乳杆菌噬菌体获得的成功率较低，并且获得的测定系数值不够高(0.649)[26]。该方法可以很好地鉴定出嗜热链球菌，通过比较可能污染源中的嗜热链球菌是否一致来追踪传染源，为受到嗜热链球菌污染的奶制品提供了更快的可追溯性分析。
Xie等将可能含有鼠伤寒沙门氏菌的待检测牛奶添加到含有重水的培养基中进行培养，然后收集培养的鼠伤寒沙门氏菌细胞并进行拉曼光谱扫描，并对获得的原始拉曼光谱进行分析和处理，从而检测出待检测牛奶中的鼠伤寒沙门氏菌，检出限为104-108 CFU/mL[27]。Feng等结合重水(D2O)标记和拉曼光谱测量细菌代谢活性，开发了一种快速灵敏检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的检测方法，检测时间大约4-8 h，回收率高达95.41%-106.6%[28]。该方法具有检测时间短、灵敏度高、成本低、操作简便、实施方便、快捷等优点，是一种快速检测鼠伤寒沙门氏菌的理想方法，具有极好的实际应用前景，非常适合应用于食品安全等领域，也为受到鼠伤寒沙门氏菌污染的奶制品提供了更快的可追溯性分析。
2 质谱技术基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的基本原理是利用基质能够吸收激光能量的特性，通过激光对基质中样品晶体进行照射，使基质与样品间发生电荷转移，样品解吸附，样品分子电离，然后利用电场使样品分子到达检测器，根据其到达检测器的飞行时间差异达到检测的目的。
MALDI-TOF-MS可以非常快速地诊断出固体培养基上分离出的细菌、真菌菌落上的物种，可以直接从阳性血培养瓶或某些样品如尿液中鉴定细菌，还可以用于鉴定复杂食物链中食物破坏者和食源性病原体的属、种、分离株，追踪大量食源性病原微生物[29-31]。但对李斯特菌属的精确区分依然是目前环境和食品安全中的关键问题。Ojima-Kato等开发了一种基于MALDI-TOF-MS的应变解决方案新型软件，构建了一个准确可靠的MS数据库，利用S10-GERMS方法来解决李斯特菌的系谱和种类，即单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)、Listeria ivanovii、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、Listeria rocourtiae的精确区分问题，实现物种或血清型水平微生物的全自动鉴定[32]，为受李斯特菌污染的奶制品提供更快的可追溯性分析。Goldstein等使用MALDI-TOF-MS表征了由在2种培养条件下(琼脂和肉汤)并使用完整细胞法(Intact Cell Method)和蛋白质提取法(Protein Extraction Method，PEM)这2种样品制备方法分离出的5个对甲氧西林不耐药(Methicillin-Sensitive，MSSA)和5个对甲氧西林耐药(Methicillin-Resistant，MRSA)的金黄色葡萄球菌组成的模型系统及对金黄色葡萄球菌谱分析的影响，认为肉汤培养在增加峰数方面进一步改善了光谱质量，PEM促进了峰数和质量范围宽度的增加，提高了在相同培养条件下制备样品的重现性，所有结果表明肉汤/PEM可最大限度地发挥MALDI-TOF-MS表征金黄色葡萄球菌的性能；该方法可以在使用MALDI-TOF-MS系统的实验室广泛应用，以进行除常规指纹识别之外的菌株或血清型水平的微生物分类，为受金黄色葡萄球菌污染的奶制品提供更快的可追溯性分析。该研究将为区分临床和诊断实验室以及食品相关行业中的细菌开辟新的窗口[33]。
MALDI-TOF-MS越来越多地被用作一种可靠的技术来鉴定病原微生物，但该方法也有一定的局限性。Rim等的研究是第一篇仅关注MALDI-TOF-MS与PFGE相比的树状图功能的论文，研究发现MALDI-TOF-MS不能替代PFGE进行鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的克隆性分析[34]。另外，MALDI-TOF-MS对于某些重要的病原微生物无法进行准确的亚分化，Lasch等选择了112株粪肠球菌分离株(CC2、CC5、CC9、CC17、CC22、CC25、CC26、CC92、CC92、CC92)总共52种多位点ST和59种不同的金黄色葡萄球菌对MALDI-TOF MS进行评估，发现MALDI-TOF-MS的鉴别能力并不能够将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和金黄色葡萄球菌分离物亚分化为不同克隆或克隆复合物的水平[35]。Hsueh等选择了147种需氧生长的革兰氏阳性棒状(Gram Negative Rod，GPR)分离菌株，这些菌株均已用常规方法或分子方法或同时通过这2种方法鉴定，进而对MALDI-TOF-MS系统进行评估，结果表明该系统并不能对所有的分离株进行准确的物种级鉴定，需要不断扩展MALDI-TOF-MS数据库以鉴定更多的GPR[36]。
MALDI-TOF/TOF-MS串联质谱仪器的开发，使蛋白质组学方法可用于鉴定菌株特异性生物标志物，多元统计量用于区分分离物的光谱，并使簇与表型相关[37]。该方法将发展成为跟踪和追踪食物变质以及食物致病性菌株和分离株必不可少的工具。
3 分子方法 3.1 PCR技术 3.1.1 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)PCR技术通过人为控制体外合成系统的温度，使体外双链DNA分子变性解旋成为单链结构，通过引物与单链DNA分子的结合形成引物单链DNA复合物，以及利用聚合酶在dNTP存在的条件下使引物沿单链DNA模板延伸形成双链DNA，并重复上述过程以达到指数式扩增DNA分子的需求[38]。
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌等致病菌通常会引发奶牛乳房炎，造成奶牛产量降低和废奶量增加。Liu等从中国北方4个城市的195个奶牛场收集了195份生乳样品，采用培养基分离和PCR鉴定的方法发现54份(27.7%)样品呈葡萄球菌阳性，并分离得到54株金黄色葡萄球菌，其中16株耐甲氧西林葡萄球菌，这些菌株对青霉素G (85.2%)、氨苄青霉素(79.6%)、红霉素(46.3%)有较高耐药性；此外，72%的菌株表现出对一种以上抗菌剂的耐药性；总的来说，63%的青霉素耐药菌株具有blaZ基因，60%的红霉素耐药菌株具有erm(A)、erm(B)、erm(C)、msr(A)或msr(B)基因8种不同的基因模式；对庆大霉素、卡那霉素和奥拉西林耐药的菌株均分别携带aac6'-aph2"、ant(4')-Ia和mecA基因；2株tet(M)阳性分离株携带Tn916-Tn1545转座子特异基因；最主要的毒力基因是sec、sea和pvl，它们分别编码葡萄球菌肠毒素(sec和sea)和杀白细胞介素(Panton-Valentine Leukocidin)；32个分离株(59.2%)具有一个或多个毒力基因；大多数葡萄球菌具有多重耐药性，并携带多种毒力基因，可能对公众健康构成威胁；建议用抗生素特别是青霉素和氨苄青霉素治疗葡萄球菌引起的乳房炎要格外慎重[23]。PCR技术是方法学上的一次革命，大大加速了分子生物学各学科的研究进展。
3.1.2 定量即时聚合酶链锁反应/实时定量PCR (Quantitative Real Time qolymerase Chain Reaction/ Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR/q-PCR)q-PCR利用荧光标记在PCR指数扩增期间，对荧光信号强弱的变化进行连续监测，达到即时测定特异性产物的量的目的。
食品化合物对PCR的抑制作用很高，会经常出现假阴性结果，使受病原微生物污染的乳及乳制品进行可追溯性分析时的难度增加，而q-PCR在检测沙门氏菌时可以避免假阳性。Demirci等从48头奶牛、65头山羊、65头绵羊、53头驴共收集231份奶样品进行研究，采用ISO6579:2002和ISO21567:2004方法、抗菌药敏试验和血清分型之后，通过MALDI-TOF-MS对病原微生物进行物种和亚种区分，5份羊奶样品(2.16%)呈沙门氏菌属阳性，而通过q-PCR检测发现仅2份羊奶样品(0.87%)呈沙门氏菌属阳性，并且所有的牛奶样品均不含沙门氏菌和志贺氏菌属(Shigella genera)[39]。Hernández等开发并测试了q-PCR分析法用于针对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的物种特异性检测，该检测针对磷脂酶C (Phospholipase C，plc)基因并包括内部扩增对照，从而避免假阴性结果的出现，用25 mL人工污染的生乳评估了q-PCR分析的适用性，通过q-PCR检测到300个孢子，检出率为78%，实际定量限为每25 mL牛奶3 000孢子，q-PCR分析结果与标准平板测定的每毫升孢子数之间的对应关系表明，其准确度为83.03%-151.18%，这种q-PCR方法可有效检测和定量牛奶中的产气荚膜梭菌[40]。因不同地区的微生物群在其生存环境中有着特异性的指纹图谱，通过比较污染样品和可能污染源中的产气荚膜梭菌是否一致，可以对受产气荚膜梭菌污染的奶制品进行追踪，达到溯源的目的。
q-PCR可以区分菌株并鉴定单核细胞增生李斯特菌血清型的亚型，但是q-PCR的准确性受引物、模板DNA的质量、抑制剂的存在、样品、引物、探针和酶处理和储存的影响[41]。与常规PCR相比q-PCR具有更强的特异性、自动化程度高等特点，还可以有效解决PCR污染问题，被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。
3.1.3 多重聚合酶链反应(Multiplex PCR，mPCR)mPCR技术用于多种病原微生物的同时检测和某些病原微生物的分型鉴定。其反应原理、反应试剂、操作过程与一般PCR并无不同，其差异在于mPCR技术在同一PCR反应体系里的引物数量n (n≥2)，可同时扩增出多个核酸片段。
Wei等开发了一种mPCR技术用于同时检测培养液和人工食品基质中的这些食源性病原微生物，用病原微生物中的rfbE、nuc和invA基因的特异性DNA序列设计引物，分别用于鉴定大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，扩增得到了不受其他非特异性条带污染的物种特异性条带，该测定方法在培养液中的检测灵敏度为103 CFU/mL，与mPCR在食品样品中的检测限一致[42]，该方法能够准确地鉴定出大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，通过比较可能污染源中的大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌是否一致，就可以达到溯源的目的。这是一种操作简便的检测方法，对微生物流行病学和食品安全性研究具有重要意义。
3.2 基于PCR技术 3.2.1 多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis，MLVA)MLVA在PCR技术的基础上通过对基因组上多个具有多态性串联重复序列位点(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR)重复数的测定达到区分菌株的目的。因其准确、简洁、高效等优点，多应用于流行病溯源分析。
Ung等在法国对2 914人进行了关于沙门氏菌感染问卷调查，并以食物的消费量为依据对不同类别的83个病例采用全基因组测序(Whole Genome Sequencing，WGS)和MLVA方法进行分析，以鉴定微生物群与病例、动物、食物来源之间的联系，发现76%病例(n=63)与食用沙门氏菌污染的生乳奶酪有关[43]。
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属(Brucella)引起的一种人畜共患病，一直被认为是从事畜牧行业的职业病，但现在布鲁氏菌病已经成为了一种传染病，影响所有年龄段人群的健康。Dal等报道了平均年龄为9.14±3.4岁儿童食用未经巴氏消毒的牛奶感染布鲁氏菌病，采用常规PCR方法鉴定了77株布鲁氏菌，通过使用MLVA对菌株进行基因分型，发现儿童布鲁氏菌病主要是由相同来源(Common Sources)引起的，控制动物的活动并避免摄入污染奶制品对阻断儿童布鲁氏菌病的传播很重要[44]。MLVA技术已在全世界布鲁氏菌属的分子流行病学中广泛使用。Ma等从青海的人、畜禽、野生动物中获得了65株布鲁氏菌属分离株，采用MLVA和多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing，MLST)分为B. melitensis (60)、B. abortus (4)、和B. suis (1)共3个种，发现青海地区至少有3种特有的布鲁氏菌，可能是由于青海省独特的地理位置所致[45]。Singh等对印度某地区47个牛场的136个样品采用MLVA进行分析，并与之前使用MLVA研究印度分离株的数据(http://microbesgenotyping.i2bc.paris-saclay.fr/database)进行了比较，从其中6个农场中获得了11株流产双歧杆菌(Bifidobacterium)；在MLVA-16分析中，虽然分离株被归为单个聚类，但得到了5个基因型，每个农场都有一个特定的基因型流行，该研究表明，MLVA-16能够在具有高度遗传相似性地区的分离株之间区分流产双歧杆菌[46]。Ali等通过MLVA-16分型对巴基斯坦不同地区最近流产牛的流产胎儿、牛奶、阴道拭子中收集的样品进行分子分型，再通过常规培养方法和PCR对结果进行证实，发现所有菌株均具有相同的MLVA-16谱图，认为同一基因型的流产双歧杆菌在巴基斯坦不同地区流行是该感染在巴基斯坦传播的主要原因[47]。这些数据将有助于制定巴基斯坦人与牛布鲁氏菌病的预防和控制策略。
3.2.2 多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing，MLST)不同的菌株有着不同的ST，MLST技术便是在此基础上，通过对多个管家基因(Housekeeping Gene) 450 bp左右核心片段的核酸序列进行测序，实现其等位基因多样性的比较。因其操作简便、辨识度高，易于不同实验室进行比较，因此被广泛应用于国际间的菌株比较。
布氏弓形杆菌(Arcobacter butzleri，A. butzleri)是一种能够引起肠道疾病的人畜共患食源性病原微生物。Caruso等对从396个奶牛场中收集的样品处理后采用MLST表征，认为布氏弓形杆菌是牛奶和奶制品中最常见的微生物，与以前的研究一致。通过MLST分析了20个布氏弓形杆菌菌株，确定了81个等位基因和16个ST，证明了MLST的高区分能力极其适用于流行病学调查[48]。Marta等发现在意大利南部从散装牛奶收集的484个样品中，13.2% (n=64)存在杆状杆菌，通过生化鉴定和测序分析出4.1%为布氏弓形杆菌，对布氏弓形杆菌使用MLST鉴定出16种不同的ST，其中14种(占87.5%)以前未报道，由于检测到的多数病原微生物具有遗传多样性，使得在疫病调查中难以确定感染源[49]。
3.2.3 限制性长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)RFLP作为第一代DNA分子标记技术，由人类遗传学家Bostein于1980年首次提出[50]，时至今日仍被广泛应用于遗传图谱构建、生物进化的分类和研究、基因定位等领域。其基本原理为：当DNA发生突变，而且引起其酶切位点的个数发生变化，此时用同一种限制性内切酶切割这些DNA片段会产生长度和数量均不同的限制性酶切片段，将这些片段通过电泳和转膜及变性后，与标记过的探针进行杂交和洗膜，然后分析其多态性。
金黄色葡萄球菌是常见的食源性病原微生物，可导致奶牛患乳房炎。奶牛乳腺炎是导致牛奶被污染的重要原因。Dendani等在法国罗纳-阿尔卑斯地区的牛乳腺炎病牛收集了共22株金黄色葡萄球菌菌株，采用PCR和PCR-RFLP评估凝固酶Coagulase基因(coa)多态性产生了6个分布图，结果表明来自研究区域的奶牛被金黄色葡萄球菌菌株感染，鉴定得到的结果与PFGE相同[50]。基于coa基因的PCR-RFLP的鉴定已被认为是用于牛乳腺炎流行病学研究更简单准确的分型方法，可为金黄色葡萄球菌提供更准确的可追溯性分析。Alni等通过RFLP分析确定奶酪等样品中金黄色葡萄球菌分离株中coa基因的多态性，检测到5个不同的RFLP模式(Ⅰ–Ⅴ)，每组主要存在一种模式类型，他们认为大多数分离株可能具有相同的起源[51]。健康的奶牛才有可能生产出健康的牛奶，金黄色葡萄球菌属于主要的传染性乳腺炎病原微生物，确定金黄色葡萄球菌分离株之间的遗传关系对于这种细菌引起的感染的流行病学监测和控制很重要。
3.2.4 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)AFLP技术通过对基因组DNA进行限制性内切酶酶切，将人工合成的特定的双链接头连在这些片段两端，形成一个带接头的特异片段，用这些特异片段为扩增反应提供模板，通过接头序列和PCR引物3′端选择性碱基的识别，对特异性片段进行选择性扩增，即可完成菌株多态性的分析。
在具有手动和机械挤奶系统的10个奶牛场的挤奶过程中，评估DNA同源性和分离株之间的分布模式，以鉴定假单胞菌属牛奶污染的主要来源。Vidal等分别从手动、机械挤奶系统奶牛场的85、82个采样点分离出167株假单胞菌属菌株，采用AFLP技术将模式分布在不同的农场和季节，不同农场的挤奶系统、不同季节均未观察到显著差异(P > 0.05)，因此认为牛奶中假单胞菌属污染可能与挤奶者的手、奶牛乳头表面、奶杯、设备的污染有关[52]。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是一种广泛用于牛奶发酵过程中的乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)。Lazzi等评估并比较了AFLP和随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)的指纹分辨率，总体数据表明通过AFLP进行的基因型表征可以更好地了解嗜热链球菌的微生物多样性，表明RAPD的区分度低于AFLP[53]。AFLP分析在嗜热链球菌菌株鉴定中的成功应用表明，该技术可用于定义每个特定菌株的全基因组多样性，作为截至目前使用的指纹方法的替代方法。
3.2.5 随机扩增多态性DNARAPD是美国学者Williams和Welsh于1990年首先提出的。RAPD技术是以8-l0 bp的随机寡核苷酸片段作为引物，对基因组进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳(Agarose Gel Electrophoresis)或PAGE电泳检测研究DNA的多态性，已被成功地用于乳制品来源的判别细菌菌株，只需要少量DNA而无需有关DNA序列的信息[54-55]。
奶粉的安全问题关系着婴儿的健康，一直以来都被人们高度关注。Sadiq等评价了25家中国奶粉，根据RAPD图谱将分离出的738株菌株分成30多个组，认为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是最主要的细菌(约占分离菌总数的43%)，其次是嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermophilus，约占21%)，除5个未鉴定组外共鉴定出19种病原微生物，其中有12种以前在奶粉中未被报告过[56]。Yuan等从中国不同农场采集的奶样中分离出480株菌，通过RAPD和16S rRNA基因测序将病原微生物共分为24属74种，其中优势菌属假单胞菌属占所有分离株58.8%，其次是不动杆菌属(Acinetobacter，占13.3%)、黄杆菌(Flavobacterium sp.，占6.0%)、鞘氨醇杆菌(Sphingomonas，占4.2%)，在这些分离菌株中有12.3%的微生物在以前的研究中从未被报道过，表明在生乳中对许多嗜冷菌的研究相当不足，在未来需要进行详细的调查，以确定这些细菌分离物对乳制品质量的影响[57]。RAPD能够对奶粉中的病原微生物进行准确的区分，通过比较污染样品和可能污染源中微生物RAPD图谱的差异就可以确定污染来源，进而达到溯源的目的。
3.2.6 变性梯度凝胶电泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)DGGE的原理是通过在一般聚丙烯酰胺凝胶的基础上加入变性剂(尿素和甲酰胺)，通过控制变性剂浓度，利用不同序列DNA解链区域与解链行为不一致的原理，达到对等长度但序列不同DNA片段的分离。
大多数嗜冷菌具有产生耐热蛋白酶的能力，这些蛋白酶会破坏牛奶和奶制品的质量。为了研究冷藏期间嗜冷菌的种群动态，Xin等将3组牛奶样本(样本A包含北京10个农场的牛奶，样本B包含黑河5个农场的牛奶，样本C包含哈尔滨7个农场的牛奶)在0-5 ℃和5-10 ℃下冷藏，采取PCR-DGGE分析表明储存后样品中主要的嗜冷菌为假单胞菌属，而且细菌群落概况随地理位置和冷藏温度而变化，在其中选择了8种嗜冷菌分离株评估了它们的生长和蛋白水解活性，认为嗜冷菌与牛奶和乳制品的质量有重大关系[58]。
Nalepa等共使用了73个参考菌株，并选择了代表 5个细菌组(发酵细菌、非发酵细菌、粪便细菌、孢子形成细菌和致病细菌)的24个菌株来建立参考标记，用于分析生乳和奶酪样品微生物区系，通过PCR-DGGE方法对生乳和成熟奶酪中的微生物群进行定性评估，在生乳中发现明串珠菌属(Leuconostoc)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、发酵菌[弗氏乳杆菌(Lactobacillus freundii)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、隐球菌属(Cryptococcus)]和非发酵菌[发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)]在奶酪样品中存在较普遍，在MRS、M17和ML培养基上培养的干酪中鉴定出大肠杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌，该研究开发的标记物不需要条带分离、重新扩增、测序或序列鉴定，从而减少了分析时间和成本[59]。该方法能够准确地鉴定出大肠杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌，通过比较与可能污染源的大肠杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌是否一致，就能追踪到传染源，以达到溯源的目的。
4 全基因组测序(Whole Genome Sequencing，WGS)WGS的基本原理是利用超级计算机将分解成2 kb左右小片段的基因组DNA进行随机测序后，与适量的10 kb克隆和细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)克隆的末端测序进行整合序列组装，来完成对某生物体整个序列基因的测序。通过WGS可获得的最佳分型分辨率使得在暴发过程中甚至可以监测暴发菌株中发生的微小遗传变异，从而追踪传播事件。
Parisi等使用WGS方法分析了10株从牛乳样品中分离出的布氏弓形杆菌菌株的遗传多样性、毒力、抗生素耐药性，结果证实了WGS在获得有关这种重要的食源性病原体的相关信息用以检测其毒力、抗生素耐药基因和进行基因分型方面非常有用[60]。Butcher等通过WGS研究发现因饮用生乳造成的5例STEC O157噬菌体感染病人与该牧场粪便样品中的菌株相同，在此次因饮用生乳造成的感染暴发中，WGS的使用提高了病例的确定性，并为与英格兰西南部相关的STEC O157 PT 21/28 stx2a高致病性进化支提供了进一步的见解[61]。郭清艳等从2005-2006年进口奶制品的原料和婴儿配方奶粉产品中分离出49株阪崎肠杆菌，通过第2代测序获得了全基因组序列，将49个分离株鉴定为8种不同的ST，其中ST13 (65.3%，32/49)是最主要的；WGS不仅可以用于MLST分型，还可以用于区分16S rRNA基因序列高度相似的菌株，使病原微生物的分类更准确，为受阪崎肠杆菌污染的奶制品提供更快的可追溯性分析[62]。
尽管WGS在食品工业溯源中的使用越来越多，但截至目前尚无已使用的标准或指南。Portmann等根据稳定性、可重复性、可再现性、歧视能力(Discriminatory Power)、流行病学一致性标准，对单核细胞增生李斯特菌和肠炎沙门氏菌的完整WGS工作流程(分离物的继代培养、DNA提取、测序和生物信息学分析)进行了验证，证明了WGS具有稳定性、可重复性、可再现性、歧视能力、与流行病学的一致性和很高的区分力，同时也证明了WGS适用于追踪单核细胞增生李斯特氏菌和小肠链球菌[63]。遗传数据的透明化、公开化有助于促进和加强各学科之间的交流与合作，也有利于找出更好的方法去更好地溯源。美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)与美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)联合开发了第一个分布式WGS网络，创建了一个可公开获得的包括沙门氏菌在内的数千种食源性致病细菌的基因的全球数据库[64]。随着测序成本的降低，全基因组测序在食品安全上将发挥其巨大的潜力。
5 展望随着经济全球化的深入，食品经济也在以超乎寻常的速度更新换代。然而，多样与便捷就意味着食品安全风险的增加。如今，食品安全越来越受到人们的关注，对食源性疾病原因和来源问责制的需求也日益增加。准确追踪特定致病性微生物在暴发过程中所经过的途径变得越来越重要。与传统的表型分析方法相比，分子分型方法能够更稳定、更持久地为食品中致病性微生物的检测与研究提供可靠帮助。而且，这类技术不囿于传统数据的支撑，可根据微生物的进化过程快速进行技术更新，及时完善DNA序列数据库，为高频跨境危险性微生物风险评估、奶产品病原微生物风险评估以及国家监管机构工作和监管政策制定提供科学依据，也将为双边贸易谈判、国门安全风险预警提供科技支撑，为全体国民的健康提供强有力的保障。
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